專利名稱：代謝控制的工程化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及代謝控制的工程化，更具體地涉及工程化的宿主細胞，其可以增加異源多肽和代謝物的產(chǎn)量，本發(fā)明還涉及在宿主細胞中生產(chǎn)異源多肽和代謝物的方法。
背景技術(shù)：
重組DNA技術(shù)的應(yīng)用使得可工程化宿主細胞，以產(chǎn)生所需的化合物，如多肽和次生代謝物。在工程細胞中大規(guī)模生產(chǎn)多肽使得可生產(chǎn)具有藥學(xué)用途的蛋白質(zhì)和具有工業(yè)用途的酶。次生代謝物是來自自然界的產(chǎn)物，長久以來已知其生物學(xué)和醫(yī)學(xué)重要性。由于這種分子固有的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，傳統(tǒng)的化學(xué)合成通常需要大量人力并使用昂貴的前體和輔因子以制備該化合物。近年來，在細胞中表達異源蛋白已經(jīng)促進在生物中異源生物合成途徑的工程化，以從非昂貴的起始材料生產(chǎn)代謝物。以此方式，已產(chǎn)生了許多化合物，包括聚酮化合物，β-內(nèi)酰胺抗生素，單萜，類固醇，和芳香化合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明部分基于如下發(fā)現(xiàn)，即可通過使用受次生代謝物如乙酰磷酸濃度調(diào)節(jié)的啟動子調(diào)節(jié)多肽(如生物合成酶)的表達，而增加異源多肽和代謝物的產(chǎn)生。術(shù)語“異源”是指多肽或代謝物是通過人為導(dǎo)入的。異源多肽或代謝物可與天然存在的內(nèi)源性物質(zhì)相同。術(shù)語“代謝物”指是一或多個生物化學(xué)反應(yīng)的產(chǎn)物的有機化合物。代謝物其自身可以是其它反應(yīng)的前體。次生代謝物是產(chǎn)生自另一代謝物的代謝物。
因此本發(fā)明一方面涉及一種含有一核酸序列的細菌宿主細胞，該核酸序列包含一個啟動子和一個編碼異源多肽的核酸序列。細菌宿主細胞例如包括大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，鼠傷寒沙門氏菌，根瘤土壤桿菌，嗜熱水生菌，和豌豆根瘤菌細胞。此核酸序列可操縱地與由應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白控制的啟動子連接。換而言之，核酸序列與啟動子的連接方式是使核苷酸序列在體外或體內(nèi)表達?！皢幼印笔侵笇?dǎo)遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)錄的任何DNA片段。啟動子是由應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白控制的，例如大腸桿菌的ntrC，phoB，phoP，ompR，cheY，creB，或torB，或其它細菌菌種的同源物。另外，應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白可以是簇合直向同源組(cluster orthologous group，COG)COG0745的另一成員，其由http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/所定義(Tatusov等，核酸研究(2000)；2833-36)。在一實施方案中，啟動子是與大腸桿菌ntrC結(jié)合的。術(shù)語“ntrC”是指大腸桿菌ntrC蛋白(SWISSPROTP06713，http://www.expasy.ch/)及在其它適當細菌中的同源物。本文所用“結(jié)合”是指平衡結(jié)合常數(shù)(KD)小于100nM，優(yōu)選小于lnM的物理締合作用。一適當?shù)膯幼永缡谴竽c桿菌glnAp2啟動子，如以GenBank登記號No.M10421公布的DNA序列的大約93-323位之間的區(qū)域(Reitzer & Magasanik(1985)美國科學(xué)院院報821979-1983)。此區(qū)域包括glnA基因的未翻譯序列。另外，可在glnA編碼序列和異源多肽的編碼序列之間構(gòu)建一翻譯融合體。
宿主細胞被遺傳修飾從而啟動子由乙酰磷酸在無氮饑餓的情況下調(diào)節(jié)。例如，宿主細胞可通過缺失或突變編碼組氨酸蛋白激酶的基因而遺傳修飾，例如，該組氨酸蛋白激酶是COG0642的成員(如由http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/所述；Tatusov等，如前)，例如glnL，phoR，phoQ，creC，或envZ。在另一實施例中，組氨酸蛋白激酶對控制啟動子的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白有特異性。組氨酸蛋白激酶可由glnL，如大腸桿菌glnL(SWISSPROT P06712，http://www.expasy.ch/)編碼。
盡管宿主細胞被遺傳修飾從而啟動子由乙酰磷酸在無氮饑餓的情況下調(diào)節(jié)，以表達異源多肽或代謝物，但宿主細胞可在任何所需條件下繁殖，例如在氮饑餓條件，氮缺乏條件，或氮富足條件下繁殖。
由此核酸序列編碼的異源多肽可以是產(chǎn)生代謝物所需的生物合成酶，其可以是哺乳動物蛋白，例如分泌的生長因子，單克隆抗體，或胞外基質(zhì)組分。在另一實施例中，異源多肽可以是用于疫苗中的所需抗原，例如來自病毒，細菌，真菌或原生動物病原體的表面蛋白。
本發(fā)明的另一方面涉及一種試劑盒，其含有一種核酸序列，該核酸序列包括由應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白控制的啟動子。此試劑盒還任選的含有已經(jīng)遺傳修飾的細菌宿主細胞，從而啟動子在不存在氮饑餓情況下由乙酰磷酸調(diào)節(jié)。此試劑盒還可提供使用說明。所述核酸序列可含有位于啟動子3’端的限制酶多接頭，這樣插入多接頭的序列與由應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白控制的啟動子可操縱地連接。在該試劑盒的一實施方案中，啟動子是大腸桿菌glnAp2啟動子，細菌宿主細胞是含有g(shù)lnL基因缺失或突變的大腸桿菌細胞。
本發(fā)明另一方面涉及含有第一個表達盒的宿主細胞。第一個表達盒包括啟動子，如上述那些啟動子，以及編碼異源代謝物生物合成所需的酶的核酸序列。本文所用術(shù)語“酶”是指具有催化一個化學(xué)反應(yīng)或多個反應(yīng)的能力的多肽。所述核酸序列可操縱地與啟動子連接，該啟動子在無氮饑餓情況下由乙酰磷酸調(diào)節(jié)。宿主細胞還含有表達代謝物生物合成所需的其它酶的另外的核酸序列。這種另外的核酸序列可以是表達內(nèi)源酶的內(nèi)源序列，或表達異源酶的導(dǎo)入的序列。
在一實施例中，異源代謝物是類異戊二烯，多羥基鏈烷酸酯，聚酮化合物，β-內(nèi)酰胺抗生素，芳香化合物，或其前體，例如上游代謝物，或其衍生物，例如下游代謝物。例如，類異戊二烯可以是類胡蘿卜素，固醇，紫杉醇，二萜，赤霉素，和醌。類異戊二烯的特別例子包括二磷酸異戊酯，二磷酸二甲基烯丙酯，二磷酸香葉酯，二磷酸法呢酯，二磷酸香葉基香葉酯，和八氫番茄紅素。類胡蘿卜素特別例子包括β-胡蘿卜素，ζ-胡蘿卜素，蝦青素，玉米黃質(zhì)，玉米黃質(zhì)-β-葡糖苷，六氫番茄紅素，鏈孢紅素，葉黃素和torulene。當所需的異源代謝物是類異戊二烯時，異源酶可以是異戊烯二磷酸異構(gòu)酶，二磷酸香葉基香葉酯合酶，或1-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶。當所需的異源代謝物是多羥基鏈烷酸酯時，異源酶可以是3-酮酯酰還原酶，或聚-3-羥基鏈烷酸酯聚合醇。
宿主細胞可以是細菌細胞，例如大腸桿菌細胞。此宿主細胞任選地通過缺失或突變一個基因而遺傳修飾，該基因例如是上述編碼組氨酸蛋白激酶的基因。在一特異的實施例中，宿主細胞還含有第二個表達盒，其含有與受乙酰磷酸濃度調(diào)節(jié)的啟動子如glnAp2可操縱連接的編碼烯醇丙酮酸磷酸合酶的核酸序列。
本發(fā)明另一方面涉及一種在宿主細胞中生產(chǎn)異源類異戊二烯的方法。該方法包括過表達烯醇丙酮酸磷酸合酶，和表達異源類異戊二烯合成所需的生物合成酶。在一實施方案中，在宿主細胞中編碼丙酮酸激酶或烯醇丙酮酸磷酸羧化酶的基因經(jīng)遺傳缺失或弱化。在另一實施方案中，編碼烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的基因在宿主細胞中過表達。本發(fā)明的另一方面涉及一種在宿主細胞中生產(chǎn)番茄紅素的方法，此方法包括表達以下異源酶1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶，二磷酸香葉基香葉酯合酶，八氫番茄紅素合酶，和八氫番茄紅素飽和酶。在此方法的一實施方案中，異戊烯二磷酸異構(gòu)酶例如使用glnAp2啟動子而過表達。
本發(fā)明的另一方面涉及一種核酸序列，其含有一個啟動子和編碼產(chǎn)生第一種代謝物所需的生物合成酶的序列。該啟動子可操縱地與該序列連接，并由第二種代謝物調(diào)節(jié)，該第二種代謝物的濃度是生物合成第一種代謝物的前體的可用性的指示。在一實施例中，第二種代謝物是從生物合成第一種代謝物的前體中產(chǎn)生的廢物。
在一實施方案中，第一種代謝物是多羥基鏈烷酸酯，例如多羥基丁酸酯，所述核酸序列編碼生物合成酶，例如3-酮酯酰輔酶A(coA)還原酶，或聚-3-羥基辛酰輔酶A聚合酶。在另一種情況中，第一種代謝物是聚酮化合物，β-內(nèi)酰胺抗生素，或芳香化合物。在另一種情況中，第一種代謝物是類異戊二烯，例如本文提及的類異戊二烯。所述核酸序列可編碼類異戊二烯生成所需的生物合成酶，例如異戊烯二磷酸異構(gòu)酶，二磷酸香葉基香葉酯合酶，1-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶，烯醇丙酮酸磷酸合酶，二磷酸法呢酯合酶，二磷酸香葉基香葉酯合酶，八氫番茄紅素合酶，八氫番茄紅素脫飽和酶，或番茄紅素環(huán)化酶。類異戊二烯的一個前體可以是丙酮酸。丙酮酸濃度與乙酸和乙酰磷酸濃度相關(guān)。因此，在這種情況下，第二種代謝物是乙酰磷酸。對乙酰磷酸的應(yīng)答的啟動子可通過應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白控制，如以上提及的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白。這種啟動子在特異的宿主細胞中可只應(yīng)答乙酰磷酸。在一特定的實施例中，應(yīng)答乙酰磷酸濃度的啟動子與大腸桿菌ntrC結(jié)合，例如大腸桿菌glnAp2啟動子。
啟動子可以由cAMP調(diào)節(jié)。啟動子可以是結(jié)合CAP(分解代謝物激活蛋白)的細菌啟動子。在哺乳動物中，啟動子可以是含有cAMP應(yīng)答元件(CRE)的啟動子，其結(jié)合CREB，CREM，或ATF-1蛋白。在酵母細胞中，啟動子可以是由cAMP調(diào)節(jié)的啟動子，或結(jié)合Gis1，Msn2或Msn4蛋白的啟動子。啟動子的其它可能的調(diào)節(jié)信號可以是果糖-1-磷酸，或果糖-6-磷酸。大腸桿菌FruR蛋白調(diào)節(jié)這種啟動子。
所述核酸序列可包含在質(zhì)粒中，其還可含有一個細菌復(fù)制源點，和一個選擇標記。此序列還可包含酵母或其它真核生物復(fù)制源點，和適當?shù)倪x擇標記，并可整合入基因組中。
在宿主細胞中對生物合成異源化合物的優(yōu)化，依賴于細胞生理學(xué)感應(yīng)參數(shù)，并依賴于利用這些參數(shù)調(diào)節(jié)生物合成。本領(lǐng)域的一種標準方法是培養(yǎng)細胞，使用者外源性加入試劑如誘導(dǎo)物，以激活所需產(chǎn)物的生物合成所需的基因。已廣泛觀測到高水平誘導(dǎo)重組蛋白或途徑導(dǎo)致生長延遲及降低代謝活性。(Kurland和Dong(1996)分子微生物學(xué)211-4)。外源性應(yīng)用誘導(dǎo)物根據(jù)經(jīng)驗進行，并不監(jiān)測細胞中生物合成資源的可用性。相反，天然途徑依賴于反饋機制控制這種過程。在本發(fā)明中一些啟動子與特異的遺傳限定的宿主細胞和異源多肽的組合，令人預(yù)料到地產(chǎn)生高度精確的通用控制線路，其應(yīng)答細胞代謝狀態(tài)而調(diào)節(jié)異源多肽或代謝物合成的通量。實際上，動態(tài)控制的重組途徑使產(chǎn)量增加，生長延遲最小化，并降低副產(chǎn)物形成所產(chǎn)生的毒性。對生理狀態(tài)應(yīng)答而調(diào)節(jié)基因表達也有益于其它應(yīng)用，如基因治療。
本發(fā)明的一或多種實施方案詳見下述。通過以下闡述和權(quán)利要求可清楚本發(fā)明的其它特征，目的和優(yōu)點。
具體實施例方式
本發(fā)明提供了代謝控制工程方法，例如利用特異宿主細胞中的啟動子優(yōu)化蛋白質(zhì)表達以生產(chǎn)蛋白質(zhì)或合成代謝物的方法。
本發(fā)明的中心成分是一表達盒，其包含一個啟動子和編碼希望表達的異源多肽的核酸序列。此表達盒用本領(lǐng)域的標準方法構(gòu)建，從而編碼核酸序列可操縱地與啟動子相連，例如由啟動子調(diào)節(jié)。選擇受細胞生理學(xué)或細胞代謝狀態(tài)參數(shù)調(diào)節(jié)的啟動子。有許多啟動子可以使用。在一些應(yīng)用中，所述表達盒包含于質(zhì)粒中，如具有細菌復(fù)制源點和選擇標記的細菌質(zhì)粒。表達盒可用本領(lǐng)域的標準方法整合入細胞的基因組中。
如果表達盒用于工程異源多肽在晚期對數(shù)生長期或穩(wěn)定期的調(diào)控產(chǎn)生，則可由此選擇啟動子。例如，可選擇應(yīng)答其水平在對數(shù)生長期或穩(wěn)定期積累的小分子信號如第二信使的啟動子。第二信使可以是作為生物化學(xué)途徑的前體，中間體，或廢物而積累的分子。在細菌中，小分子信號可以是糖酵解的中間體，如果糖-1-磷酸或果糖-6-磷酸，或糖酵解的廢物，如乙酸或乙酰磷酸。在真核細胞中，cAMP濃度是熟知的營養(yǎng)狀態(tài)信號。
表達盒中的啟動子可基于大規(guī)模表達分析試驗的結(jié)果選擇，例如基因芯片試驗。由乙酰磷酸誘導(dǎo)的基因可通過與從在乙酸中生長的細胞中制備的微陣列標記cDNA雜交，并將信號與參照信號對比而鑒別，參照信號例如是用從早期對數(shù)生長的細胞中制備的cDNA所得的信號。此試驗可在原核或真核細胞，例如細菌，酵母，植物和哺乳動物細胞中進行。在原核生物中進行的這種試驗例如見Talaat等，(2000)自然生物技術(shù)18679-82和Oh&Liao(2000)生物技術(shù)進展16278-86所述。一旦鑒別出在所需條件下表達的基因，其啟動子可用在表達盒中?；蛘?，可通過外源性加入所需分子(如代謝途徑中的前體)，或通過人工操縱試驗條件(如生長至晚期對數(shù)期，或在生物合成酶過量產(chǎn)生同時仍生長)，進行此試驗。可基于誘導(dǎo)的基因鑒別啟動子。
在一種情況下，使用表達盒在細菌細胞中工程代謝物的調(diào)控產(chǎn)生?？蛇x擇由第二種代謝物調(diào)節(jié)的啟動子，該第二種代謝物的濃度是生物合成第一種代謝物的前體的可用性的指標。例如，如果第一種代謝物是合成自前體丙酮酸和甘油醛-3-磷酸的類異戊二烯，則第二種代謝物可以是乙酰磷酸。在富集環(huán)境中，細胞產(chǎn)生過量的乙酰輔酶A，這是丙酮酸的一種產(chǎn)物。過量的乙酰輔酶A用于產(chǎn)生ATP和乙酸，乙酸作為廢物分泌。乙酸濃度隨細胞密度提高。乙酸，乙酰輔酶A和乙酰磷酸濃度通過以下生物化學(xué)反應(yīng)而相關(guān)(1)(2)因此，高乙酰磷酸濃度表明過量的乙酰輔酶A和過量的丙酮酸。
通過缺失或突變例如glnL而遺傳修飾的宿主細胞，使ntrC功能成為乙酰磷酸依賴性的(Feng等，(1992)細菌學(xué)雜志1746061-6070)。在此方式中，由ntrC調(diào)節(jié)的啟動子，例如glnAp2啟動子，可用于控制對乙酰磷酸應(yīng)答的基因表達。glnAp2啟動子可使用本領(lǐng)域標準方法獲得。例如，可設(shè)計并合成與glnAp2啟動子退火的引物。可使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增含有g(shù)lnAp2啟動子的核酸片段，此片段可用于進一步構(gòu)建過程。類似地，可容易地制備含有組氨酸蛋白激酶基因例如glnL缺失的大腸桿菌菌株。見Link等，(1997)細菌學(xué)雜志1796228-6237詳細闡述了一種可能的方法。編碼所需異源多肽的序列可克隆入glnAp2啟動子的下游，以便其可操縱地與啟動子相連。然后可將具有失活的glnL基因的宿主細胞用此序列轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的菌株，并在生長期間監(jiān)測多肽的產(chǎn)生。在高細胞密度可觀測到強的蛋白質(zhì)表達，如Farmer和Liao(2000)自然生物技術(shù)18533-537所述，其內(nèi)容在此并入?yún)⒖肌?br> 哺乳動物細胞可用作生產(chǎn)多肽或代謝物的宿主細胞?？蛇x擇例如對cAMP應(yīng)答的啟動子。這種啟動子可含有cAMP應(yīng)答元件(CRE)，其結(jié)合CREB，CREM或ATF-1蛋白。使用本領(lǐng)域標準方法，可將所需編碼序列置于啟動子的控制下，并轉(zhuǎn)化入哺乳動物細胞中。在一些情況中，可將此構(gòu)建體插入病毒中，如失活的病毒。這種應(yīng)用使得在基因治療方案中可實現(xiàn)由異源生物合成酶產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或代謝物的調(diào)控產(chǎn)生。植物細胞也可用作宿主細胞。同樣，可選擇適當?shù)膯幼?，例如?yīng)答植物激素，代謝物，或產(chǎn)生所需代謝物的前體的啟動子。啟動子可通過微陣列試驗鑒別。在將所需啟動子與所需編碼序列在適當載體中融合后，可將此構(gòu)建體電穿孔入根瘤農(nóng)桿菌中，然后使用本領(lǐng)域標準方法用于轉(zhuǎn)化植物細胞。在另一實施例中，可操作酵母細胞使之在代謝控制下表達異源多肽或代謝物。例如，釀酒酵母啟動子可以是由cAMP調(diào)節(jié)的啟動子，例如與Gis1，Msn2，或Msn4蛋白結(jié)合的啟動子。應(yīng)答各種代謝條件的所有酵母基因的調(diào)控正在日益增加地充分研究。例如，DeRisi等，(1997)科學(xué)278680-686闡述了在各種代謝條件下，近于全部的根瘤農(nóng)桿菌基因的轉(zhuǎn)錄模式的試驗?？苫谶@些數(shù)據(jù)選擇由所需代謝物調(diào)節(jié)的啟動子。本領(lǐng)域熟知產(chǎn)生酵母質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化酵母的方法。
可使用上述表達方法重建各種代謝途徑。例如，通過構(gòu)建以下基因的表達載體，可將產(chǎn)生番茄紅素的途徑導(dǎo)入大腸桿菌中，所述基因為來自大腸桿菌的dxs(編碼1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶)，來自Archaeoglobus fulgidus的gps(編碼二磷酸香葉基香葉酯(GGPP)合酶)，和來自Erwinia uredovora的crtBI(分別編碼番茄紅素合酶和脫飽和酶)。這些基因可位于單個或多個質(zhì)粒上，或可整合入大腸桿菌染色體中。另外，可使用任何方法過表達烯醇丙酮酸磷酸合酶，例如通過與glnAp2啟動子融合而進行。異戊基二磷酸異構(gòu)酶可使用任何方法過表達，例如通過與glnAp2啟動子融合而進行。
在另一實施例中，可將產(chǎn)生多羥基鏈烷酸酯(PHA)，例如多羥基丁酸酯的途徑導(dǎo)入大腸桿菌中。PHA是一類具有各種熱塑性和商業(yè)用途的羥酸線性聚酯。編碼3-酮酯酰輔酶A還原酶和聚-3-羥基鏈烷酸酯聚合酶的銅綠假單胞菌基因可置于所需啟動子例如glnAp2的調(diào)節(jié)下，因為乙酰輔酶A水平可表明合成PHA的前體的可用性。
不用進一步詳細闡述，確信以上闡述已充分說明了本發(fā)明。以下實施例只是舉例說明本發(fā)明，而無任何限制之意。文中所引用的文獻均以全文并入?yún)⒖肌?br> 方法生長條件將所有大腸桿菌全部生長于含有指定的培養(yǎng)基的搖瓶中，此搖瓶置于37℃水浴搖床(Model G76；New Brunswick Scientific，Edison，NJ)中。將培養(yǎng)物生長于基本培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基由含有0.5％(wt/vol)葡萄糖的M9限定鹽34，或含有1.5％(wt/vol)葡萄糖的YE限定鹽組成。YE限定鹽(每升)由14g K2HPO4，16g KH2PO4，5g(NH4)2SO4，1g MgSO4，和1mg硫胺素組成。在550nm經(jīng)分光光度法監(jiān)測細胞濁度。
代謝物測定用HPLC(Constametric 3500溶劑輸送系統(tǒng)和分光監(jiān)測儀3100可變波長檢測儀；LDC Analytical，Riviera Beach，F(xiàn)L)經(jīng)保持在65℃的有機酸層析柱(Aminex HPX-87H，Bio-Rad實驗室，Hercules，CA)，測定乙酸，丙酮酸和其它有機酸。流動相由0.01NH2SO4組成，流速保持在0.6ml/分鐘。在210nm檢測層析柱峰。用Sigma試劑盒No.315-100測定葡萄糖。為定量番茄紅素，將1ml細菌培養(yǎng)物用丙酮提取，離心，并在474nm測定上清吸光度。通過與標準曲線吸光度對比計算番茄紅素濃度。
SDS-PAGE和酶分析SDS-PAGE方法見于Laemmli(1970)自然227680-685所述。測定β-半乳糖苷酶活性基本如Miller(1992)細菌遺傳學(xué)簡要課程，冷泉港實驗室出版社，冷泉港NY所述。
結(jié)果在大腸桿菌中使用glnAp2啟動子與lacZ的異源融合體乙酰磷酸水平提高可表明過量葡萄糖通量。本發(fā)明特征是宿主細胞，核酸序列，和利用乙酰磷酸作為信號調(diào)節(jié)所需代謝途徑中控速酶的表達，以充分利用過量碳通量并使通量不產(chǎn)生毒性產(chǎn)物，乙酸。
為測試glnAp2作為產(chǎn)物表達的動態(tài)控制物的潛力，構(gòu)建含有可操縱地與glnAp2啟動子連接的異源lacZ基因的核酸序列。含有啟動子和兩個ntrC結(jié)合位點的glnAp2啟動子區(qū)域，通過本領(lǐng)域的標準方法可易于獲得。此glnAp2啟動子經(jīng)PCR從大腸桿菌基因組DNA中擴增出，使用正向引物5’-CAGCTGCAAAGGTCATTGCACCAAC(含有工程PvuII位點)，和反向引物5’-GGTACCAGTACGT-GTTCAGCGGACATAC(含有工程KpnI位點)。這兩個引物擴增公布的DNA序列16(GenBank登記號No.M10421)的93-343位之間的區(qū)域。
將glnAp2 PCR片段也克隆入pRS551的EcoRI位點，因此產(chǎn)生p2GFPuv，其含有在無啟動子的lacZ基因之前的glnAp2。通過同源重組(Simons等，(1987)基因5385-96)，將glnAp2-lacZ區(qū)域轉(zhuǎn)移至λRS45中，產(chǎn)生噬菌體λp2GFPuv。通過用λp2GFPuv噬菌體感染(Silhavy等，(1984)，基因融合試驗，冷泉港實驗室出版社，冷泉港NY)，將glnAp2-lacZ融合體分別整合入BW13711(lacX74)和BW18302(lacX glnL2001；Feng等，如前)的染色體中而構(gòu)建JCL1595和JCL1596。此菌株含有g(shù)lnL2001等位基因，其由glnL編碼序列的23和182密碼子之間的內(nèi)部缺失組成，并預(yù)計產(chǎn)生無效突變(Feng等，如前)。
β-半乳糖苷酶活性的時程是在野生型和glnL突變體中測定的。glnAp2-β-半乳糖苷酶活性以時間依賴型方式增加，這類似于從glnL宿主(JCL1596)中分泌的乙酸濃度，而在等基因的野生型對照(JCL1595)中未發(fā)現(xiàn)啟動子活性被誘導(dǎo)。
表1glnAp2-lacZ的β-半乳糖苷酶活性

因此，在沒有g(shù)lnL的情況下，glnAp2能應(yīng)答由乙酸分泌代表的過量碳通量。隨著細胞接近晚指數(shù)期，生物合成需求降低，細胞開始呈現(xiàn)過量碳通量，這由乙酸的產(chǎn)生增加而表明。在這點上，在大約6小時，令人意外的glnAp2-β-半乳糖苷酶活性開始提高(～700nmol/分鐘/mg蛋白，見表1)，而野生型菌株(JCL1595)中g(shù)lnAp2-β-半乳糖苷酶活性相對較低，并在整個期間保持恒定(～100nmol/分鐘/mg蛋白，見表1)。在10小時以后，在無glnL情況下，glnAp2-β-半乳糖苷酶活性達到～1500nmol/分鐘/mg蛋白，見表1。glnASp2的誘導(dǎo)分布圖也完全與lac啟動子(Plac)的分布圖形成鮮明對照。菌株VJS632(lac+)中染色體Plac活性在用IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導(dǎo)后迅速提高，并在細胞中達到恒定水平表達(～550nmol/分鐘/mg蛋白，見表1)，其不依賴于生長時期。
在大腸桿菌中使用glnAp2啟動子與pps和aroG的異源融合體將兩個不同的代謝酶，烯醇丙酮酸磷酸合酶(pps)和3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸(arabinoheptulosonate)-7-磷酸(DAHP)合酶(aroG)的表達置于glnAp2啟動子的控制下。作為對照，將同樣的這兩個蛋白也用呈靜置對照的tac啟動子(Ptac)，在相同遺傳背景和環(huán)境條件下過表達。表達pps的標準方法導(dǎo)致生長延遲(Patnaik等，細菌學(xué)雜志1747527-7532)。
通過將含有aroGpRW5tkt的PCR片段克隆入pJF118EH的EcoRI-BamHI位點中，構(gòu)建質(zhì)粒pAROG。質(zhì)粒pPS706已由Patnaik等(如前)闡述。這兩個質(zhì)粒表達在Ptac啟動子下的相應(yīng)基因。將含有g(shù)lnAp2啟動子的PCR片段分別克隆入質(zhì)粒pAROG和pPS706的EcoRV-EcoRI位點中，產(chǎn)生含有在glnAp2啟動子控制下的相應(yīng)基因的質(zhì)粒p2AROG3和pPSG706。
用所有4個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌株BW18302(lacXglnL2001)。將具有相應(yīng)質(zhì)粒的菌株培養(yǎng)于M9鹽-葡萄糖培養(yǎng)基中。在5小時后對比生長情況。
表2過表達菌株的生長

如前所述，用Ptac-pps過表達pps導(dǎo)致生長明顯延遲。然而，使用glnAp2意外地產(chǎn)生接近正常的生長(見表2)。在15小時后，從每個菌株中分離蛋白質(zhì)，并在10％SDS-PAGE凝膠上進行分析。當與Ptac啟動子控制的pps基因相對比時，由glnAp2啟動子控制的pps基因有至少多500％的pps蛋白質(zhì)表達。另一令人驚奇的發(fā)現(xiàn)是，利用glnAp2啟動子進行表達與利用Ptac啟動子進行表達相比，在細胞的提取物中AroG蛋白也至少多300％，aroG蛋白的過表達沒有公開的害處。
通過idi過表達在大腸桿菌中生產(chǎn)番茄紅素通過表達來自大腸桿菌的dxs基因(編碼1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶)，來自Archaeoglobus fulgidus的gps基因(編碼二磷酸香葉基香葉酯(GGPP)合酶)，和來自Erwinia uredovora的crtBI基因(分別編碼八氫番茄紅素合酶和脫飽和酶)，在大腸桿菌中重建重組番茄紅素途徑。將這些基因插入低拷貝數(shù)質(zhì)粒pCL1920中形成pCW9，并同時過表達。
使用glnAp2啟動子控制idi(異戊烯二磷酸異構(gòu)酶)的表達。含有idi基因的構(gòu)建體衍生自無啟動子載體pJF118。插入glnAp2啟動子形成p2IDI。作為對照，插入Ptac啟動子形成pTacIDI。將這些質(zhì)粒分別導(dǎo)入含有pCW9的glnL菌株(BW18302)中。含有p2IDI的菌株(glnAp2-idi)在含有葡萄糖的規(guī)定培養(yǎng)基中培養(yǎng)26小時后，產(chǎn)生100mg/L的番茄紅素。與此相反，含有Ptac-idi的菌株在相同條件下，只產(chǎn)生少量的番茄紅素(＜5mg/L)。另外，p2IDI菌株比pTacIDI產(chǎn)生幾乎少3倍的乙酸，這表明為流向乙酸的碳通量已更改為流向番茄紅素。
表3在大腸桿菌分批培養(yǎng)物中番茄紅素形成的碳收率

使用pps增加番茄紅素產(chǎn)量從另一相容質(zhì)粒pPSG18中經(jīng)glnAp2過表達pps，同時用pCL1920表達番茄紅素途徑其余基因(dxs，gps，crtBI)。pps和idi與番茄紅素途徑共表達使番茄紅素的終滴度提高50％，并使產(chǎn)量提高3倍，從0.05mg/ml/小時提高至0.16mg/ml/小時(表3)。這與含有pTacIDI和pPS184的對比菌株(Ptac-idi+Ptac-pps)相反，它們的產(chǎn)量沒有明顯改進，并發(fā)生實際生長抑制。
生產(chǎn)番茄紅素的其它宿主細胞將pykF::cat和pykA::kan等位基因?qū)胍吧途曛?，以產(chǎn)生兩個單突變體菌株(JCL1610(pykF)和JCL1612(pykA))，和一個雙突變體菌株(JCL1613(pykF pykA))(Ponce等，(1995)細菌雜志1775719-5722)。雙突變體菌株能達到終番茄紅素滴度為大約14mg番茄紅素/g干細胞，而每個單突變體菌株所得番茄紅素滴度為大約2.5mg番茄紅素/g干細胞。單pyk突變體產(chǎn)生的番茄紅素水平與野生型菌株相似，大約為4mg番茄紅素/g干細胞。另外，過表達Pck(烯醇丙酮酸磷酸羧激酶)使番茄紅素的終滴度提高大約3倍。過表達Ppc(烯醇丙酮酸磷酸羧化酶)使番茄紅素的產(chǎn)量降低大約30％。
其它實施方案本發(fā)明的許多實施方案已經(jīng)闡述。另外應(yīng)知在不違背本發(fā)明精神和范圍之下，可對本發(fā)明加以各種修改。因此，其它實施方案在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。例如，提及的多肽和基因的所有同源物均在本發(fā)明范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種包含一核酸序列的細菌宿主細胞，該核酸序列包含一個啟動子和一編碼異源多肽的核酸序列；所述核酸序列可操縱地與由應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白控制的啟動子相連；該宿主細胞經(jīng)遺傳修飾從而啟動子在不存在氮饑餓的情況下由乙酰磷酸誘導(dǎo)/激活。
2.權(quán)利要求1的宿主細胞，其中細菌細胞是大腸桿菌細胞。
3.權(quán)利要求1的宿主細胞，其中啟動子由選自ntrC，phoB，phoP，ompR，cheY，creB，和torR的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白控制。
4.權(quán)利要求3的宿主細胞，其中啟動子與ntrC結(jié)合。
5.權(quán)利要求4的宿主細胞，其中啟動子是glnAp2。
6.權(quán)利要求1的宿主細胞，其中宿主細胞是通過缺失或突變編碼組氨酸蛋白激酶的基因而遺傳修飾。
7.權(quán)利要求6的宿主細胞，其中組氨酸蛋白激酶由glnL基因編碼。
8.權(quán)利要求1的宿主細胞，其中異源多肽是代謝物產(chǎn)生所需的生物合成酶。
9.一種在宿主細胞中生產(chǎn)異源類異戊二烯的方法，包括培養(yǎng)包含編碼異源烯醇丙酮酸磷酸合酶的核酸序列的宿主細胞使所述的酶過表達；并在該宿主細胞中表達異源類異戊二烯合成所需的生物合成酶；以及從該宿主細胞中收獲所述異源類異戊二烯。
10.一種在宿主細胞中產(chǎn)生番茄紅素的方法，包括培養(yǎng)包含編碼異源1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶，異源二磷酸香葉基香葉酯合酶，異源八氫番茄紅素合酶，異源八氫番茄紅素脫氫酶的核酸序列的宿主細胞，以及從該宿主細胞中收獲番茄紅素。
11.一種試劑盒，其包含一核酸序列，該核酸序列含有由應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白控制的啟動子，由此該啟動子在規(guī)定的宿主細胞中由乙酰磷酸調(diào)節(jié)；該規(guī)定的宿主細胞通過缺失或突變組氨酸蛋白激酶基因而遺傳修飾。
12.一種核酸序列，其包含啟動子和編碼產(chǎn)生第一種代謝物所需的生物合成酶的序列，該序列可操縱地與由第二種代謝物調(diào)節(jié)的啟動子相連，該第二種代謝物的濃度是生物合成第一種代謝物的前體的可用性的指標。
13.權(quán)利要求12的核酸序列，其中第二種代謝物是從用于生物合成第一種代謝物的前體產(chǎn)生的廢物。
14.權(quán)利要求12的核酸序列，其中第一種代謝物是類異戊二烯。
15.權(quán)利要求14的核酸序列，其中類異戊二烯是類胡蘿卜素。
16.權(quán)利要求15的核酸序列，其中類異戊二烯是番茄紅素，β-胡蘿卜素，蝦青素，或它們的前體之一。
17.權(quán)利要求12的核酸序列，其中第二種代謝物是乙酰磷酸，cAMP，果糖-1-磷酸，或果糖-6-磷酸。
18.權(quán)利要求17的核酸序列，其中第二種代謝物是乙酰磷酸。
19.權(quán)利要求18的核酸序列，其中啟動子是由ntrC，phoB，ompR，cheY，creB，phoP，或torR控制的。
20.權(quán)利要求19的核酸序列，其中啟動子與ntrC結(jié)合。
21.權(quán)利要求20的核酸序列，其中啟動子是glnAp2。
22.權(quán)利要求14的核酸序列，其中生物合成酶是異戊烯二磷酸異構(gòu)酶，二磷酸香葉基香葉酯合酶，1-脫氧木酮糖-5-磷酸合酶，或烯醇丙酮酸磷酸合酶。
23.權(quán)利要求1的宿主細胞，其中所述異源多肽催化產(chǎn)生類異戊二烯的代謝途徑。
24.權(quán)利要求23的宿主細胞，其中所述應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白選自ntrC、phoB、phoP、ompR、cheY、creB和torR，且所述宿主細胞通過缺失或突變編碼組氨酸蛋白激酶的基因而遺傳修飾。
全文摘要
本發(fā)明特征在于在代謝物和代謝通量的調(diào)控下在細胞中生產(chǎn)異源分子的方法，所述方法可增加異源多肽和代謝物的合成。
文檔編號C12P7/02GK1670189SQ20051006595
公開日2005年9月21日 申請日期2000年7月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月27日
發(fā)明者詹姆斯·C.·廖 申請人:食品工業(yè)發(fā)展研究所