專(zhuān)利名稱(chēng)：葡萄炭疽病生物芯片的制取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物芯片技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及用于葡萄炭疽病早期診斷的生物芯片。
背景技術(shù)：
生物芯片技術(shù)是90年代中期以來(lái)影響最深遠(yuǎn)的重大科技進(jìn)展之一，是融微電子學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)為一體的高度交叉的新技術(shù)，具有重大的基礎(chǔ)研究?jī)r(jià)值，又具有明顯的產(chǎn)業(yè)化前景。生物芯片是指采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至組織切片、細(xì)胞等生物樣品有序地固化于支持物的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中靶分子雜交，通過(guò)特定的儀器比如激光共聚焦掃描或電荷偶聯(lián)攝影像機(jī)(CCD)對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測(cè)分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。由于常用玻片/硅片作為固相支持物，且在制備過(guò)程模擬計(jì)算機(jī)芯片的制備技術(shù)，所以稱(chēng)之為生物芯片技術(shù)。
生物芯片可應(yīng)用于基因表達(dá)水平的檢測(cè)、基因診斷、藥物篩選、個(gè)體化醫(yī)療、測(cè)序、生物信息學(xué)研究，目前生物芯片技術(shù)廣泛應(yīng)用于疾病診斷和治療、藥物基因組圖譜、藥物篩選、中藥物種鑒定、農(nóng)作物的優(yōu)育優(yōu)選、司法鑒定、食品衛(wèi)生監(jiān)督、環(huán)境檢測(cè)、國(guó)防等許多領(lǐng)域。它將為人類(lèi)認(rèn)識(shí)生命的起源、遺傳、發(fā)育與進(jìn)化、為人類(lèi)疾病的診斷、治療和防治開(kāi)辟全新的途徑，為生物大分子的全新設(shè)計(jì)和藥物開(kāi)發(fā)中先導(dǎo)化合物的快速篩選和藥物基因組學(xué)研究提供技術(shù)支撐平臺(tái)。
隨著基因芯片技術(shù)的發(fā)展，基因芯片在人類(lèi)醫(yī)學(xué)傳染性疾病和遺傳病診斷上有廣泛應(yīng)用。疾病基因芯片診斷原理是從正常人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交可以得出標(biāo)準(zhǔn)圖譜。從病人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出病變圖譜。通過(guò)比較、分析這兩種圖譜，就可以得出病變的DNA信息。這種基因芯片診斷技術(shù)以其快速、高效、敏感、經(jīng)濟(jì)、平行化、自動(dòng)化等特點(diǎn)，將成為一項(xiàng)現(xiàn)代化診斷新技術(shù)。例如Affymetrix公司，把P53基因全長(zhǎng)序列和已知突變的探針集成在芯片上，制成P53基因芯片，將在癌癥早期診斷中發(fā)揮作用。又如，Heller等構(gòu)建了96個(gè)基因的cDNA微陣，用于檢測(cè)分析風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)相關(guān)的基因，以探討DNA芯片在感染性疾病診斷方面的應(yīng)用?，F(xiàn)在，肝炎病毒檢測(cè)診斷芯片、結(jié)核桿菌耐藥性檢測(cè)芯片、多種惡性腫瘤相關(guān)病毒基因芯片等一系列診斷芯片逐步開(kāi)始進(jìn)入市場(chǎng)。診斷芯片因?yàn)榫哂袑?duì)各類(lèi)致病基因片段檢測(cè)效率高、早期診斷且待測(cè)樣品用量較少、極高的靈敏度、特異性、可靠性以及自動(dòng)化程度高，利于大規(guī)模推廣應(yīng)用等特點(diǎn)，備受關(guān)注。在疾病診斷方面，美國(guó)Affymetrix公司已利用基因芯片進(jìn)行愛(ài)滋病(HIV)的研究工作，并有商業(yè)化的GeneChip HIV PRT診斷芯片上市，用于愛(ài)滋病的早期診斷。
然而，對(duì)葡萄炭疽病基因芯片研究尚未見(jiàn)到。葡萄炭疽病是葡萄生產(chǎn)中危害最為嚴(yán)重的病害之一，每年葡萄炭疽病造成的產(chǎn)量損失極大。由于不能做好前期病害診斷，導(dǎo)致后期大量化學(xué)農(nóng)藥使用，果品污染嚴(yán)重。研制葡萄炭疽病生物芯片對(duì)該病早期診斷與防治，減少化學(xué)農(nóng)藥污染，生產(chǎn)出葡萄無(wú)公害產(chǎn)品非常有意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是針對(duì)上述問(wèn)題，提供一種可準(zhǔn)確地診斷早期葡萄炭疽病的生物芯片。
本發(fā)明采用如下技術(shù)方案首先對(duì)葡萄炭疽病菌進(jìn)行基因序列測(cè)序，然后根據(jù)測(cè)序結(jié)果，利用引物設(shè)計(jì)軟件(Primer Premeier)，測(cè)得葡萄炭疽病菌探針5’-ACGGGGCCGGACCCGAAAGAA-3’，再經(jīng)過(guò)基片處理、芯片點(diǎn)制，封閉即成。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)有檢測(cè)樣品為葡萄炭疽病菌基因片段，可提高檢測(cè)效率；能早期診斷病害，且待測(cè)樣品用量較少；具有極高的靈敏度、特異性和可靠性；自動(dòng)化程度高，利于推廣應(yīng)用，對(duì)該病防治有直接的指導(dǎo)作用，應(yīng)用前景廣闊。


圖1是生物芯片的制備與樣品檢測(cè)流程；圖2是本發(fā)明實(shí)施生物芯片微陣列設(shè)計(jì)圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施生物芯片檢測(cè)葡萄炭疽病菌樣品雜交掃描結(jié)果；圖4是本發(fā)明實(shí)施葡萄炭疽病菌目標(biāo)基因檢測(cè)點(diǎn)的雜交信號(hào)曲線。
具體實(shí)施例方式
1、供試材料菌株葡萄炭疽病菌，PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。
試劑消化液(0.01M Tris·Cl，0.005M EDTA，0.5％SDS，50μg/ml蛋白酶K)，酚，氯仿，異戊醇，蛋白酶K，瓊脂糖，PCR試劑盒(Promega公司)手臂分子氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)(SIGMA)，dNTP(上海生工生物工程公司)，點(diǎn)樣液，洗脫液，雜交液。
儀器設(shè)備PCR擴(kuò)增儀(Biometra Personal PCR system，USA)，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(BIO-RAD MiniII，USA)，低溫離心機(jī)(SIGMA，USA)，生物芯片點(diǎn)樣儀(MG II600，BioRobotics Ltd，England)、激光掃描儀(Gene TACTMLS IV，GenomicSolutions Inc.USA)，數(shù)顯電熱恒溫干燥箱(202-0，上海陽(yáng)光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)2、基因組DNA提取與定量刮取培養(yǎng)基上的葡萄炭疽病菌菌落，置于2ml EP管中，加入消化液1ml，振蕩混合，37℃水浴30min。加入等體積酚—氯仿混合液(酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1)，混勻，16000r/min離心5min，棄有機(jī)相，取上清。重復(fù)酚提取步驟，至兩相間無(wú)蛋白層。加入等體積氯仿，混勻，16000r/min離心5min，棄有機(jī)相，取上清。加入2倍體積-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇，顛倒搖動(dòng)數(shù)次，于-20℃靜置1小時(shí)。16000r/min離心10min，70％乙醇洗滌，常溫干燥。加適量無(wú)菌去離子水溶解DNA，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用紫外分光光度法定量測(cè)定基因組DNA含量。在波長(zhǎng)260nm及280nm處測(cè)定DNA樣品的吸光值，初步估計(jì)DNA樣品的純度。當(dāng)OD260/OD280≥1.8表示純度比較高。否則，表示純度不夠，必須重新抽提。根據(jù)1 OD260相當(dāng)于50μg/ml dsDNA，估計(jì)各樣品濃度，加適量無(wú)菌菌去離子水調(diào)整各樣品濃度至約1μg/μl。
3、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增4、基因芯片的制備與樣品檢測(cè)基因芯片的制備與樣品檢測(cè)按流程進(jìn)行。
5、基片處理和制備取20×20蓋玻片，于鉻酸溶液中浸泡12小時(shí)以上，蒸餾水洗凈，1N NaOH浸泡1小時(shí)，丙酮化3min。浸入手臂分子溶液(2％氨基丙基三乙氧基硅烷，以5％丙酮溶解)10min，丙酮清洗，烘烤固定，5％戊二醛中浸泡過(guò)夜。
6、探針設(shè)計(jì)葡萄炭疽病菌28S rRNA序列為1ACGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTCGTCTTCGTATGCGAGTGT51 TCGGGTGTCAAACCCCTACGCGTAATGAAAGTGAACGCAGGTCAGAGCTT101 C---GGCGCATCATCGACCGATCCTGATGTTCTCGGATGGATTTGAGTAA151 GAGCATACGGGGCCGGACCCGAAAGAAGGTGAACTATGCCTGTGTAGGGT201 GAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGC227
根據(jù)葡萄炭疽病菌樣品的測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)炭疽探針。同時(shí)以無(wú)標(biāo)記引物的互補(bǔ)鏈作為陽(yáng)性對(duì)照，以同等濃度探針緩沖液作為空白對(duì)照，以同等濃度的無(wú)關(guān)探針(指與靶序列無(wú)同源性或同源性很低的寡核苷酸序列)作為陰性對(duì)照。序列如下炭疽探針 5’-ACGGGGCCGGACCCGAAAGAA-3’ (21bases)陽(yáng)性對(duì)照 5’-TGCTGGGCAGAACTTTGTGC-3’ (20bases)陰性對(duì)照 5’-ATGCTTACCGAATCCTTAGC-3’ (20bases)探針及引物合成均在英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。
7、芯片點(diǎn)制將冷凍干燥的探針用0.2M碳酸鹽緩沖液稀釋至100μM。4℃保存?zhèn)溆谩?br> 將制備好的寡核苷酸探針?lè)謩e加入384孔板，使用生物芯片點(diǎn)樣儀，制成預(yù)先設(shè)計(jì)好的微陣列。點(diǎn)樣中注意保持濕度70-80％，點(diǎn)樣后37℃水化過(guò)夜，80℃烤于固定，備用。
8、封閉與核酸雜交取制備好的生物芯片，用前以0.1％SDS洗去多余的未共價(jià)結(jié)合的探針。浸入5％二乙胺(0.01MPB，PH9)，室溫封閉30min，充分洗凈吹干。PCR產(chǎn)物加雜交液(10μl鮭魚(yú)精DNA溶于1ml 10×Denhart液)按1∶1稀釋混勻，取15μl覆蓋于各微陣列，加放經(jīng)疏水處理的蓋片。置入雜交艙中55℃保溫30min。
9、洗滌與檢測(cè)取出雜交芯片，除去蓋片。用預(yù)熱至60℃的洗液(濃度分別為1×SSC/0.1％SDS，0.5×SSC/0.1％SDS，0.1×SSC)進(jìn)行梯度洗滌，各振蕩3min，ddH2O洗凈吹干。激光掃描儀掃描檢測(cè)雜交結(jié)果，用信噪比進(jìn)行結(jié)果判斷。
10、不同菌種檢測(cè)分析采集葡萄炭疽病菌樣品，經(jīng)過(guò)基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增(熒光標(biāo)記)，PCR產(chǎn)物加雜交液(10μl鮭魚(yú)精DNA溶于1ml10×Denhart液)按1∶1稀釋混勻，取15μl覆蓋于各微陣列，加放經(jīng)疏水處理的蓋片。置入雜交艙中55℃保溫30min。洗滌吹干，分別在激光掃描儀掃描檢測(cè)雜交結(jié)果，觀察樣品的敏感性，并用信噪比對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷。
權(quán)利要求
1.葡萄炭疽病生物芯片的制取方法，其特征在于對(duì)葡萄炭疽病菌進(jìn)行基因序列測(cè)序，然后根據(jù)測(cè)序結(jié)果，利用引物設(shè)計(jì)軟件，測(cè)得葡萄炭疽病菌探針5′-ACGGGGCCGGACCCGAAAGAA-3’，再經(jīng)過(guò)基片處理、芯片點(diǎn)制，封閉即成。
全文摘要
葡萄炭疽病生物芯片的制取方法屬于生物芯片技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及用于葡萄炭疽病早期診斷的生物芯片。本發(fā)明就是提供一種可準(zhǔn)確地診斷早期葡萄炭疽病的生物芯片。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案首先對(duì)葡萄炭疽病菌進(jìn)行基因序列測(cè)序，然后根據(jù)測(cè)序結(jié)果，利用引物設(shè)計(jì)軟件(Primer Premeier)，測(cè)得葡萄炭疽病菌探針5′－ACGGGGCCGGACCCGAAAGAA－3'，再經(jīng)過(guò)基片處理、芯片點(diǎn)制，封閉即成。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1978663SQ20051004787
公開(kāi)日2007年6月13日 申請(qǐng)日期2005年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月30日
發(fā)明者趙奎華, 劉長(zhǎng)遠(yuǎn), 趙雨杰, 馬佳明, 傅俊范, 苗則彥, 梁春浩 申請(qǐng)人:遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所