專利名稱：：一種酵母基因工程菌及耐熱耐堿木聚糖酶制劑和應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及的是酵母基因工程菌，特別是一種高效表達(dá)耐熱耐堿木聚糖酶的酵母基因工程菌及耐熱耐堿木聚糖酶制劑和耐熱耐堿木聚糖酶水解制備木寡糖的方法。
背景技術(shù)：
：植物是自然界中主要的可再生有機(jī)資源，其主要成分是纖維素，半纖維素和木質(zhì)素。其中半纖維素約占植物干重的35％，是除纖維素外，自然界中最為豐富的多糖，而半纖維素主要由木聚糖等多糖組成。作為木聚糖降解的主要作用酶，β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶使木聚糖降解為木聚寡糖或者木糖?，F(xiàn)在，木聚糖酶已被用于紙漿制造、生物漂白、禽畜飼料品質(zhì)改進(jìn)等生產(chǎn)實(shí)踐上。在造紙工業(yè)，利用木聚糖酶作為紙漿漂白助劑不僅可以提高紙張的白度和強(qiáng)度，還可以減少氯的用量，從而減輕對(duì)環(huán)境的污染(WongKKY，CRCCrit，Revetal.Biotechnol.1992，12413~435)。在食品工業(yè)，用木聚糖酶水解木聚糖的方法來(lái)生產(chǎn)功能性低聚木糖已成為現(xiàn)實(shí)(尤新.食品工業(yè)科技.2001，61~4)。在飼料行業(yè)，利用木聚糖酶可以改善飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，從而提高飼料的利用率。我國(guó)農(nóng)業(yè)部制定的《允許使用的飼料和飼料添加劑品種目錄》上，將木聚糖酶列入飼料級(jí)酶制劑。然而木聚糖酶在飼料行業(yè)的應(yīng)用面臨產(chǎn)量低、成本高、耐熱性酶難以獲得等問(wèn)題。由于木聚糖在堿性條件下的可溶性最高，故堿性木聚糖酶尤其倍受關(guān)注。同時(shí)，木聚糖酶在應(yīng)用中所進(jìn)行的預(yù)處理過(guò)程通常需高溫條件，因此，熱穩(wěn)定度高的耐高溫木聚糖酶尤顯重要。而且，現(xiàn)有木聚糖酶發(fā)酵產(chǎn)量較低、分離、純化工藝較復(fù)雜已成為目前木聚糖酶規(guī)?；瘧?yīng)用的關(guān)鍵限制因子。因此，尋找或產(chǎn)生高溫、耐堿木聚糖酶，并顯著提高木聚糖酶的酶活性及其在宿主中的分泌表達(dá)水平則成為當(dāng)前木聚糖酶研究中的一個(gè)非常重要的方向。目前，國(guó)內(nèi)有關(guān)科研單位廣泛進(jìn)行了木聚糖酶及其相關(guān)內(nèi)容的研究。如中科院微生物研究所劉偉豐、毛愛軍、祝令香、趙云、董志揚(yáng)等人對(duì)耐堿性木聚糖酶基因在短小芽孢桿菌中高效分泌表達(dá)的研究(見微生物學(xué)報(bào)，Vol.44.August.No.4.2004，487-490)，其酶活性968.108IU/mL，最適反應(yīng)溫度為55℃，在60℃條件下保溫2h酶活力下降90％，該木聚糖酶不耐高溫。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)王海，李里特，石波等人用玉米芯酶法制備低聚木糖的研究，(見食品科學(xué)2002，Vol，23，No.5，81-83)其木聚糖酶酶活性3.6IU/ml，發(fā)酵酶活低，耐熱或耐堿性不夠好。國(guó)外GuptanN等(Cloning，Expression，andSequenceAnalysisoftheGeneEncodingtheAlkali-Stable，ThermostableEndoxylanasefromAlkalophilic，MesophilicBacillussp.StrainNG-27.Appl.Environ.Microbiol，2000，66(6)2631-2635)克隆了一個(gè)耐熱耐堿的木聚糖酶基因，但他們只在大腸桿菌中對(duì)該基因?qū)崿F(xiàn)了表達(dá)，在1000ml搖瓶中測(cè)得的酶活僅為7IU/ml。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是通過(guò)基因工程的手段構(gòu)建能高效表達(dá)耐熱耐堿木聚糖酶的酵母基因工程菌，并從其中培養(yǎng)分離純化制取耐熱耐堿木聚糖酶，從而能高效、經(jīng)濟(jì)的轉(zhuǎn)化制備木寡糖。使用的微生物本發(fā)明涉及的酵母基因工程菌(畢赤酵母菌PichiapastorisGS115/HB705)，它具有高效表達(dá)耐熱耐堿木聚糖酶的特性，該菌株于2005年4月15日在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCCNoM205033(以下簡(jiǎn)稱GS115/HB705)GS115/HB705菌株的菌學(xué)特性a、形態(tài)特征畢赤酵母的無(wú)性生殖為芽殖，有時(shí)有假菌絲。有性生殖產(chǎn)生子囊內(nèi)含有1---4枚光滑圓形、禮帽形或土星子囊孢子。b、生理生化特征畢赤酵母能利用特殊的物質(zhì)為原料生長(zhǎng)，如石油、甲醇、氨態(tài)氮、有機(jī)酸等。GS115/HB705菌株具有畢赤酵母的生理生化特征，同時(shí)因插入了耐熱耐堿木聚糖酶基因，具有高效表達(dá)耐熱耐堿木聚糖酶基因的特性。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的。酵母基因工程菌GS115/HB705(Pichiapastoris)是通過(guò)構(gòu)建環(huán)境基因組文庫(kù)，并從中篩選出一耐熱耐堿木聚糖酶基因，Blast的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因與來(lái)源于Bacillussp.NG-27的木聚糖酶基因AF015445在核苷酸水平具98％同源性，在氨基酸水平具100％同源性。根據(jù)其序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增出上述耐熱耐堿木聚糖酶酶基因，并將此基因插入到畢赤酵母整合表達(dá)載體pHBM905中，然后將得到的含耐熱耐堿木聚糖酶酶基因的表達(dá)載體導(dǎo)入到畢赤酵母中，再?gòu)闹泻Y選出一種高效表達(dá)耐熱耐堿木聚糖酶酶的酵母基因工程菌GS115/HB705菌株。我們所得到的酶的最適反應(yīng)pH為8.5，最適反應(yīng)溫度為70℃，在30℃-85℃范圍內(nèi)仍具60％以上酶活性，尤其在50℃-80℃范圍內(nèi)，仍具80％以上酶活性其在70℃、pH8.5時(shí)的半衰期為30min；而且其pH穩(wěn)定性很高，在pH4.0-10.6范圍內(nèi)仍具80％以上酶活性。利用該基因工程菌產(chǎn)酶純度達(dá)90％以上，易分離純化。具體做法是，根據(jù)篩選到的耐熱耐堿木聚糖酶酶基因序列，應(yīng)用PCR方法用從環(huán)境基因組文庫(kù)中篩選到的陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒DNA為模板，擴(kuò)增出1.2Kb的DNA片段，將其插入到畢赤酵母(Pichiapastoris)整合表達(dá)載體中，再通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到畢赤酵母宿主GS115中，再?gòu)闹泻Y選出高效表達(dá)耐熱耐堿木聚糖酶的酵母基因工程菌。將高效表達(dá)的耐熱耐堿木聚糖酶的酵母基因工程菌GS115/HB705，在以甲醇為碳源的培養(yǎng)基中，溫度24℃---28℃，經(jīng)24---360小時(shí)誘導(dǎo)培養(yǎng)(每隔一定時(shí)間測(cè)酶活，酶活性達(dá)426IU/ml時(shí)停止誘導(dǎo)培養(yǎng))，將完成誘導(dǎo)培養(yǎng)的酵母基因工程菌經(jīng)高速離心除去菌體，收集上清液，即粗酶液，經(jīng)過(guò)濾濃縮即得耐熱耐堿木聚糖酶產(chǎn)品。應(yīng)用上述的耐熱耐堿木聚糖酶粗酶液水解制備木寡糖的方法，其步驟為1)、將抽提于玉米芯的木聚糖制成濃度為10％--20％的玉米芯木聚糖溶液；2)、按每50---100g玉米芯木聚糖對(duì)應(yīng)1ml的粗酶液的比例加酶；3)、上述混合液在60℃---80℃、時(shí)間4--12小時(shí)進(jìn)行水解反應(yīng)；4)、將水解物進(jìn)行離心去殘?jiān)?，取上清液，再?jīng)微濾、超濾、真空干燥即為木寡糖成品。將水解物進(jìn)行離心去殘?jiān)∩锨逡?，再?jīng)微濾、超濾、真空干燥后稱重，計(jì)算收率為20％---40％，進(jìn)行薄層層析或質(zhì)譜鑒定表明2---7糖的木寡糖含量占80％以上。利用本發(fā)明的酵母基因工程菌GS115/HB705制備的耐熱耐堿木聚糖酶酶活性高，耐熱性可達(dá)80℃，耐堿性可達(dá)pH10.6。利用該耐熱耐堿木聚糖酶生產(chǎn)木寡糖純度高，效益好。具體實(shí)施例方式通過(guò)構(gòu)建環(huán)境基因組文庫(kù)，篩選出內(nèi)切β-木聚糖酶基因，經(jīng)過(guò)DNA測(cè)序分析證實(shí)篩選出的基因與來(lái)源于Bacillussp.NG-27的木聚糖酶基因AF015445在核苷酸水平具98％同源性，在氨基酸水平具100％同源性。通過(guò)PCR方法將上述基因插入到畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)載體上，再通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到畢赤酵母宿主GS115中，并對(duì)得到的若干轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定。實(shí)施例1鑒定確證導(dǎo)入了耐熱耐堿木聚糖酶基因的GS115轉(zhuǎn)化子若干(如8-10個(gè))，經(jīng)搖瓶培養(yǎng)，使細(xì)胞密度對(duì)應(yīng)的OD600達(dá)到2.0---6.0；轉(zhuǎn)接到以甲醇作為唯一碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中于24℃---28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)48小時(shí)后，每隔24小時(shí)取樣，對(duì)所取樣進(jìn)行SDS-PAGE進(jìn)行電泳分析。選擇、誘導(dǎo)、培養(yǎng)高效表達(dá)耐熱耐堿木聚糖酶效果的菌株GS115/HB705(GS115+耐熱耐堿木聚糖酶基因)，重復(fù)上述過(guò)程進(jìn)行較大規(guī)模(100----1000ml的裝瓶量)的誘導(dǎo)培養(yǎng)，其間取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析，當(dāng)產(chǎn)酶水平達(dá)36IU/ml以上時(shí)，停止誘導(dǎo)，離心分離菌體，收集含耐熱耐堿木聚糖酶的上清液，即為粗酶液，粗酶液進(jìn)行酶活測(cè)定，酶活性為36IU/ml。實(shí)施例2鑒定確證導(dǎo)入了耐熱耐堿木聚糖酶基因的GS115轉(zhuǎn)化子若干(如8-10個(gè))，經(jīng)搖瓶培養(yǎng)，使細(xì)胞密度對(duì)應(yīng)的OD600達(dá)到2.0---6.0；轉(zhuǎn)接到以甲醇作為唯一碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中于24℃---28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)192小時(shí)，其間前48小時(shí)，每隔12小時(shí)取樣，48小時(shí)后，每隔24小時(shí)取樣，對(duì)所取樣進(jìn)行SDS-PAGE進(jìn)行電泳分析。選擇、誘導(dǎo)、培養(yǎng)高效表達(dá)耐熱耐堿木聚糖酶效果的菌株GS115/HB705(GS115+耐熱耐堿木聚糖酶基因)，重復(fù)上述過(guò)程進(jìn)行較大規(guī)模(100----1000ml的裝瓶量)的誘導(dǎo)培養(yǎng)，其間取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析，當(dāng)產(chǎn)酶水平達(dá)179IU/ml以上時(shí)，停止誘導(dǎo)，離心分離菌體，收集含耐熱耐堿木聚糖酶的上清液，即為粗酶液，粗酶液進(jìn)行酶活測(cè)定，酶活性為179IU/ml。實(shí)施例3鑒定確證導(dǎo)入了耐熱耐堿木聚糖酶基因的GS115轉(zhuǎn)化子若干(如8-10個(gè))，經(jīng)搖瓶培養(yǎng)，使細(xì)胞密度對(duì)應(yīng)的OD600達(dá)到2.0---6.0；轉(zhuǎn)接到以甲醇作為唯一碳源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中于24℃---28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)360小時(shí)，其間前48小時(shí)，每隔12小時(shí)取樣，48小時(shí)后，每隔24小時(shí)取樣，對(duì)所取樣進(jìn)行SDS-PAGE進(jìn)行電泳分析。選擇、誘導(dǎo)、培養(yǎng)高效表達(dá)耐熱耐堿木聚糖酶效果的菌株GS115/HB705(GS115+耐熱耐堿木聚糖酶基因)，重復(fù)上述過(guò)程進(jìn)行較大規(guī)模(100----1000ml的裝瓶量)的誘導(dǎo)培養(yǎng)，其間取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析，當(dāng)產(chǎn)酶水平達(dá)426IU/ml以上時(shí)，停止誘導(dǎo)，離心分離菌體，收集含耐熱耐堿木聚糖酶的上清液，即為粗酶液，粗酶液進(jìn)行酶活測(cè)定，酶活性為426IU/ml。粗酶液水解時(shí)間將100---1000g抽提于玉米芯的木聚糖配制成10％--20％的玉米芯木聚糖溶液，再按50---100g玉米芯木聚糖對(duì)應(yīng)1ml粗液的比例加酶，于60℃---80℃進(jìn)行4---12小時(shí)的水解反應(yīng)。將上述水解物進(jìn)行離心去殘?jiān)?，將上清液依次微濾、超濾、真空干燥后稱重，計(jì)算收率為20---40％，取部分干燥物重新按一定比例溶于蒸餾水中，進(jìn)行薄層層析或質(zhì)譜鑒定表明2---7糖的低聚糖含量大于80％。權(quán)利要求1.一種酵母工程菌(畢赤酵母PichiapastorisGS115/HB705)，保藏號(hào)為CCTCCNoM205033，是通過(guò)建立環(huán)境基因組文庫(kù)的方法及PCR技術(shù)，從中篩選出一耐熱耐堿木聚糖酶基因，其特征在于根據(jù)篩選到的耐熱耐堿木聚糖酶酶基因序列設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用常規(guī)PCR方法用從環(huán)境基因組文庫(kù)中篩選到的陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒DNA為模板，擴(kuò)增出1.2Kb的DNA片段，將其插入到畢赤酵母(Pichiapastoris)整合表達(dá)載體pHBM905中，再通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到畢赤酵母宿主GS115中，再?gòu)闹泻Y選出高效表達(dá)耐熱耐堿木聚糖酶酵母基因工程菌。2.按權(quán)利要求1所述的酵母基因工程菌制備的耐熱耐堿木聚糖酶，其特征在于將高效表達(dá)耐熱耐堿木聚糖酶的酵母基因工程菌，在以甲醇為碳源的培養(yǎng)基中，溫度24℃---28℃，經(jīng)24---360小時(shí)誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間測(cè)酶活，酶活性達(dá)36-426IU/ml時(shí)停止誘導(dǎo)培養(yǎng))，將完成誘導(dǎo)培養(yǎng)的酵母基因工程菌經(jīng)高速離心除去菌體，收集上清液，即粗酶液，經(jīng)過(guò)濾濃縮即得耐熱耐堿木聚糖酶產(chǎn)品。3.按權(quán)利要求2所述的酵母基因工程菌制備的耐熱耐堿木聚糖酶，其特征在于酶的最適反應(yīng)pH為8.5，最適反應(yīng)溫度為70℃，在30℃-85℃范圍內(nèi)仍具60％以上酶活性，尤其在50℃-80℃范圍內(nèi)，仍具80％以上酶活性；其在70℃、pH8.5時(shí)的半衰期為30min，在pH4.0-10.6范圍內(nèi)仍具80％以上酶活性，利用該基因工程菌產(chǎn)酶純度達(dá)90％以上。4.按權(quán)利要求2或3所述的耐熱耐堿木聚糖酶水解制備木寡糖的方法，其特征在于1)、將抽提于玉米芯的木聚糖配制成濃度為10---20％木聚糖的溶液；2)、按每50---100g木聚糖對(duì)應(yīng)1ml的粗酶液比例加酶；3)、上述混合液在60℃---80℃、時(shí)間4--12小時(shí)進(jìn)行水解反應(yīng)；4)、將水解物進(jìn)行離心去殘?jiān)?，取上清液，再?jīng)微濾、超濾、真空干燥即為木寡糖成品。全文摘要本發(fā)明是通過(guò)基因工程的手段構(gòu)建能高效表達(dá)耐熱耐堿木聚糖酶的酵母基因工程菌，并從其中培養(yǎng)分離純化制取耐熱耐堿木聚糖酶，從而能高效、經(jīng)濟(jì)的轉(zhuǎn)化制備木寡糖。利用本發(fā)明的酵母基因工程菌GS115/HB705制備的耐熱耐堿木聚糖酶酶活性可達(dá)426IU/ml，耐熱性可達(dá)80℃，耐堿性可達(dá)pH10.6。利用該耐熱耐堿木聚糖酶生產(chǎn)木寡糖純度高，效益好。文檔編號(hào)C12N1/19GK1693448SQ20051001857公開日2005年11月9日申請(qǐng)日期2005年4月19日優(yōu)先權(quán)日2005年4月19日發(fā)明者屠俊,陳亞蘭申請(qǐng)人:湖北大學(xué)