專利名稱：紫紅紅球菌菌株ncimb 41164及其生產(chǎn)腈水合酶的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物及培養(yǎng)和保藏該微生物的方法。本發(fā)明也涉及一種新的腈水合酶(nitrile hydratase enzyme)及用該腈水合酶將腈轉(zhuǎn)換成酰胺的方法。
通過使用生物催化劑，例如含有酶的微生物，來進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)是眾所周知的。已知腈水合酶催化腈的水合，直接得到相應(yīng)的酰胺。典型的腈水合酶可由許多種不同的微生物生產(chǎn)，例如芽孢桿菌屬(Bacillus)、無芽孢桿菌屬(Bacteridium)、細(xì)球菌屬(Micrococcus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、黃桿菌屬(Xanthobacter)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、根瘤菌屬(Rhizobium)、克雷柏氏菌屬(Klebsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、檸檬酸細(xì)菌屬(Citrobacter)、無色桿菌屬(Achromobacter)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、假諾卡菌屬(Pseudonocardia)和紅球菌屬(Rhodococcus)的微生物。
許多文獻(xiàn)已經(jīng)對在微生物中合成腈水合酶進(jìn)行了描述。Arnaud等人(Agric.Chem.41(11)2183-2191(1977))描述了短桿菌種R312(Brevibacterium sp R312)中被他們稱為“乙腈酶(acetonitrilase)”的特性，該酶將乙腈經(jīng)由酰胺中間體降解為醋酸鹽。Asano等人(Agric.Chem.46(5)(1982))分離了綠針假單胞菌(Pseudomonaschlororaphis)B23，該菌產(chǎn)生的腈水合酶催化丙烯腈轉(zhuǎn)化為丙烯酰胺，生成400g/L的丙烯酰胺。Yamada等人(Agric.Chem.50(11)2859-2865(1986))題為“綠針假單胞菌B23產(chǎn)生腈水合酶的最適培養(yǎng)條件(Optimum culture conditions for production by Pseudomonaschlororaphis B23 of nitrile hydratase)”的文章考慮了菌種生長培養(yǎng)基的最優(yōu)培養(yǎng)基組分，包括以合成腈水合酶為目的加入的誘導(dǎo)物。發(fā)現(xiàn)甲基丙烯酰胺是該生物體的最佳誘導(dǎo)物。在生長開始時的培養(yǎng)就包含甲基丙烯酰胺。
已發(fā)現(xiàn)紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)種的不同菌株很高效的生產(chǎn)腈水合酶。
EP-0307926描述了紫紅紅球菌的培養(yǎng)，具體的是在含有鈷離子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株J1。描述了生物學(xué)上產(chǎn)生酰胺的方法，其中腈由鈷離子存在下培養(yǎng)的紫紅紅球菌所產(chǎn)生的腈水合酶進(jìn)行水合。描述了使用不同的誘導(dǎo)物(包括丁烯酰胺)來合成腈水合酶。在一個實施方案中，存在底物腈的微生物培養(yǎng)基里產(chǎn)生了酰胺。另一個實施方案中，底物腈加入已經(jīng)累積了腈水合酶的培養(yǎng)基中來進(jìn)行水合反應(yīng)。也有分離微生物細(xì)胞并在合適的載體上對其進(jìn)行支持的描述，例如通過固定并隨后用底物接觸。腈水合酶可以用來將腈水合為酰胺，具體說是將3-氰基吡啶轉(zhuǎn)化為煙酰胺。
EP-0362829描述了一種培養(yǎng)紫紅紅球菌種細(xì)菌的方法，該方法包括尿素和鈷離子中至少一種以制備具有腈水合酶活性的紫紅紅球菌。具體描述的是用顯著增強(qiáng)腈水合酶活性的尿素或者尿素衍生物誘導(dǎo)紫紅紅球菌J1的腈水合酶。尿素或其衍生物一次性加入培養(yǎng)基中或連續(xù)加入，用30小時或更長時間，例如120小時培養(yǎng)。
Nagasawa等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.34783-788(1991))題為“產(chǎn)生含鈷離子腈水合酶的紫紅紅球菌J1的最適培養(yǎng)條件(Optimum culture conditions for production of cobalt-containing nitrilehydratase by Rhodococcus rhodochrous J1)”的文章，描述了將J1作為乙腈利用菌株進(jìn)行分離，該菌合成兩種不同的腈水合酶并使用腈酶依賴性培養(yǎng)條件。用脲和脲類似物對一種腈水合酶優(yōu)化誘導(dǎo)。培養(yǎng)過程開始時加入尿素，并且似乎只在基礎(chǔ)培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富時才成為有效的誘導(dǎo)物。逐漸開始誘導(dǎo)酶的生成并增加直至培養(yǎng)5天后到達(dá)最大值。延長培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)活性下降。
紫紅紅球菌J1也被用于商業(yè)上從丙烯腈制造丙烯酰胺單體，這個過程已經(jīng)由Nagasawa和Yamada進(jìn)行了描述(Pure Appl.Chem.671241-1256(1995))。
Leonova等人(Biochem.Biotechnol.88231-241(2000))題為“紅球菌屬的腈水合酶(Nitrile Hydratase of Rhodococcus)”描述了紫紅紅球菌M8的生長及其中腈水合酶的合成。該菌的腈水合酶合成由培養(yǎng)基中的尿素誘導(dǎo)，尿素也被該微生物作為生長的氮源。腈水合酶的高活性也需要鈷離子。這篇文獻(xiàn)大體上著眼于誘導(dǎo)和代謝效應(yīng)。
Leonova等人(Appl.Biochem.Biotechnol.88231-241(2000))也陳述了俄國將紫紅紅球菌M8用于商業(yè)生產(chǎn)丙烯酰胺。俄國專利1731814描述了紫紅紅球菌M8。
不需要誘導(dǎo)物如尿素就產(chǎn)生腈水合酶的紫紅紅球菌M33在USA5827699中有描述。該微生物菌株是紫紅紅球菌M8的衍生菌。
通過生物催化途徑有望獲得丙烯酰胺單體的生成。Yamada和Kobayashi發(fā)表的題為“腈水合酶及其丙烯酰胺工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用(NitrileHydratase and its Application to Industrial Production of Acrylamide)”綜述(Biosci.Biotech.Biochem.60(9)1391-1400(1996))中，詳細(xì)說明了生物催化途徑生成丙烯酰胺的發(fā)展。詳細(xì)描述了三種一種比一種好的催化劑及其丙烯酰胺生成的特性，尤其是第三代催化劑紫紅紅球菌J1。
運(yùn)用生物催化劑的主要缺點是在保存、運(yùn)輸和使用濕細(xì)菌材料時普遍缺少對穩(wěn)定性的觀測。即使相對穩(wěn)定的酶和細(xì)菌如紅球菌細(xì)胞內(nèi)的腈水合酶，使用前就腐敗的可能性導(dǎo)致工業(yè)中公認(rèn)需要用某種方法處理生物催化劑細(xì)胞懸液，例如通過冷凍或冷凍干燥液相混合物，或者可選擇的固定細(xì)胞于一些聚合物基質(zhì)。為了達(dá)到生物催化劑的最高生產(chǎn)能力，在使用前的制備和保存時保持其最大生物催化活性是很重要的。Chaplin和Bucke(1990)在劍橋大學(xué)出版社(Cambridge University Press)出版的酶工藝學(xué)(Enzyme Technology)47頁(酶制劑及使用(Enzyme preparation and use))中，指出熱、蛋白水解、非最適pH(sub optimal pH)、氧化變性劑及不可逆抑制劑可使酶失活。許多物質(zhì)可使酶對催化反應(yīng)的能力降低。包括非特異蛋白變性劑的物質(zhì)如尿素。
Wageningen大學(xué)的Willem JH van Berkel的文章“蛋白穩(wěn)定性(Protein Stability)”中，考慮了可導(dǎo)致失活或解折疊的因素，包括蛋白酶、由于氧氣或氧自由基存在的氧化和引起可逆解折疊的變性劑如尿素。
Chaplin和Bucke(1990)在劍橋大學(xué)出版社出版的酶工藝學(xué)73頁(酶制劑及使用)中揭示了關(guān)于保存酶活性的關(guān)鍵因素包括維持酶結(jié)構(gòu)的構(gòu)象。因此認(rèn)為防止解折疊、聚集和共價結(jié)構(gòu)改變是很重要的?？紤]三個途徑(1)使用添加劑；(2)共價修飾的控制使用；(3)酶的固定化來達(dá)到這一目的。
EP-B-0243967描述了通過向酶的溶液或混懸液或酶的固定化形態(tài)中添加選自腈、酰胺和有機(jī)酸及其鹽類的穩(wěn)定化合物來保存腈水解酶的腈水合活性。本說明書中清晰說明雖然能產(chǎn)生將腈如丙稀腈水合產(chǎn)生相應(yīng)的酰胺例如丙烯酰胺的腈水合酶溶液或微生物混懸液可短期保存于室溫，但是優(yōu)選低溫保存尤其是0℃左右的溫度。EP-A-0707061中描述了在包含微生物細(xì)胞的混懸液或固定化微生物細(xì)胞的水性培養(yǎng)基中，添加濃度在100mM到無機(jī)鹽飽和濃度之間的無機(jī)鹽，使細(xì)胞和酶的活性保持時間延長。描述的該技術(shù)用來保存具有腈水合酶或腈水解酶活性的微生物細(xì)胞。US-B-638804中描述了向固定化或者具有腈水合酶活性的微生物細(xì)胞水溶液中添加碳酸氫鹽或碳酸鹽。在將酶固定于基質(zhì)上前，固定作用常常包括從完整細(xì)胞中移出酶。不過，雖然這種固定作用對酶提供了很好的保護(hù)，單從完整細(xì)胞中提取酶是個很復(fù)雜的步驟，這個步驟費(fèi)時、昂貴還可導(dǎo)致酶的損失。此外可固定整個微生物細(xì)胞。US-A-5567608提供了一個將整個細(xì)胞生物催化劑固定于陽離子共聚物的方法，該方法具有良好的保存穩(wěn)定性并避免了腐敗。
固定工業(yè)上用于制造丙烯酰胺單體的紫紅紅球菌J1使得(a)便于運(yùn)輸及(b)提高所用生物催化劑的存活力。在US-A-5567608中本發(fā)明人指出工業(yè)規(guī)模的應(yīng)用通常將生物催化劑固定化，使生物催化劑易于從反應(yīng)產(chǎn)物中分離，避免生物催化劑中的雜質(zhì)被洗脫到產(chǎn)物中并且利于連續(xù)處理和生物催化劑的回收再用。
不過，固定化是一個額外的處理步驟，需要額外的移植步驟并可能使用一定數(shù)量的其他原料例如藻酸鹽、角叉菜聚糖、丙烯酰胺及其他丙烯酸酯單體和乙烯醇。因此，這是一個昂貴的處理步驟。
已經(jīng)提出各種使酶失活的有害作用減至最低的其他方法，試圖在化學(xué)反應(yīng)過程中減少負(fù)面影響。
為了長時間保存酶的活性冷凍干燥生物催化劑是眾所周知的。這可能又是一個昂貴的處理步驟，通常是小規(guī)模制備生物催化劑才使用。液氮或液氮?dú)庀嘀猩畹蜏乇２匾材荛L時間保存微生物細(xì)胞但是需要不斷供應(yīng)液氮。冷凍復(fù)蘇的生物量或酶的半純品或純品于-18℃以下也是眾所周知的用來長時間保護(hù)生物催化劑活性的方法。
此外，一旦將細(xì)胞群加入反應(yīng)器且反應(yīng)正在發(fā)生，則將效率損失減至最低是操作效率和方法經(jīng)濟(jì)性的關(guān)鍵。另一方面，將微生物細(xì)胞固定于一些聚合物基質(zhì)是優(yōu)化這些方法參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)程序。
因此需要提供一個方法及生物催化劑來克服這些缺點。
依據(jù)本發(fā)明我們提供了一種微生物即紫紅紅球菌NCIMB 41164菌株或其突變體。
這個新的微生物被發(fā)現(xiàn)易于生產(chǎn)腈水合酶。我們發(fā)現(xiàn)這種新的微生物(及由此產(chǎn)生的腈水合酶)可以用于腈轉(zhuǎn)變?yōu)轷０返倪^程。紫紅紅球菌NCIMB 41164特別有利于將(甲基)丙烯腈轉(zhuǎn)變?yōu)?甲基)丙烯酰胺。持續(xù)長時間后，發(fā)現(xiàn)該微生物及酶保持活性并在某些情況下活性增高，而且在制備重量比50％以上的丙烯酰胺后還可從反應(yīng)混合物中回收而活性不減。因此如果需要，它可以直接或再保存一段時間后再使用。
以下是新菌株紫紅紅球菌NCIMB 41164的詳細(xì)內(nèi)容1.起源和保藏紫紅紅球菌株由我們從英國Bradford的土壤中分離的，并在布達(dá)佩斯條約下于2003年3月5日保藏于國立工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司(National Collection of Industrial and Marine Bacteria)，分配的檢索號為NCIMB 41164。
2.微生物的分類鑒定用16S rDNA分析技術(shù)進(jìn)行土壤分離體的鑒定。將土壤分離體的16S rDNA基因序列與核酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。獲得的序列與專利數(shù)據(jù)庫(proprietary database)(MicroseqTM)中找到的進(jìn)行比較并確定了前20個符合樣。用這個數(shù)據(jù)庫比對序列，鑒定出與紫紅紅球菌最匹配有97.48％的相似性。這是屬水平的匹配，但最可能是紫紅紅球菌的一個菌株。進(jìn)一步搜索公開的EMBL數(shù)據(jù)庫鑒定出與該數(shù)據(jù)庫的紫紅紅球菌最匹配，有99.698％的相似性。
3.形態(tài)學(xué)與培養(yǎng)特征(1)多形態(tài)生長(2)運(yùn)動性不能游動(3)無芽孢前體(4)革蘭氏陽性(5)好氧(6)在營養(yǎng)瓊脂上30℃生長48小時產(chǎn)生淡紅色圓形菌落。
4.培養(yǎng)及腈水合酶的合成本發(fā)明的紫紅紅球菌NCIMB 41164可在任何與本發(fā)明目的適合的條件下根據(jù)已知方法培養(yǎng)，如前面提到的先有技術(shù)所描述。優(yōu)選在包含尿素或尿素衍生物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物。我們發(fā)現(xiàn)該微生物可在含有乙腈或丙烯腈作為腈水合酶誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基上生長。在尿素或尿素衍生物作為誘導(dǎo)物和氯化鈷作為鈷離子來源存在時，得到非常高的腈水合酶活性。例如在實驗實例中描述的將尿素和鈷離子加入培養(yǎng)基。
紫紅紅球菌NCIMB 41164有望培養(yǎng)出高酶活，例如15℃時約250-300,000μmol min-1/g干生物量。如果尿素或尿素衍生物存在于培養(yǎng)基中可得到高的腈水合酶活性。它可在培養(yǎng)的一開始就存在或者在生長期間某點加入，但是一般應(yīng)該在生長平穩(wěn)期開始前加入。如果尿素或尿素衍生物在微生物生長開始的培養(yǎng)基中沒有以相當(dāng)大的量存在而是隨后引進(jìn)的則更易達(dá)到高腈水合酶活性。借此我們的意思是尿素或尿素衍生物不存在或存在的量少于0.2g/L，優(yōu)選少于0.1g/L。更優(yōu)選培養(yǎng)基在微生物生長的至少最開始6個小時基本上無尿素或尿素衍生物(即少于0.2g/L)。如果微生物的生長培養(yǎng)基在加入尿素或尿素衍生物前至少12個小時并在某些情況下至少24小時基本上無尿素或尿素衍生物而微生物在尿素或尿素衍生物缺失時的生長速率更高尤其優(yōu)選，但是在微生物培養(yǎng)48小時前加入。我們已發(fā)現(xiàn)這比在培養(yǎng)開始就加入尿素或尿素衍生物能在較短時間內(nèi)出現(xiàn)更高腈水合酶活性。
本發(fā)明也涉及一種從微生物紫紅紅球菌NCIMB 41164或其突變體獲得的腈水合酶。
本發(fā)明的另一個方面是關(guān)于從相應(yīng)腈制備酰胺的方法，其中腈于存在生物催化劑的水性培養(yǎng)基中發(fā)生水合反應(yīng)，生物催化劑選自紫紅紅球菌NCIMB 41164、其突變體的微生物和得自紫紅紅球菌NCIMB 41164或其突變體的腈水合酶。因此術(shù)語“生物催化劑”是指在紫紅紅球菌NCIMB 41164細(xì)胞中合成的腈水合酶并可包括紫紅紅球菌NCIMB 41164細(xì)胞本身。因此，生物催化劑可用作在發(fā)酵培養(yǎng)基中制備的整個細(xì)胞、水混懸液、作為固定化細(xì)胞制品、作為回收細(xì)胞糊狀物(paste)或適合于滿足本發(fā)明需求的將腈轉(zhuǎn)變?yōu)轷０返娜魏纹渌问诫嫠厦浮?br> 該方法特別適合于從相應(yīng)腈迅速制備酰胺。特別是可制備高濃度酰胺的水溶液。該方法特別適合于制備丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺。
生物催化劑可作為整個細(xì)胞催化劑用于從腈產(chǎn)生酰胺。可將其固定例如包埋入凝膠或優(yōu)選作為游離細(xì)胞懸液使用。可選擇地，可提取腈水合酶并例如直接用于制備酰胺的過程。
實施該方法的一個最佳方案中生物催化劑被引入適合進(jìn)行微生物培養(yǎng)的水性培養(yǎng)基?？尚纬傻湫偷纳锎呋瘎乙?，例如微生物的整個細(xì)胞。腈，例如丙烯腈或甲基丙烯腈以水性培養(yǎng)基中維持高達(dá)6％重量比的濃度加入含有生物催化劑的水性培養(yǎng)基中。更優(yōu)選將腈例如丙烯腈或甲基丙烯腈加入反應(yīng)介質(zhì)中并且反應(yīng)可持續(xù)直到酰胺的濃度，例如丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺的濃度達(dá)到所需水平，尤其是重量比介于30％和55％之間。最優(yōu)選重量比在50％左右。
該紫紅紅球菌新菌株(NCIMB 41164)能產(chǎn)生高濃度的丙烯酰胺(例如50％丙烯酰胺)水溶液。有望利用分批補(bǔ)料型反應(yīng)器，將發(fā)酵液形式或作為收獲生物量的生物催化劑(紫紅紅球菌NCIMB 41164)加入，以游離細(xì)胞方法完成反應(yīng)。
生物催化劑(紫紅紅球菌NCIMB 41164)的活性及由此產(chǎn)生的腈水合酶是可以再循環(huán)和再用于將更多的腈水合為相應(yīng)的酰胺的腈水合酶。
生物催化劑的再循環(huán)特別適合將(甲基)丙烯腈轉(zhuǎn)化為(甲基)丙烯酰胺的情況。因此在制造丙烯酰胺中當(dāng)反應(yīng)過程結(jié)束且已經(jīng)生產(chǎn)了適當(dāng)濃度的丙烯酰胺時，催化劑可被移出并再用于生產(chǎn)另一批丙烯酰胺而無腈水合酶活性損失。這甚至可在生物催化劑再使用前于水中保存數(shù)天(例如三天)后實現(xiàn)。甚至在更長時間保存后還可能制備第三批丙烯酰胺。
依據(jù)本發(fā)明的一方面我們提供了一種含有紫紅紅球菌NCIMB41164菌株本身或來自其的或其突變體的生物催化劑的水性組合物且其中生物催化劑是非活躍生長中的游離微生物細(xì)胞的形式。我們也提供了一種保存生物催化劑即非活躍生長中的游離微生物細(xì)胞的方法。
用來實現(xiàn)將腈轉(zhuǎn)化為酰胺的生物催化劑的微生物細(xì)胞，可被視為非活躍生長培養(yǎng)物。借此我們是指維持微生物的培養(yǎng)基和保存條件不可期望是促進(jìn)生長的。保存培養(yǎng)基可以是例如可從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收的紫紅紅球菌NCIMB 41164細(xì)胞?；蛘呒?xì)胞可直接用于發(fā)酵培養(yǎng)基，或可在適合的懸浮介質(zhì)作為水混合液存在，例如水、生理鹽水溶液；適合的緩沖溶液例如磷酸鹽緩沖液或任何其他相似緩沖液或生長培養(yǎng)基，微生物細(xì)胞在其中的代謝基本為零，這由測量生長速率、或生物量濃度或耗氧或營養(yǎng)成分消耗來確定，或通過通常用于監(jiān)測微生物生長和代謝的其他測量形式來確定。
所述組合物或保存培養(yǎng)基可包含發(fā)酵液的任何殘留成分。發(fā)酵液可包括任何一種用來培養(yǎng)微生物的典型成分，還可包括由微生物產(chǎn)生的產(chǎn)物和副產(chǎn)物。發(fā)酵液的典型組分包括糖、多糖、蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、氮源、無機(jī)鹽、維生素、生長調(diào)節(jié)劑和酶誘導(dǎo)劑。具體的可包括單糖或雙糖作為糖；銨鹽或其他氮源；無機(jī)鹽例如磷酸鹽、硫酸鹽、鎂、鈣、鈉和鉀鹽；金屬化合物；維生素；及復(fù)合發(fā)酵培養(yǎng)基組分，例如用于特定微生物生長需求的玉米漿、蛋白胨、酵母提取液、有機(jī)或無機(jī)化合物；特殊的酶誘導(dǎo)物(例如用來誘導(dǎo)紫紅紅球菌NCIMB 41164的腈水合酶的尿素)；及有機(jī)酸例如檸檬酸鹽或丙酮酸鹽；和任何需要確保紫紅紅球菌NCIMB 41164成功生長的其他有機(jī)或無機(jī)化合物。
通常當(dāng)一種生物催化劑，例如生產(chǎn)腈水合酶的生物催化劑，沒有持續(xù)生長而保存了一段時間，甚至是幾天，從發(fā)酵液中去除微生物細(xì)胞是正常的，不論是否需要細(xì)胞作為催化劑，或酶是否從細(xì)胞或發(fā)酵培養(yǎng)基中回收。這是為了防止微生物在發(fā)酵液中生長導(dǎo)致發(fā)酵液的腐敗并減少可導(dǎo)致所需酶分解的蛋白酶活性。因此保護(hù)發(fā)酵液本身或去除細(xì)胞來防止生物催化劑經(jīng)外來的生物活性如微生物污染而降解是正常的。并且如果沒有實施上述步驟，通常預(yù)期生物催化劑活性在一段很短時間內(nèi)例如一天內(nèi)減少，并且肯定少于兩天。
在生物催化劑保存期間甚至長達(dá)一周的時間內(nèi)，保留活性的方法通常包括從發(fā)酵液中去除生物催化劑和/或生物催化劑固定于合適的基質(zhì)和/或用穩(wěn)定物穩(wěn)定，穩(wěn)定物要么成為反應(yīng)混合物的污染物且這可能會是下游的難題要么需要一個額外的處理步驟在其作為生物催化劑使用前從微生物細(xì)胞懸液中去除穩(wěn)定化合物或添加物。
缺乏這種保存處理，通常保持在環(huán)境溫度中的生物催化劑趨于損失活性，不再有效催化或甚至不再適合催化反應(yīng)。
用作生物催化劑的微生物生長可在幾天時間進(jìn)行。這段時間內(nèi)微生物活躍生長，也就是說平衡生長，其中生物量一起增長并保持細(xì)胞總體化學(xué)組成不變。
通常微生物生長受限要么是營養(yǎng)衰竭要么是有毒代謝產(chǎn)物的累積和生長速率的降低。生長的維持是通過添加合適的營養(yǎng)和保持生長正確的溫度及pH和必需的氧氣供給。
這里描述的保存方法有效的促進(jìn)了穩(wěn)定性使得生物催化劑可被迅速使用而無任何顯著的活性損失。保存的穩(wěn)定性不是必需采取例如固定化、添加穩(wěn)定化合物或冷凍干燥達(dá)到的。保存的穩(wěn)定性可不采取去除任何發(fā)酵液成分例如尿素或尿素衍生物來達(dá)到，即使尿素是眾所周知的蛋白質(zhì)失活劑。
組合物或保存方法所用的環(huán)境可包含氧或基本上無氧的環(huán)境。無氧我們是指氧濃度應(yīng)該低于溶解氧濃度的1％。去除發(fā)酵液中的氧可通過任一種除氧的常規(guī)方法進(jìn)行。這包括用一種惰性氣體沖洗一段時間、除去保存容器頭部的氧氣、保存于負(fù)壓或添加已知的氧凈化劑例如抗壞血酸或肼和酰肼。
可預(yù)計的是保存兩天后并且尤其是數(shù)天后腈水合酶活性會有些損失。即使無氧存在這也是意料中的。特別是在發(fā)酵液殘余成分例如尿素存在下和溫度高于0℃也可預(yù)計到。這是因為生物催化劑中的蛋白酶預(yù)期可能降解細(xì)胞內(nèi)的其他蛋白，包括腈水合酶。并且，可預(yù)期尿素或尿素衍生物的存在是有害的，因為尿素是已知的蛋白失活劑。不過，生物催化劑沒有經(jīng)受任何預(yù)期的不利條件并因此腈水合酶活性沒有遭受顯著損失。
相反我們發(fā)現(xiàn)在保存期間包含腈水合酶的生物催化劑的活性在某些情況下確實增高了。
因此本發(fā)明的另一方面是我們提供了一種增高能形成腈水合酶的生物催化劑的腈水合酶活性的方法，方法為依照本發(fā)明的貯存方法保存生物催化劑于保存培養(yǎng)基。因此，該方法通過其活性增高的優(yōu)點可產(chǎn)生新的生物催化劑組合物。所以，生物催化劑組合物的腈水合酶，尤其是生物催化劑保存期間形成的是新的。并且，保存期間生物催化劑不產(chǎn)生與腐敗相關(guān)的不良?xì)馕丁?br> 優(yōu)選使生物催化劑保存至少兩天的保存方法，更優(yōu)選大于等于一周。具體的生物催化劑可保存三到二十八天，例如三到十四天。
發(fā)酵液成分例如尿素的存在對本發(fā)明該方面的組合物或保存方法不是太重要。存在于發(fā)酵液的成分可能是尿素或尿素衍生物。尿素衍生物可以是例如尿素的烷基衍生物。
尿素或尿素衍生物可通過包含于發(fā)酵混合物中而存在于生物催化劑組合物內(nèi)。本發(fā)明一種形式中的組合物或含有生物催化劑的保存培養(yǎng)基可以是還原除氧的并包含發(fā)酵液組分例如尿素。
本發(fā)明該方面一個特別有利的特點是不再需要從發(fā)酵混合物中分離培養(yǎng)于其中的生物催化劑。這具有重要價值，因為避免了額外處理步驟的要求。因此組合物也可包括隨后保存的發(fā)酵混合物。保存生物催化劑的方法中，我們發(fā)現(xiàn)也可在發(fā)酵混合物存在下完成而對酶活性不會有任何有害作用。這使得發(fā)酵液可立即用于催化反應(yīng)，或使發(fā)酵液保存數(shù)天甚至數(shù)周后沒有有害物質(zhì)同時生物轉(zhuǎn)化步驟也可在數(shù)天時間后實現(xiàn)，所以確保易于獲得的生物催化劑不斷供給而不需額外的處理步驟使得生物轉(zhuǎn)化步驟簡化并降低了成本。
生物催化劑可方便的保存于凝固點以上的溫度。典型的生物催化劑可保存于環(huán)境溫度，例如高達(dá)30或40℃。不過，本發(fā)明方法的優(yōu)點是生物催化劑可保存于環(huán)境溫度而不用特別警惕溫度的檢測和控制。優(yōu)選生物催化劑保存溫度在4到30或40℃，更優(yōu)選5到25℃，例如介于10到25℃之間尤其是15到25℃。
依據(jù)本發(fā)明的再一方面，我們提供了一種通過用腈水合酶接觸相應(yīng)的腈來生產(chǎn)酰胺的方法，其中生物催化劑是組合物的一部分或以非活躍生長形式保存在保存培養(yǎng)基中的游離微生物細(xì)胞，其中組合物或保存培養(yǎng)基包含發(fā)酵液并且生物催化劑是(或得自)微生物紫紅紅球菌NCIMB 41164菌種或其突變體。
因此依據(jù)本發(fā)明的該方面生物催化劑可處于含氧環(huán)境或無氧環(huán)境。腈轉(zhuǎn)換開始前可以包含或不包含殘留發(fā)酵液組分例如尿素。這可由依據(jù)本發(fā)明保存方面進(jìn)行生物催化劑的保存達(dá)到或可選擇的以依據(jù)本發(fā)明的組分而提供。
如前提到的從制備生物催化劑的發(fā)酵混合物中移出生物催化劑不是必需的。因此首選形式是生物催化劑所在的環(huán)境也包含發(fā)酵液的組分。所以包括發(fā)酵液成分的生物催化劑組合物可以與腈結(jié)合并隨后水合為相應(yīng)的酰胺。過去認(rèn)為例如US-A-5567608聲明的阻止雜質(zhì)從生物催化劑洗脫到反應(yīng)產(chǎn)物最好是生物催化劑的固定化，相反我們驚奇地發(fā)現(xiàn)反應(yīng)混合物中包含的發(fā)酵液不影響最終產(chǎn)物的質(zhì)量并且該方面已經(jīng)在UK申請0327901.5中進(jìn)行了描述，案號為BT/3-22349/P1。
發(fā)酵混合物包含讓以下微生物生長持續(xù)的必需組分。大體上混合物至少含有碳源、氮源和各種營養(yǎng)?？砂ㄌ抢鐔翁侨缙咸烟腔蚱渌腔蛘唠p糖或多糖，銨鹽，復(fù)合培養(yǎng)基成分例如酵母提取物和蛋白胨、氨基酸、維生素、磷酸鹽、鉀、鈉、鎂和鈣鹽，微量元素例如鐵、鈷、錳、銅、鋅等。這些和其他成分可以適合特定微生物生長的濃度包含在發(fā)酵混合物中。眾所周知的是發(fā)酵的生物催化劑產(chǎn)能可能會變化并且發(fā)酵液可用于生長的不同時期所以生產(chǎn)后能用這種方法保存生物催化劑是很重要的。
我們發(fā)現(xiàn)生物催化劑的活性在反應(yīng)了一段較長時間后沒有顯著降低。因而可較少更換生物催化劑。優(yōu)選生物催化劑至少用2天并且在此期間基本沒有活性損失。
通常用腈水合酶催化的反應(yīng)能一步將腈轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酰胺。當(dāng)腈是丙烯腈而酰胺是丙烯酰胺時這個過程有特別的價值?？善谕脝闻锎呋瘎崿F(xiàn)這個轉(zhuǎn)化步驟數(shù)次，數(shù)天后除去部分以實現(xiàn)數(shù)次將腈轉(zhuǎn)化為酰胺的反應(yīng)。因此，盡可能低成本保存生物催化劑而對催化劑無害同時生物轉(zhuǎn)化步驟同步進(jìn)行是很重要的。所以實際上可保存單批補(bǔ)料的生物催化劑以隨時用于生產(chǎn)數(shù)批如丙烯酰胺。數(shù)批可以是5到10或更多批，甚至15到20批。
本發(fā)明的又一方面，我們發(fā)現(xiàn)一種提高微生物生物催化活性的方法。微生物在含有尿素或尿素衍生物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。不過，在微生物生長至少開始6小時后才引入尿素或尿素衍生物。通常至少培養(yǎng)微生物的前6小時培養(yǎng)基基本上無尿素或尿素衍生物并且此后才向培養(yǎng)基中加入尿素和尿素衍生物。正如前面指出的基本不含我們是指培養(yǎng)基含有少于0.2g/L，一般少于0.1g/L且可不含尿素或尿素衍生物。優(yōu)選培養(yǎng)基至少12小時有時至少24小時基本不含尿素或尿素衍生物。不過，為了使生物催化活性最大化首選在培養(yǎng)48小時內(nèi)引入尿素或尿素衍生物。
生物催化活性可如這里所述以酶活性的方式進(jìn)行確定。
優(yōu)選能產(chǎn)生腈水合酶的微生物。適合的生物催化劑包含這種可用來從相應(yīng)腈通過腈水合酶催化反應(yīng)的水合過程制備酰胺的微生物。通過延遲引入尿素或尿素衍生物的微生物培養(yǎng)提供了特別適合該反應(yīng)的增高的腈水合酶活性。該方法特別適合由(甲基)丙烯腈制備(甲基)丙烯酰胺。這種方法可以如這里所述實現(xiàn)。此外生物催化劑可再循環(huán)和再利用。
顯然需要紅球菌屬的微生物，優(yōu)選紫紅紅球菌種，尤其是紫紅紅球菌NCIMB 41164。
以下實施例提供了如何實現(xiàn)本發(fā)明的例證。
實施例1用富集培養(yǎng)技術(shù)從土壤中分離紫紅紅球菌NCIMB 41164，在含有以下組分(g/L)KH2PO4，7.0；KH2PO43.0；蛋白胨，5.0；酵母提取物，3.0；葡萄糖，5.0；MgSO4，0.5；微量金屬溶液，5mL；乙腈20mL的培養(yǎng)基上生長。PH調(diào)節(jié)至7.2。28℃生長3天后15℃時腈水合酶活性為4000μmol min-1/g干細(xì)胞。
實施例2(1)紫紅紅球菌NCIMB 41164在含有400mL培養(yǎng)基的2L帶擋板的錐形瓶(baffled erlenmeyer flask)中生長，培養(yǎng)基包含以下組分(g/L)磷酸氫二鉀0.7；磷酸氫鉀0.3；葡萄糖10.0；蛋白胨，1.0；酵母提取物3.0；七水合硫酸鎂0.5；尿素5.0；六水合氯化鈷0.01；加水至1L。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至7.2。28℃培養(yǎng)生長5天后15℃時的腈水合酶活性為47900μmol min-1/g(2)(a)紫紅紅球菌NCIMB 41164在不含蛋白胨的(1)所述培養(yǎng)基中生長。
(b)紫紅紅球菌NCIMB 41164在不含蛋白胨也不含尿素的(2a)所述培養(yǎng)基中生長。生物培養(yǎng)24小時然后向培養(yǎng)物加入5g/L尿素再生長5天。
(c)紫紅紅球菌NCIMB 41164在不含尿素的(2a)所述培養(yǎng)基中生長。生物培養(yǎng)48小時然后向培養(yǎng)物加入5g/L尿素再生長4天。
(d)紫紅紅球菌NCIMB 41164不含尿素的(2a)所述培養(yǎng)基中生長。生物培養(yǎng)6天。
如上所述在生長開始后的1、2、3和6天取4個培養(yǎng)物樣品。測量15℃的腈水合酶活性見表1。
表1
ND未確定實施例3(1)紫紅紅球菌NCIMB 41164在裝有180L培養(yǎng)基的280L發(fā)酵罐中生長，培養(yǎng)基包含以下組分(g/L)磷酸氫二鉀0.7；磷酸氫鉀0.3；葡萄糖2.0；酵母提取物3.0；七水合硫酸鎂0.5；六水合氯化鈷0.01。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至7.2。30℃培養(yǎng)生長3天。17小時后將尿素加入培養(yǎng)物。周期性測量腈水合酶活性(30℃時)。加入尿素22小時后30℃的活性約176000μmol min-1/g并且再過9小時活性增高至323000μmol min-1/g。
(2)在加有紫紅紅球菌NCIMB 41164的反應(yīng)器中裝入625克水?；旌衔锛訜嶂?5℃。375g丙烯腈以維持2％濃度(重量比)的速率加入反應(yīng)器中。175分鐘后全部丙烯腈轉(zhuǎn)化為丙烯酰胺，終濃度約為50％(重量比)。
(3)2的細(xì)胞通過離心回收并重懸于625g水中。該混懸液在再次裝入反應(yīng)器前于4℃保存3天。隨后是5中描述的操作并在175分鐘后全部丙烯腈轉(zhuǎn)化為丙烯酰胺。
(4)除了再利用前保存2天外3的細(xì)胞如上述3進(jìn)行處理。再合成50％的丙烯酰胺。測量實施例32-4)(5-7各批次產(chǎn)生丙烯酰胺的丙烯酸濃度見表2。
表2測量各批次產(chǎn)生丙烯酰胺的丙烯酸濃度
實施例4(1)紫紅紅球菌NCIMB 41164在裝有180L培養(yǎng)基的280L發(fā)酵罐中生長，培養(yǎng)基包含以下組分(g/L)磷酸氫二鉀0.7；磷酸氫鉀0.3；葡萄糖1.0；酵母提取物3.0；七水合硫酸鎂0.5；六水合氯化鈷0.01；尿素，5.0。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至7.2。30℃培養(yǎng)生長3天。
保存前用氮?dú)饨o25L發(fā)酵液脫氣20分鐘，環(huán)境溫度約5℃保存3天半。收獲15小時后測量腈水合酶活性，發(fā)現(xiàn)25℃時活性為242000U/g。三天后再次測量NH活性，發(fā)現(xiàn)其為293000U/g。
實施例5紫紅紅球菌NCIMB 41164在2L錐形燒瓶(Erlenmeyer flask)中28℃，180rpm振蕩生長5天，培養(yǎng)基含有以下組分(g/L)磷酸氫二鉀0.7；磷酸氫鉀0.3；葡萄糖10.0；酵母提取物3.0；尿素5.0；七水合硫酸鎂0.5；六水合氯化鈷0.01。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至7.2。培養(yǎng)液分成兩部分，一半用氮?dú)獬?。除氧和充氧的兩部分培養(yǎng)液都4、15和25℃孵育一周。定時檢測各部分的腈水合酶活性。
腈水合酶測定結(jié)果見表3。給出結(jié)果單位為U/mg干細(xì)胞。
表3
從實施例5所示結(jié)果可以看出生物催化劑可以有效的保存于環(huán)境溫度。并且可看出在這種保存情況下相比0天腈水合酶活性有增加。
實施例6解凍后的紫紅紅球菌NCIMB 41164細(xì)胞重懸于水。測量了1周時間的腈水合酶活性。測量的相對腈水合酶活性見表4。
表4
表4結(jié)果顯示在1到7天孵育期間任何保存溫度下活性都沒有降低。
實施例7(1)紫紅紅球菌NCIMB 41164在含有100mL培養(yǎng)基的0.5L帶擋板的錐形燒瓶中生長，培養(yǎng)基含有以下組分(g/L)磷酸氫二鉀0.7；磷酸氫鉀0.3；葡萄糖10.0；酵母提取物3.0；七水合硫酸鎂0.5；尿素5.0；六水合氯化鈷0.01；加水至1L。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至7.2。30℃培養(yǎng)生長4天。生長2、3和4天后測量25℃時的腈水合酶活性。
(2)(a)紫紅紅球菌NCIMB 41164在(1)所述培養(yǎng)基中生長，只不過尿素由二甲基脲代替。
(b)紫紅紅球菌NCIMB 41164在(1)所述培養(yǎng)基中生長，只不過尿素由乙脲代替。
(c)紫紅紅球菌NCIMB 41164在(1)所述培養(yǎng)基中生長，只不過5g/L尿素由2.5g/L尿素和2.5g/L二甲基脲代替。
(d)紫紅紅球菌NCIMB 41164在(1)所述培養(yǎng)基中生長，只不過5g/L尿素由2.5g/L二甲基脲和2.5g/L乙脲代替。
腈水合酶活性見表5。
表權(quán)利要求
1.一種微生物，所述微生物為紫紅紅球菌NCIMB 41164菌株或其突變體。
2.一種培養(yǎng)紫紅紅球菌NCIMB 41164菌株或其突變體微生物的方法，所述方法為在包含尿素或尿素衍生物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中尿素或尿素衍生物在微生物生長開始后至少6小時才加入培養(yǎng)基中。
4.權(quán)利要求2或3的方法，其中微生物培養(yǎng)的至少最初6小時中培養(yǎng)基包含的尿素或尿素衍生物少于0.2g/L，并且尿素或尿素衍生物隨后才被加入培養(yǎng)基中。
5.權(quán)利要求2-4中任一項的方法，其中微生物培養(yǎng)的至少最初12小時中培養(yǎng)基包含的尿素或尿素衍生物少于0.2g/L，并且尿素或尿素衍生物隨后才被加入培養(yǎng)基中。
6.權(quán)利要求2-5中任一項的方法，其中尿素或尿素衍生物在培養(yǎng)48小時內(nèi)加入培養(yǎng)基中。
7.一種可從微生物獲得的腈水合酶，所述微生物為紫紅紅球菌NCIMB 41164菌株或其突變體。
8.一種從相應(yīng)腈制備酰胺的方法，其中所述腈在生物催化劑存在的水性培養(yǎng)基中發(fā)生水合反應(yīng)，所述生物催化劑選自紫紅紅球菌NCIMB 41164菌株微生物、其突變體及從紫紅紅球菌NCIMB 41164菌株或其突變體獲得的腈水合酶。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述酰胺是(甲基)丙烯酰胺。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述生物催化劑加入水性培養(yǎng)基中且(甲基)丙烯腈以在水性培養(yǎng)基中維持高達(dá)6％重量比的濃度加入水性培養(yǎng)基中。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述反應(yīng)持續(xù)到丙烯酰胺的濃度在30和55％重量之間。
12.權(quán)利要求8-11中任一項的方法，其中所述生物催化劑是循環(huán)并重復(fù)使用的。
13.一種提高微生物的生物催化活性的方法，其中所述微生物在含有尿素或尿素衍生物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中尿素或尿素衍生物在微生物生長開始后至少6小時才被加入培養(yǎng)基中。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述微生物培養(yǎng)的至少最初6小時中培養(yǎng)基包含的尿素或尿素衍生物少于0.2g/L，并且尿素或尿素衍生物隨后才被加入培養(yǎng)基中。
15.權(quán)利要求13或14的方法，其中微生物培養(yǎng)的至少最初12小時中培養(yǎng)基包含的尿素或尿素衍生物少于0.2g/L，并且尿素或尿素衍生物隨后才被加入培養(yǎng)基中。
16.權(quán)利要求13-15中任一項的方法，其中尿素或尿素衍生物在培養(yǎng)48小時內(nèi)被加入培養(yǎng)基中。
17.權(quán)利要求13-16中任一項的方法，其中所述微生物能產(chǎn)生腈水合酶。
18.權(quán)利要求13-17中任一項的方法，其中所述微生物是紅球菌屬微生物，優(yōu)選紫紅紅球菌種微生物。
19.一種從相應(yīng)腈制備酰胺的方法，其中所述腈在生物催化劑存在的水性培養(yǎng)基中發(fā)生水合反應(yīng)，所述生物催化劑選自能產(chǎn)生腈水合酶的微生物，其中所述微生物依照權(quán)利要求13-18中任一項的方法培養(yǎng)。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述酰胺是(甲基)丙烯酰胺。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述生物催化劑加入水性培養(yǎng)基且(甲基)丙烯腈以在水性培養(yǎng)基中維持高達(dá)6％重量比的濃度加入水性培養(yǎng)基中。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述反應(yīng)持續(xù)至丙烯酰胺濃度在30和55％重量之間。
23.權(quán)利要求19至22中任一項的方法，其中所述生物催化劑是循環(huán)并重復(fù)使用的。
24.一種水性組合物，所述組合物包含的生物催化劑是或來自紫紅紅球菌NCIMB 41164菌株或其突變體微生物且所述生物催化劑是非活躍生長的游離細(xì)胞微生物形式。
25.一種保存生物催化劑的方法，其中所述生物催化劑是或來自紫紅紅球菌NCIMB 41164菌株或其突變體微生物，所述方法為以非活躍生長的游離細(xì)胞微生物形式在水性保存培養(yǎng)基中保存。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述生物催化劑保存于其凝固點以上的溫度，優(yōu)選0℃以上且更優(yōu)選4℃和30℃之間。
27.權(quán)利要求25或26的方法，其中所述生物催化劑保存至少2天時間，優(yōu)選3到28天之間并更優(yōu)選5到14天之間。
28.一種組合物，所述組合物可由權(quán)利要求25-27中任一項的方法得到。
29.一種腈水合酶，所述腈水合酶可由權(quán)利要求24的組合物得到或可由權(quán)利要求25-27中任一項的方法得到。
30.一種通過用腈水合酶接觸相應(yīng)腈制備酰胺的方法，其中所述腈水合酶可由權(quán)利要求24的組合物得到或由權(quán)利要求25-27中任一項的方法得到。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述酰胺是(甲基)丙烯酰胺。
全文摘要
一種微生物為紫紅紅球菌NCIMB 41164菌株或其突變體。要求保護(hù)一種在含有尿素或尿素衍生物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)該微生物的方法。要求保護(hù)從該微生物中獲得的一種腈水合酶。也要求保護(hù)一種從相應(yīng)腈制備酰胺的方法，其中腈在存在生物催化劑的水性培養(yǎng)基中發(fā)生水合反應(yīng)，生物催化劑選自紫紅紅球菌NCIMB 41164或其突變體微生物。還要求保護(hù)一種保存紫紅紅球菌NCIMB 41164的方法。
文檔編號C12N1/20GK1886502SQ200480035487
公開日2006年12月27日 申請日期2004年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月2日
發(fā)明者J·胡赫斯, Y·阿米塔格, J·庫拉爾, S·格里哈格 申請人:西巴特殊化學(xué)水處理有限公司