專利名稱：一種細(xì)胞培養(yǎng)與產(chǎn)品回收的一體化系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及用于動(dòng)物工程細(xì)胞產(chǎn)品大規(guī)?；厥盏墓に囋O(shè)備，尤指一種細(xì)胞培養(yǎng)與產(chǎn)品回收的一體化系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
正如一些科學(xué)家預(yù)言的，21世紀(jì)是生物科學(xué)世紀(jì)，生命科學(xué)與其他學(xué)科結(jié)合正以前所未有的速度飛速發(fā)展。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，越來越多的基因重組產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化，已經(jīng)產(chǎn)生并將繼續(xù)產(chǎn)生巨大的社會(huì)效益和可觀的經(jīng)濟(jì)效益。生物工程下游技術(shù)是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵技術(shù)，它包括生物工程產(chǎn)品的回收、產(chǎn)品純化、產(chǎn)品的生產(chǎn)制備和產(chǎn)品質(zhì)量控制等等。以往的產(chǎn)品傳統(tǒng)回收工藝，都是將細(xì)胞培養(yǎng)液或是細(xì)胞勻漿除去固形成分濃縮后上色譜柱或直接上柱，將產(chǎn)品吸附到色譜柱上，然后洗脫下來，再用高效色譜方法進(jìn)行精純化。這對(duì)于小規(guī)模生產(chǎn)制備是可行的，但不能滿足哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞大規(guī)模連續(xù)灌流培養(yǎng)--每天生產(chǎn)幾百升、幾千升細(xì)胞培養(yǎng)上清的大規(guī)模生產(chǎn)。
為了減少哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)步驟，降低生產(chǎn)成本，歐美少數(shù)發(fā)達(dá)國家從20世紀(jì)80年代末就開始研究哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)和產(chǎn)品回收的一體化工藝。英國伯明瀚大學(xué)研究了一套小鼠雜交瘤細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)與單克隆抗體回收的一體化裝置，美國專家也報(bào)告了一個(gè)生物工程裝置，能將工程細(xì)胞的大量培養(yǎng)與重組蛋白的純化一次性完成。他們都是將特定單克隆抗體的抗原用化學(xué)方法耦聯(lián)到吸附介質(zhì)上，制成抗體親和流化床色譜注，將親和柱直接連接到雜交瘤細(xì)胞連續(xù)灌流培養(yǎng)罐(生物反應(yīng)器)的出口端，細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)過濾網(wǎng)，流經(jīng)流化床親和色譜柱，單克隆抗體吸附到色譜柱上，廢液從色譜柱的出口端流到廢液桶里，然后定期將親和色譜柱切換下來進(jìn)行洗脫，收集的單克隆抗體再用高效色譜法進(jìn)行精純化。但是，這種生產(chǎn)工藝只適合于回收單克隆抗體和特異抗原等產(chǎn)品，而不適用于回收其它大多數(shù)蛋白質(zhì)或其它生物大分子，因?yàn)榇蠖鄶?shù)蛋白質(zhì)、核酸采用離子交換色譜柱進(jìn)行回收更為方便，細(xì)胞培養(yǎng)上清在上色譜柱之前，必須調(diào)整pH值才能上柱，否則產(chǎn)品不能結(jié)合到色譜柱上，也就無法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)工藝與產(chǎn)品回收工藝的一體化。另外，抗體親和色譜柱不便于消毒，在使用過程中抗體會(huì)逐漸脫落污染產(chǎn)品，同時(shí)要滿足大規(guī)模生產(chǎn)需要制備大量親和抗體又需要投入一些人力和設(shè)備。

發(fā)明內(nèi)容
本實(shí)用新型的目的是提供一種細(xì)胞培養(yǎng)與產(chǎn)品回收的一體化系統(tǒng)，其可適用于離子交換色譜法回收蛋白質(zhì)或其它生物大分子產(chǎn)品，實(shí)現(xiàn)工程細(xì)胞連續(xù)灌流培養(yǎng)與產(chǎn)品回收的一體化及大規(guī)模生產(chǎn)。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型采取以下設(shè)計(jì)方案一種細(xì)胞培養(yǎng)與產(chǎn)品回收的一體化系統(tǒng)，包括接進(jìn)液管的細(xì)胞培養(yǎng)罐，細(xì)胞培養(yǎng)罐通過排液管連至儲(chǔ)液罐內(nèi)，再依次通過排液管連至色譜柱及廢液罐，在細(xì)胞培養(yǎng)罐與儲(chǔ)液罐、儲(chǔ)液罐與色譜柱間設(shè)有蠕動(dòng)泵，設(shè)受控于-pH自動(dòng)調(diào)控裝置的加酸、加堿的蠕動(dòng)泵，加堿蠕動(dòng)泵入口端外接堿液，加酸蠕動(dòng)泵入口端外接酸液，兩臺(tái)蠕動(dòng)泵的出口端均接入儲(chǔ)液罐內(nèi)；所述的pH自動(dòng)調(diào)控裝置的pH復(fù)合電極浸入儲(chǔ)液罐內(nèi)的培養(yǎng)上清液中。
所述的pH自動(dòng)調(diào)控裝置由酸度計(jì)與控制酸度計(jì)的單片機(jī)實(shí)時(shí)控制系統(tǒng)連接構(gòu)成。
在儲(chǔ)液灌里安裝一個(gè)攪拌器。
本實(shí)用新型的優(yōu)點(diǎn)是(1)本裝置適用于大多數(shù)動(dòng)物工程細(xì)胞產(chǎn)品的回收(2)與細(xì)胞培養(yǎng)和分別回收產(chǎn)品相比，本發(fā)明減少了部分分離設(shè)備和人力，可降低生產(chǎn)成本。


圖1為本實(shí)用新型系統(tǒng)構(gòu)成示意圖圖2為本實(shí)用新型pH自動(dòng)調(diào)控裝置構(gòu)成原理框圖具體實(shí)施方式
如圖1所示，本實(shí)用新型細(xì)胞培養(yǎng)與產(chǎn)品回收的一體化系統(tǒng)，包括接進(jìn)液管1的細(xì)胞培養(yǎng)罐2，細(xì)胞培養(yǎng)罐通過排液管連至儲(chǔ)液罐3內(nèi)，再依次通過排液管連至色譜柱4及廢液罐5，在細(xì)胞培養(yǎng)罐與儲(chǔ)液罐、儲(chǔ)液罐與色譜柱間設(shè)有蠕動(dòng)泵6，另設(shè)受控于-pH自動(dòng)調(diào)控裝置的加酸、加堿的蠕動(dòng)泵7、8，加堿蠕動(dòng)泵8入口端外接堿液，加酸蠕動(dòng)泵7入口端外接酸液，兩臺(tái)蠕動(dòng)泵的出口端均接入儲(chǔ)液罐內(nèi)；所述的pH自動(dòng)調(diào)控裝置9的pH復(fù)合電極浸入儲(chǔ)液罐內(nèi)的培養(yǎng)上清液中。
所述的色譜柱可采用在線洗脫(Streamline)陽離子交換擴(kuò)張床色譜柱。
參見圖2，所述的pH自動(dòng)調(diào)控裝置9是把DpH87酸度計(jì)(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院產(chǎn)品)與8031單片機(jī)實(shí)時(shí)控制系統(tǒng)相連并進(jìn)行適時(shí)控制。
所述的8031單片機(jī)實(shí)時(shí)控制系統(tǒng)包括一個(gè)中央處理器8031CPU、2764EPROM(系統(tǒng)程序儲(chǔ)存器)、2817A EEPROM(電檫儲(chǔ)存器，永久保存編程文件數(shù)據(jù))、ADC0809(8位8路模數(shù)轉(zhuǎn)換芯片，用于pH玻璃電極信號(hào)和溫度信號(hào)的數(shù)字化轉(zhuǎn)換)；一片可編程鍵盤顯示接口器件-8279(用于按鍵和顯示人機(jī)對(duì)話操作)；另外還有兩路雙向可控硅無觸點(diǎn)開關(guān)電路(采用光隔離控制模塊)，用于控制兩臺(tái)蠕動(dòng)泵加酸或加堿。酸度計(jì)的pH電極及-溫度傳感器分別經(jīng)放大器接單片機(jī)實(shí)時(shí)控制系統(tǒng)的模數(shù)轉(zhuǎn)換芯片輸入端；單片機(jī)實(shí)時(shí)控制系統(tǒng)的兩控制輸出端分別經(jīng)兩路雙向可控硅無觸點(diǎn)開關(guān)電路控制兩臺(tái)加酸、加堿的蠕動(dòng)泵。
本裝置適用于大多數(shù)動(dòng)物工程細(xì)胞產(chǎn)品的回收，且可用于動(dòng)物工程細(xì)胞產(chǎn)品的大規(guī)?；厥罩苽?。
以下列具體實(shí)施例說明使用本實(shí)用新型細(xì)胞培養(yǎng)與產(chǎn)品回收的一體化系統(tǒng)裝置制備工程細(xì)胞連續(xù)灌流培養(yǎng)與重組人尿激酶原(rhpro-UK)的回收過程(1)工程細(xì)胞培養(yǎng)和回收目標(biāo)蛋白將CHO工程細(xì)胞復(fù)蘇依次在方瓶、攪拌瓶、轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)，待工程細(xì)胞密度達(dá)到1×106細(xì)胞/ml后轉(zhuǎn)入B布朗(B.BRAUN)5升生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到5×106細(xì)胞/ml再轉(zhuǎn)入B布朗(B.BRAUN)30升生物反應(yīng)器培養(yǎng)，然后將經(jīng)過消毒滅菌的一體化裝置按圖1與B布朗(B.BRAUN)30升生物反應(yīng)器連接，色譜柱事先用平衡緩沖液平衡并擴(kuò)張起來。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液流入儲(chǔ)液罐并達(dá)到2/3體積時(shí)，將pH調(diào)控儀和加酸堿蠕動(dòng)泵的電源打開并將pH值設(shè)定在5～6之間，然后打開在線洗脫陽離子交換(streamliane SP)擴(kuò)張床色譜柱進(jìn)液蠕動(dòng)泵電源開關(guān)并將流速調(diào)至40～50ml/分鐘(白天上柱，夜晚停止)，每隔3～4天換一個(gè)在線洗脫陽離子交換色譜柱。
(2)目標(biāo)蛋白的洗脫吸附有目標(biāo)蛋白的色譜柱切換下來后，柱下端連接一個(gè)蠕動(dòng)泵，上端與紫外檢測器連接(波長280nm)，用平衡緩沖液(0.01mol/L磷酸鹽緩沖液，含0.1mol/L NaCl，pH 5～6)將殘留的細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗干凈，然后將柱床壓縮至原來的體積，再用洗脫緩沖液(0.01mol/L磷酸鹽緩沖液，含1mol/L NaCl，pH 7.0)洗脫目標(biāo)蛋白質(zhì)，收集洗脫蛋白峰流出液，得到重組人尿及酶原(rhpro-UK)粗產(chǎn)品。
(3)目標(biāo)蛋白的精純化用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(含0.2mol/L NaCl，pH7.0)平衡聚苯烯酰胺(Sephacryl S-200HR)凝膠色譜柱大約一個(gè)柱體積，將粗產(chǎn)品上柱，用同種緩沖液繼續(xù)淋洗，收集蛋白主峰洗脫組分，純度達(dá)到99.98％(HPLC分析)，回收率72.2％。
與細(xì)胞培養(yǎng)和分別回收產(chǎn)品相比，本發(fā)明減少了部分分離設(shè)備和人力，可降低生產(chǎn)成本。
權(quán)利要求1.一種細(xì)胞培養(yǎng)與產(chǎn)品回收的一體化系統(tǒng)，包括接進(jìn)液管的細(xì)胞培養(yǎng)罐，細(xì)胞培養(yǎng)罐通過排液管連至儲(chǔ)液罐內(nèi)，再依次通過排液管連至色譜柱及廢液罐，在細(xì)胞培養(yǎng)罐與儲(chǔ)液罐、儲(chǔ)液罐與色譜柱間設(shè)有蠕動(dòng)泵，其特征在于設(shè)受控于一pH自動(dòng)調(diào)控裝置的加酸、加堿的蠕動(dòng)泵，加堿蠕動(dòng)泵入口端外接堿液，加酸蠕動(dòng)泵入口端外接酸液，兩臺(tái)蠕動(dòng)泵的出口端均接入儲(chǔ)液罐內(nèi)；所述的pH自動(dòng)調(diào)控裝置的pH復(fù)合電極浸入儲(chǔ)液罐內(nèi)的培養(yǎng)上清液中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)與產(chǎn)品回收的一體化系統(tǒng)，其特征在于所述的pH自動(dòng)調(diào)控裝置由酸度計(jì)與適時(shí)控制的單片機(jī)實(shí)時(shí)控制系統(tǒng)連接構(gòu)成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的細(xì)胞培養(yǎng)與產(chǎn)品回收的一體化系統(tǒng)，其特征在于所述的單片機(jī)實(shí)時(shí)控制系統(tǒng)包括一中央處理器CPU，一系統(tǒng)程序儲(chǔ)存器EPROM，一永久保存編程文件數(shù)據(jù)的電檫儲(chǔ)存器EEPROM，一用于pH玻璃電極信號(hào)和溫度信號(hào)的數(shù)字化轉(zhuǎn)換的模數(shù)轉(zhuǎn)換芯片，一片可編程鍵盤顯示接口器件；酸度計(jì)的pH電極及一溫度傳感器分別經(jīng)放大器接單片機(jī)實(shí)時(shí)控制系統(tǒng)的模數(shù)轉(zhuǎn)換芯片輸入端；單片機(jī)實(shí)時(shí)控制系統(tǒng)的兩控制輸出端分別經(jīng)兩路雙向可控硅無觸點(diǎn)開關(guān)電路控制兩臺(tái)加酸、加堿的蠕動(dòng)泵。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的細(xì)胞培養(yǎng)與產(chǎn)品回收的一體化系統(tǒng)，其特征在于所述的酸度計(jì)采用DPH87酸度計(jì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)與產(chǎn)品回收的一體化系統(tǒng)，其特征在于所述的儲(chǔ)液灌里安裝一個(gè)攪拌器。
專利摘要一種細(xì)胞培養(yǎng)與產(chǎn)品回收的一體化系統(tǒng)，包括接進(jìn)液管的細(xì)胞培養(yǎng)罐，細(xì)胞培養(yǎng)罐通過排液管連至儲(chǔ)液罐內(nèi)，再依次通過排液管連至色譜柱及廢液罐，在細(xì)胞培養(yǎng)罐與儲(chǔ)液罐、儲(chǔ)液罐與色譜柱間設(shè)有蠕動(dòng)泵，設(shè)受控于一pH自動(dòng)調(diào)控裝置的加酸、加堿的蠕動(dòng)泵，加堿蠕動(dòng)泵入口端外接堿液，加酸蠕動(dòng)泵入口端外接酸液，兩臺(tái)蠕動(dòng)泵的出口端均接入儲(chǔ)液罐內(nèi)；儲(chǔ)液灌里安裝一個(gè)攪拌器；pH自動(dòng)調(diào)控裝置的pH復(fù)合電極浸入儲(chǔ)液罐內(nèi)的培養(yǎng)上清液中。pH自動(dòng)調(diào)控裝置由酸度計(jì)與適時(shí)控制的單片機(jī)實(shí)時(shí)控制系統(tǒng)連接構(gòu)成。該系統(tǒng)裝置適用于大多數(shù)動(dòng)物工程細(xì)胞產(chǎn)品的回收；與細(xì)胞培養(yǎng)和分別回收產(chǎn)品相比，減少了部分分離設(shè)備和人力，可降低生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12M3/00GK2748466SQ2004201153
公開日2005年12月28日 申請(qǐng)日期2004年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月22日
發(fā)明者張正光, 陳昭烈, 武生明, 胡顯文, 胥照平, 肖成祖 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所