專利名稱：手術(shù)中的淋巴結(jié)檢測的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及分子診斷領(lǐng)域。
淋巴結(jié)增生在很多實(shí)體瘤中是最強(qiáng)的預(yù)后因素，而且淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的檢測是病理學(xué)者和外科醫(yī)生最為關(guān)注的。目前的淋巴結(jié)評(píng)估涉及H&E染色組織切片的微觀檢驗(yàn)，并有三個(gè)主要局限性(a)容易遺漏單個(gè)腫瘤細(xì)胞，或細(xì)胞的小病灶；(b)不能快速獲得結(jié)果，意味著崗哨淋巴結(jié)分析的任何陽性結(jié)果需要另一個(gè)外科手術(shù)來切除腋淋巴結(jié)和(c)只研究了一個(gè)或兩個(gè)組織切片，因此每個(gè)淋巴結(jié)的大部分沒有被檢驗(yàn)。連續(xù)切片有助于克服取樣誤差問題，而免疫組織化學(xué)(IHC)可用于鑒定單個(gè)腫瘤細(xì)胞。但是，這些方法的組合對(duì)于常規(guī)分析來說過于昂貴和費(fèi)時(shí)，并僅限于特殊情況如崗哨淋巴結(jié)檢驗(yàn)。
外科決定常?；谑中g(shù)中的淋巴結(jié)冷凍切片分析；但是，這些方法的靈敏度相對(duì)較低，相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)H&E病理學(xué)的50-70％，導(dǎo)致過高的二次手術(shù)率。沒有淋巴結(jié)增生的0期和I期乳癌患者的5年存活率分別為92％和87％。另一方面，有淋巴結(jié)增生的晚期乳癌患者的5年存活率顯著降低。例如，II期乳癌的存活率只有75％，III期為46％，IV期為13％。盡管淋巴結(jié)陰性的乳癌患者有提高的存活率，但是20-30％組織學(xué)上結(jié)節(jié)陰性的患者疾病復(fù)發(fā)。這很可能是由于包括與結(jié)節(jié)取樣相關(guān)問題的微轉(zhuǎn)移檢測現(xiàn)有技術(shù)的局限和檢測單個(gè)腫瘤細(xì)胞或小腫瘤病灶的低靈敏度。
除了在乳癌結(jié)節(jié)中需要更準(zhǔn)確和靈敏的微轉(zhuǎn)移檢測之外，在黑素瘤結(jié)節(jié)中以及更準(zhǔn)確的確定外科手術(shù)的范圍中也有一個(gè)快速和靈敏測試的相似需要，尤其是在手術(shù)中安排中。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是在這種安排中有用的分子生物領(lǐng)域中一個(gè)強(qiáng)有力的工具。這種技術(shù)可以將少量核苷酸片斷復(fù)制/擴(kuò)增到可被有效分析的數(shù)量。此外，隨著實(shí)時(shí)定量RT-PCR(Q-PCR)的發(fā)展，這種技術(shù)變得更加可靠和適合于自動(dòng)操作。Q-RT-PCR較少受到污染，并能夠量化基因表達(dá)。這種量化可用于手術(shù)中淋巴結(jié)分析的微轉(zhuǎn)移檢測。除了優(yōu)點(diǎn)，分子診斷中的PCR還有一些局限，使它難以用于典型的臨床診斷安排，尤其是手術(shù)安排。
這種局限中的一個(gè)是進(jìn)行PCR診斷通常所需時(shí)間。典型PCR反應(yīng)需要數(shù)小時(shí)，而不是幾分鐘。如果這種技術(shù)將在手術(shù)中使用，那么減少進(jìn)行一個(gè)PCR反應(yīng)所需時(shí)間是必需的。更進(jìn)一步的，盡管Q-RT-PCR能產(chǎn)生定量結(jié)果，至今還沒有已知的關(guān)閉值，用于將基于這種技術(shù)的陽性結(jié)果從陰性結(jié)果中區(qū)別開，也是不清楚哪個(gè)核苷酸片斷被最好檢測并與微轉(zhuǎn)移存在相關(guān)。擴(kuò)增和檢測核苷酸片斷的其它方法也存在并且都遭遇相似的問題。
一種克服了現(xiàn)有困難的手術(shù)中的分子淋巴結(jié)檢測將被醫(yī)學(xué)界接受。
發(fā)明概述本發(fā)明是一種用于微轉(zhuǎn)移的手術(shù)中淋巴結(jié)檢測。外科醫(yī)生在外科手術(shù)過程中根據(jù)已知方法確定崗哨淋巴結(jié)。如下所述切除和制備崗哨結(jié)節(jié)。然后從崗哨結(jié)節(jié)中快速提取核苷酸(如，RNA)。如果存在指示微轉(zhuǎn)移的標(biāo)記，就對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增和檢測。外科醫(yī)生然后根據(jù)該標(biāo)記的檢測結(jié)果采取行動(dòng)。
這種檢測優(yōu)選基于一種快速PCR和RT-PCR方法，該方法能夠在幾分鐘內(nèi)完成整個(gè)PCR反應(yīng)，從而允許在手術(shù)診斷中使用PCR來檢測崗哨淋巴結(jié)的微轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明的一個(gè)方面，一種手術(shù)中的分子診斷方法包括在外科手術(shù)過程中采用下述步驟從患者獲得組織樣品；從該樣品提取RNA，通過核苷酸擴(kuò)增和檢測分析樣品；并確定是否存在一個(gè)或多個(gè)基因表達(dá)標(biāo)記超過了關(guān)閉值。關(guān)閉值可能是絕對(duì)值或相對(duì)于對(duì)照基因的值。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，基因表達(dá)標(biāo)記是特定組織如乳腺組織的特異性核苷酸片斷。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，基因表達(dá)標(biāo)記是惡性腫瘤的指示性核苷酸片斷。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，淋巴結(jié)樣品被勻質(zhì)的，然后被稀釋以確保即使采用加速的提取方法也能提取到足夠的RNA。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，標(biāo)記是乳腺珠蛋白(mammaglobin)(Seq.ID.No.17)和用于乳癌診斷的PIP(Seq.ID.No.18)，B305D(特別地，同種型C，Seq.ID.No.14)，B726(Seq.ID.No.15)，GABA(Seq.ID.No.16)或O8E(Seq.ID.No.-)，以及用于黑素瘤診斷的酪氨酸酶(Seq.ID.No.22)和MART 1(Seq.ID.No.21)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，微轉(zhuǎn)移通過包括以下步驟的方法在手術(shù)中被檢測從一個(gè)崗哨淋巴結(jié)獲得RNA；實(shí)行一個(gè)特異于一個(gè)或多個(gè)關(guān)注基因的定量RT-PCR方法，并確定是否存在超過預(yù)定關(guān)閉的標(biāo)記。關(guān)閉值可能是一個(gè)絕對(duì)值或一個(gè)相對(duì)于對(duì)照基因表達(dá)的值。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，包含用于進(jìn)行微轉(zhuǎn)移的手術(shù)中淋巴結(jié)檢測的試劑的試劑盒。


圖1表明溶解產(chǎn)物的稀釋對(duì)RNA回收的影響。
圖2表明稀釋的影響。
圖3顯示不同乳腺細(xì)胞類型中乳腺珠蛋白的表達(dá)。
圖4顯示不同乳腺細(xì)胞類型中B305D的表達(dá)。
圖5顯示不同乳腺細(xì)胞類型中乳腺珠蛋白和B305D的組合表達(dá)。
發(fā)明詳述提供了手術(shù)中癌癥診斷的方法的。這些方法采用從淋巴結(jié)提取核苷酸的快速方法，以及擴(kuò)增和檢測指示轉(zhuǎn)移的核苷酸片斷的方法(這種片斷在此稱作為“標(biāo)記”)。
本發(fā)明方法的一個(gè)重要方面是快速擴(kuò)增和檢測指示某種基因表達(dá)的標(biāo)記。只要能在手術(shù)中檢測可接受的時(shí)期內(nèi)進(jìn)行(如不超過35分鐘)，任何可靠的、靈敏的和特異性的方法都可以使用。這包括PCR方法，滾環(huán)擴(kuò)增方法(RCA)，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法(LCR)，鏈置換擴(kuò)增方法(SDA)，核苷酸序列基礎(chǔ)擴(kuò)增方法(NASBA)，和其它方法。涉及的快速分子診斷方法最優(yōu)選定量PCR方法，包括QRT-PCR。
不考慮應(yīng)用的擴(kuò)增方法，從用于進(jìn)行檢測的組織中充分地取樣是重要的。這包括正確的剪切和處理崗哨淋巴結(jié)，以及從中提取RNA。一旦獲得結(jié)節(jié)，重要的是正確地處理以便存在的任何癌癥細(xì)胞都能被檢測出來。
多種方法能用于從組織樣品提取核苷酸。每種情況中的標(biāo)準(zhǔn)操作是費(fèi)時(shí)和困難的，即使使用為這種目的設(shè)計(jì)的商用試劑盒。典型的商用核苷酸提取試劑盒提取核苷酸至少需要15分鐘。本發(fā)明的方法中，提取核苷酸的時(shí)間少于8分鐘，優(yōu)選的少于6分鐘。這些快速提取方法是R.Belly，J.Toner，和J.Backus同期并題為“細(xì)胞和組織RNA的快速提取”專利申請的主題，在此合并用作參考。
完整RNA的成功分離一般包括四個(gè)步驟細(xì)胞和組織的有效裂解，核蛋白質(zhì)復(fù)合物的變性，內(nèi)源核糖核酸酶(RNAase)的失活以及雜質(zhì)DNA和蛋白質(zhì)的去除。用于滅活細(xì)胞提取物中的核糖核酸酶的硫氰酸胍鹽(GTC)和B-巰基乙醇的破壞的和保護(hù)的特性，使它們成為第一步驟的優(yōu)選試劑。當(dāng)與表面活性劑如十二烷基磺酸鈉(SDS)聯(lián)合使用時(shí)，破壞核蛋白質(zhì)復(fù)合物，使RNA釋放到溶液中，并分離去除蛋白質(zhì)。稀釋存在高濃度的GTC的細(xì)胞提取物，導(dǎo)致了細(xì)胞蛋白質(zhì)的選擇性沉降但RNA仍保留在溶液中。離心可以分離被沉降蛋白質(zhì)和細(xì)胞DNA的溶解產(chǎn)物，其優(yōu)選的通過一個(gè)柱進(jìn)行。這些柱可以剪切DNA并降低樣品的粘性。RNA純化優(yōu)選通過一個(gè)含有硅和其它物質(zhì)的螺旋柱進(jìn)行。人工破壞細(xì)胞和組織可以通過US專利4,715,545中描述的一次性組織研磨機(jī)進(jìn)行。均質(zhì)時(shí)間在1到2分鐘內(nèi)，優(yōu)選的是30-45秒。樣品然后用一個(gè)撕碎柱(shredding column)(如，QIAshredder，QIAGEN Inc.，Valencia，CA，或合適的取代物)或一個(gè)RNA處理裝置如可購自O(shè)mni International(Warrenton，VA)的PCR組織均質(zhì)試劑盒處理，來降低其粘性。RNA通過上述的旋轉(zhuǎn)柱沉降出來，而且離心時(shí)間不能超過30秒。當(dāng)使用如Qiagen，Inc.的那些商業(yè)的RNA提取試劑盒時(shí)，除了柱干燥步驟外的所有步驟都使用過濾來取代離心。典型地，在過柱之前樣品先用等體積的70％乙醇稀釋。在過濾沖洗之后，通過離心干燥柱子，在去核糖核酸酶水中洗提RNA。RNA用乙醇選擇性沉降出溶液，并結(jié)合到一個(gè)基質(zhì)上(優(yōu)選地，一個(gè)含硅的膜或過濾器)。RNA很快的結(jié)合到基質(zhì)中是因?yàn)樗肿颖浑x液鹽破壞，然后核苷酸順利的吸收到硅中。結(jié)合的總RNA通過簡單的沖洗步驟進(jìn)一步從雜質(zhì)鹽，蛋白質(zhì)和細(xì)胞雜質(zhì)中純化出來。最后，總RNA通過加入去核酶水從膜中洗提出來。這種快速方法的總時(shí)間少于8分鐘，優(yōu)選的少于6分鐘。
總的來說，快速RNA提取方法包括以下步驟(a)獲得一個(gè)來自生物系統(tǒng)的含有細(xì)胞的樣品，(b)合適地，從樣品中去除不含有所關(guān)注RNA的細(xì)胞，產(chǎn)生一個(gè)工作樣品，(c)溶解含有所關(guān)注RNA的細(xì)胞，并制備其勻漿，(d)合適地，稀釋該勻漿，(e)使該濕潤的勻質(zhì)工作樣品與一個(gè)含有或粘附有RNA結(jié)合物質(zhì)的基質(zhì)接觸，(f)使樣品接合到基質(zhì)上，(g)去除雜質(zhì)和干擾物，(h)干燥基質(zhì)，和(i)從基質(zhì)洗提RNA；在使用離心的情況中，在步驟g，h，或i之后使用離心，真空/過濾優(yōu)選用于提取步驟。
該快速提取過程中涉及的試劑是分析/接合緩沖液(優(yōu)選地，4.5M胍鹽-鹽酸，100mM磷酸鈉)，沖洗緩沖液I(優(yōu)選地，5M胍鹽-鹽酸中37％乙醇，20mM Tris-HCl)，沖洗緩沖液II(優(yōu)選地，20mM中80％乙醇，2mM Tris-HCl)，洗提緩沖液，和去核酶無菌雙蒸餾水。
由于結(jié)節(jié)中的癌細(xì)胞的分布是不均衡的，優(yōu)選從結(jié)節(jié)的多切片中采樣。合適地，根據(jù)病理學(xué)研究一個(gè)或多個(gè)結(jié)節(jié)。對(duì)同一個(gè)結(jié)節(jié)樣品分子檢測和病理學(xué)檢查的方法是將該結(jié)節(jié)切成用于病理學(xué)檢查的外和內(nèi)切片和用于分子測試的外和內(nèi)切片的至少四個(gè)切片。由于組織中的轉(zhuǎn)移和微轉(zhuǎn)移在結(jié)節(jié)或其它組織中的分布是不均衡的，必須獲得一個(gè)足夠大的樣品以便轉(zhuǎn)移不被遺漏。解決本發(fā)明方法中的取樣問題的方法是，勻質(zhì)一個(gè)大的組織樣品，然后稀釋很好混合的勻質(zhì)樣品，用于后繼的分子測試。
一個(gè)典型的PCR反應(yīng)包括多個(gè)擴(kuò)增步驟，或能選擇性地?cái)U(kuò)增目標(biāo)核苷酸種類的循環(huán)。一個(gè)典型的PCR反應(yīng)包括三個(gè)步驟一個(gè)變性步驟，其中目標(biāo)核苷酸被變性；一個(gè)退火步驟，其中一組PCR引物(正向和反向引物)與互補(bǔ)DNA鏈退火；和一個(gè)延伸步驟，其中一個(gè)熱穩(wěn)定性DNA聚合酶延伸引物。重復(fù)這個(gè)步驟多次，一個(gè)DNA片斷被擴(kuò)增并產(chǎn)生一個(gè)相應(yīng)于目標(biāo)DNA序列的擴(kuò)增子。典型的PCR反應(yīng)包括20或更多個(gè)循環(huán)的變性、退火和延伸。在很多情況中，退火和延伸步驟可以同時(shí)進(jìn)行，在該情況中循環(huán)只包括兩個(gè)步驟。
在該應(yīng)用RT-PCR的創(chuàng)造性方法中，RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)在一個(gè)適于手術(shù)中診斷的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行，這些步驟中每一個(gè)的長度可以在秒的范圍內(nèi)，而不是在分鐘內(nèi)。特別地，用幾個(gè)能產(chǎn)生熱傾斜速率為至少每秒約5℃的新熱循環(huán)儀，使用RT-PCR擴(kuò)增為30分鐘或更少。更優(yōu)選地，進(jìn)行擴(kuò)增少于25分鐘?？紤]到這個(gè)，PCR循環(huán)每個(gè)步驟接著的時(shí)間不包括傾斜的時(shí)間。變性步驟進(jìn)行的時(shí)間為10秒或更少。實(shí)際上，一些熱循環(huán)儀已經(jīng)設(shè)定為“0秒”，其可能是變性步驟合適的持續(xù)時(shí)間。也就是說，它對(duì)熱循環(huán)儀達(dá)到變性溫度是足夠的。每個(gè)退火和延伸步驟最優(yōu)選都少于10秒，而且當(dāng)在同一溫度進(jìn)行時(shí)，退火/延伸步驟的組合可以少于10秒。但是，一些同源探針檢測方法要求一個(gè)單獨(dú)的延伸步驟來實(shí)現(xiàn)最快速檢測。為了最小化總擴(kuò)增時(shí)間和非特異性副反應(yīng)的形成，退火溫度典型地高于50℃，更優(yōu)選地，退火溫度高于55℃。
由于一些原因沒有試驗(yàn)者干涉的單個(gè)RT-PCR組合反應(yīng)是渴望得到的(1)減少試驗(yàn)誤差危險(xiǎn)，(2)降低目標(biāo)或產(chǎn)物雜質(zhì)危害和(3)提高檢測速度。該步驟可能包括一個(gè)或兩個(gè)聚合酶。在兩個(gè)聚合酶的情況中，這些酶中的一個(gè)典型是基于RNA的DNA聚合酶(反轉(zhuǎn)錄酶)，一個(gè)是熱穩(wěn)定性的基于DNA的DNA聚合酶。為了最大化檢測，優(yōu)選對(duì)這兩種酶使用一種“熱啟動(dòng)”技術(shù)形式。US專利5,411,876和5,985,619提供了不同“熱啟動(dòng)”方法的例子，在這里合并用作參考。優(yōu)選方法包括使用一個(gè)或多個(gè)熱活化方法，其隔絕一個(gè)或多個(gè)充分DNA聚合所需的成分。US專利5,550,044和5,413,924描述了制備用于這些方法的試劑的方法。US專利6,403,341描述了一個(gè)涉及化學(xué)該變PCR試劑成分之一的隔絕方法。這里都合并用于參考。一個(gè)最優(yōu)選的方面，RNA和DNA依賴的聚合酶活性都位于單個(gè)酶中。充分?jǐn)U增需要的其它成分包括核苷三磷酸，二價(jià)鹽和緩沖成分。在一些例子中，非特異性核苷酸和酶穩(wěn)定劑是有益的。
任何特定的基于擴(kuò)增的分子診斷的特異性，嚴(yán)重地但不是專有地依賴于引物組的同一性。引物組是與目標(biāo)DNA退火從而擴(kuò)增目標(biāo)序列的正向和反向寡核苷酸引物對(duì)，從而產(chǎn)生目標(biāo)序列的特異性擴(kuò)增子。引物必須能擴(kuò)增所關(guān)注的疾病狀態(tài)的標(biāo)記。在本發(fā)明中，這些標(biāo)記是指示乳癌和黑素瘤。
在乳癌的情況中，創(chuàng)造性方法涉及一個(gè)特異于乳組織或乳癌組織的組織標(biāo)記的擴(kuò)增。使用至少兩種標(biāo)記的組合，以便當(dāng)淋巴結(jié)中存在乳和/或癌細(xì)胞時(shí)，能在臨床上被顯著和可靠地檢測出。優(yōu)選地，在一個(gè)反應(yīng)容器中同時(shí)擴(kuò)增和檢測標(biāo)記(如，它們是多元的)。最優(yōu)選地，引物組與那些標(biāo)記的特異核苷酸片斷互補(bǔ)。標(biāo)記包括乳腺珠蛋白(Seq.ID.No.17)和下述中的一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選一個(gè))B305D(Seq.ID.No.14)，PIP(Seq.ID.No.18)，B726(Seq.ID.No.15)，GABA(Seq.ID.No.16)或O8E(Seq.ID.No._)。組織特異性標(biāo)記與癌特異性標(biāo)記的組合提供了分別超過90％和95％的靈敏度和特異性。一些標(biāo)記存在多種異構(gòu)體，但這些異構(gòu)體中的某種比其它異構(gòu)體更特異于一種組織或癌。在B305D中，最優(yōu)選的異構(gòu)體是B305D異構(gòu)體C。它也是與乳腺珠蛋白標(biāo)記組合的標(biāo)記中最優(yōu)選的。
在黑素瘤中，創(chuàng)造性的方法涉及擴(kuò)增特異于黑素瘤癌癥的標(biāo)記。這樣，引物組與特異于那些標(biāo)記的核苷酸片斷互補(bǔ)。標(biāo)記包括下述的一個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選兩個(gè)或更多個(gè))酪氨酸酶(Seq.ID No.22)和MART1(Seq.ID No.21)。這些標(biāo)記的靈敏度和特異性超過90％。
反應(yīng)必須還包含一些特異信號(hào)檢測的手段。其優(yōu)選地，通過使用一個(gè)檢測來自所關(guān)注目標(biāo)序列聚合的DNA序列區(qū)域的試劑來完成。當(dāng)接合于關(guān)注的特異核苷酸序列時(shí)，檢測的優(yōu)選試劑提供了一個(gè)可檢測的信號(hào)差異。常常，這些方法涉及當(dāng)接合于所關(guān)注的序列時(shí)提供增加的熒光的核苷酸探針。創(chuàng)造性方法的PCR反應(yīng)過程典型地通過分析每個(gè)PCR引物組擴(kuò)增產(chǎn)物的相對(duì)速率來監(jiān)控。監(jiān)控?cái)U(kuò)增產(chǎn)物可以通過很多檢測試劑和方法來實(shí)現(xiàn)，不限于熒光引物，與雙鏈DNA相結(jié)合的熒光探針和熒光染料，分子信標(biāo)，scorpins及其它。監(jiān)控PCR反應(yīng)的常用方法采用熒光5’核酸酶檢測。這種方法使用某種熱穩(wěn)定性DNA聚合酶(如Taq或Tfl DNA聚合酶)的5’核酸酶活性在PCR過程中裂開一個(gè)寡聚探針。在延伸情況下，篩選低聚體來退火擴(kuò)增的目標(biāo)序列。探針典型的在其5’末端有一個(gè)熒光報(bào)告分子，在其3’末端有一個(gè)報(bào)告分子的熒光猝滅劑。只要低聚物是完整的，來自報(bào)告分子的熒光信號(hào)就被猝滅。但是，當(dāng)?shù)途畚镌谘由爝^程中被消化時(shí)，熒光報(bào)告分子不再接近猝滅。特定擴(kuò)增的無熒光標(biāo)記分子的相對(duì)積累可以與一個(gè)對(duì)照樣品和/或?qū)φ栈蚶绮幌抻讦?肌動(dòng)蛋白和PBDG(膽色素原脫氨酶)同樣擴(kuò)增的積累相比較，來決定RNA群中特定RNA的特定cDNA產(chǎn)物的相對(duì)豐度。熒光5’核酸酶檢測的產(chǎn)物和試劑很容易購買得到，如購自AppliedBiosystems。
優(yōu)選的檢測試劑是常稱作“scorpion”，描述于US專利6,326,145和5,525,494，在此合并用作參考。這些試劑包括一個(gè)或多個(gè)包含一個(gè)加尾引物和一個(gè)完整的信號(hào)系統(tǒng)的分子。該引物有一個(gè)模板結(jié)合區(qū)域與一個(gè)含有一個(gè)連接和一個(gè)目標(biāo)結(jié)合區(qū)域的尾巴。在尾巴中的目標(biāo)結(jié)合區(qū)域與引物的延伸產(chǎn)物的互補(bǔ)序列雜交。這種目標(biāo)特異性雜交事件與一個(gè)信號(hào)系統(tǒng)結(jié)合，其中雜交導(dǎo)致一個(gè)可檢測的改變。在PCR反應(yīng)中，合理地安排目標(biāo)結(jié)合區(qū)域與尾巴區(qū)域，以便使尾巴區(qū)域保持單鏈，即未拷貝的。這樣，尾巴區(qū)域在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中是不可擴(kuò)增的。連接包括一個(gè)防止聚合酶介導(dǎo)的鏈在引物模板上延伸的阻斷部分。
可以用于在PCR和QRT-PCR中控制和監(jiān)控?cái)U(kuò)增積累的儀器和軟件包括，購自Cepheid of Sunnyvale，California的Smart Cycle熱循環(huán)儀，和購自AppliedBiosystem的ABI Prism 7700序列檢測系統(tǒng)。
在優(yōu)選的RT-PCR反應(yīng)中，某種反轉(zhuǎn)錄酶和PCR反應(yīng)成分的量是非典型的，是為了利用一些熱循環(huán)儀較快的傾斜次數(shù)。尤其是當(dāng)引物濃度很高時(shí)。
典型用于反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)的基因特異性引物濃度低于20nM。為了取得一個(gè)1到2分鐘的快速反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄酶引物濃度升高到大于20nM，優(yōu)選至少大約50nM，典型的大約100nM。標(biāo)準(zhǔn)的PCR引物濃度為100nM到300nM。在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)中可以使用更高的濃度來補(bǔ)償Tm的變異。但是，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，參考引物濃度用于不需要Tm補(bǔ)償?shù)那闆r。當(dāng)需要或者期望進(jìn)行Tm補(bǔ)償時(shí)，可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定并使用相應(yīng)較高濃度的引物。為了實(shí)現(xiàn)快速PCR反應(yīng)，PCR引物濃度典型的大于250nM，優(yōu)選的大于300nM，典型的大約500nM。
商業(yè)上使用的診斷，優(yōu)選使用一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部陽性對(duì)照，其確定進(jìn)行一個(gè)陰性結(jié)果的特殊擴(kuò)增反應(yīng)。在一個(gè)RT-PCR反應(yīng)中，必須被控制的導(dǎo)致假陰性結(jié)果的可能原因包括不充足的RNA量，RNA降解，RT和/或PCR抑制以及試驗(yàn)誤差。在基因表達(dá)檢測中，優(yōu)選使用一個(gè)在所關(guān)注的組織中組成型表達(dá)的基因。由于幾個(gè)原因，PBGD(Seq ID No.20)常用作內(nèi)部對(duì)照的基因它在人體中沒有假基因，在人體組織中組成型表達(dá)，它以相對(duì)較低的水平表達(dá)，因此不太可能引起所關(guān)注的目標(biāo)序列擴(kuò)增的抑制。用PBGD作為對(duì)照，最小化或消除了由假陰性結(jié)果的所有可能來源產(chǎn)生的錯(cuò)誤結(jié)果。
商業(yè)化QRT-PCR用于檢測特定核苷酸序列的試劑盒的所述方法是特別有用的。在一個(gè)實(shí)施例中，試劑盒包括擴(kuò)增和檢測標(biāo)記的試劑。合適地，試劑盒包括從淋巴結(jié)組織提取核苷酸的樣品制備試劑和/或制品(如試管)。試劑盒也可以包括最小化樣品雜質(zhì)危害的制品(如淋巴結(jié)解剖和制備中的一次性解剖刀和表面)。
在一個(gè)優(yōu)選的試劑盒中，包括上述的一個(gè)管的QRT-PCR過程所必需的試劑，如反轉(zhuǎn)錄酶，一個(gè)反轉(zhuǎn)錄酶引物，一個(gè)相應(yīng)的PCR引物組(優(yōu)選用于標(biāo)記和對(duì)照)，一個(gè)熱穩(wěn)定性DNA聚合酶如Taq聚合酶，和一個(gè)合適的檢測試劑，例如，但不限于一個(gè)scorpion探針，一個(gè)熒光5’核酶檢測探針，一個(gè)分子信標(biāo)探針，一個(gè)雙鏈DNA特異性的單染料引物或熒光染料，如溴乙錠。引物的量優(yōu)選能產(chǎn)生上述高濃度。熱穩(wěn)定性DNA聚合酶是常用的并可購自多個(gè)制造商。試劑盒中的附加物質(zhì)可包括合適的反應(yīng)試管或小管，一個(gè)屏障組合物，典型地有一個(gè)蠟珠，合適地包括鎂；反轉(zhuǎn)錄和PCR階段的反應(yīng)混合物(典型地10X)，包括必需的緩沖液和試劑如dNTPs；去核酶或RNA酶的水；RNA酶抑制劑；對(duì)照核苷酸和/或任何附加緩沖液，化合物，協(xié)作因子(co-factor)，離子成分，蛋白質(zhì)和酶，聚合物，以及可用于反轉(zhuǎn)錄和/或QRT-PCR反應(yīng)PCR階段的類似物。合適地，試劑盒包括核苷酸提取試劑和物質(zhì)。
下面的非限制性實(shí)施例有助于更進(jìn)一步描述本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)時(shí)PCR本發(fā)明的實(shí)施例是基于實(shí)時(shí)PCR的使用。在實(shí)時(shí)PCR中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的產(chǎn)物在PCR指數(shù)期實(shí)時(shí)監(jiān)控而不是在終點(diǎn)進(jìn)行測量。因此，DNA和RNA的量準(zhǔn)確得多，而且是可重復(fù)的。熒光值在每個(gè)循環(huán)中都記錄，并代表在擴(kuò)增反應(yīng)中那個(gè)點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物的量。反應(yīng)開始時(shí)存在的模板量越多，達(dá)到其中熒光信號(hào)首次被記作統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著于背景的某個(gè)點(diǎn)所需要的循環(huán)數(shù)就越少，其被定義為Ct值。使用基于熒光的RT-PCR，閾值循環(huán)(Ct)概念產(chǎn)生準(zhǔn)確的和可重復(fù)的量。PCR產(chǎn)物的同源測定優(yōu)選的基于下述進(jìn)行(a)雙鏈接合染料(例如SYBRGreen)，(b)熒光探針(例如Taq Man探針，分子信標(biāo))，和(c)直接標(biāo)記引物(例如Amplifluor引物)。
實(shí)施例1使用Taqman檢測，比較用快速方法與用基于實(shí)時(shí)PCR的現(xiàn)有技術(shù)方法提取的RNA總共16個(gè)H&E陽性結(jié)節(jié)和15個(gè)H&E陰性乳結(jié)節(jié)樣品購自GenomicsCollaborative。從每個(gè)結(jié)節(jié)取兩個(gè)30mg的組織切片。
部分I(現(xiàn)有技術(shù)).一個(gè)30mg組織切片處理如下加入600μl的RLT緩沖液，樣品用一個(gè)一次性組織研磨機(jī)(cat 15704-126，VWR Scientific，West Chester，PA)手工均質(zhì)20-40秒。試管在Eppendorf型5415C微型離心機(jī)以最大速度離心3分鐘。上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新管中，加入1倍體積的70％乙醇。
樣品(700μl)加到一個(gè)置于QIA vac24真空歧管上的RNeasy小型柱，并用真空。RWI緩沖液(700μl)用于過濾通過該柱。RPE緩沖液(500μl)被滴加柱中并過濾通過。另一個(gè)500μl的RPE緩沖液被加入到柱中并過濾通過。RNeasy柱放到一個(gè)2ml的收集管中，并在一個(gè)微型離心機(jī)中以最大速度離心1分鐘。然后通過轉(zhuǎn)移RNeasy柱到一個(gè)新的1.5ml收集管柱，加入50μl去RNA酶水并以8000X.g離心1分鐘，將RNA從柱中被洗提出來。
部分II(快速提取)第二個(gè)30mg的乳結(jié)節(jié)組織切片通過下述方案處理(1)組織切片加入600μl的RLT緩沖液，并用一次性組織研磨機(jī)手工均質(zhì)20到40秒。(2)勻漿用一個(gè)QIAshredder柱以最大速度離心30秒。(3)加入1倍體積的70％乙醇到溶解產(chǎn)物中并吹打混合。(4)樣品(700μl)然后置于QIA vac24真空歧管上的Rneasy小型柱，并用真空。(5)700μl RWI緩沖液加入到柱中并過濾通過該柱。(6)500μl RPE緩沖液加入柱中并可以過濾通過。(7)把柱轉(zhuǎn)移到一個(gè)2ml的收集管中，并以10,000rpm離心30秒。(8)加入25μl去RNA酶水到膜上，柱子以10,000rpm離心30秒來洗提RNA?？焖俜桨钢械乃须x心步驟在10MVSS VWR型離心機(jī)上進(jìn)行。
提取的RNA被反轉(zhuǎn)錄，RNA和cDNA如前所述的進(jìn)行定量。
為了進(jìn)行Taqman檢測，Taqman Core試劑盒，Gene Amp 10X PCR緩沖液1，Amp Erase Uracil N-糖苷酶，和Ampli Taq金聚合酶都購自Applied Biosystems，F(xiàn)orster City，CA。其它的所有試劑來自如實(shí)施例1所述的商業(yè)來源。甘油購自SigmaChemical Co(St.Louis，Mo.)，Tween 20 購自Eastman OrganicChemicals(Rochester，NY)。
乳腺珠蛋白引物(Seq ID No.3和Seq ID No.4)由Invitrogen Crop.(Carlsbad，CA)合成，乳腺珠蛋白Taqman探針(Seq ID No.7)來自Epoch Bioscience(SanDiego，CA)。PBGD引物(Seq ID No.8和Seq ID No.9)由QIAGEN Operon(Alameda，CA)合成，探針(Seq ID No.23)由SYNTHEGEN，LLC(Houston，TX)合成。B305D引物(Seq ID No.11和Seq ID No.12)在Invitrogen Corp合成，探針(Seq ID No.13)由Applied Biosystems，Inc.合成，對(duì)于所有的Taqman探針，羧基熒光素(FAM)和羧基四甲基玫瑰精(TAMRA)用作染料和促滅對(duì)(quencherpair)。
SEQ ID NO.3 CAAACGGATG AAACTCTGAG CAATGTTGASEQ ID NO.4 TCTGTGAGCC AAAGG TCTTG.CAGASEQ ID NO.7 6-FAM-TGTTTATGCA ATTAATATAT GACAGCAGTCTTTGTG-TAMRA
SEQ ID NO.8 CTGAGGCACC TGGAAGGAGGSEQ ID NO.9 CATCTTCATG CTGGGCAGGGSEQ ID NO.23 6-FAM-CCTGAGGCAC CTGGAAGGAG GCTGCAG TGT-TAMRASEQ ID NO.11TCTGATAAAG GCCGTACAAT GSEQ ID NO.12 TCACGACTTG CTGTTTTTGC TCSEQ ID NO.13 6-FAM-ATCAAAAAACA AGCATGGCCTA CACC-TAMRA為了進(jìn)行Taqman檢測，一個(gè)主要混合物通過加入10μl的10X PCR緩沖液#1，14μl的25mM MgCl2，8μl 10mM各種dNTP，1μl的AmpErase UNG(1U/μl)，16μl甘油，1μl 1％w/v Tween 20，0.75μl AmpliTaq Gold(5U/μl)，來自一個(gè)5μM母液的每個(gè)引物各6μl，0.4μl的一個(gè)10μM的探針母液，和水達(dá)到一個(gè)96μl的終體積來制備。主要混合物(48μl)和2μl來自每個(gè)結(jié)節(jié)樣品的cDNA被加入到每個(gè)光學(xué)反應(yīng)微量滴定板小孔中。蓋上光學(xué)蓋子后，該板置于一個(gè)ABI Prism 7900HT序列測定系統(tǒng)(Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)orsterCity，CA)中進(jìn)行處理。商業(yè)試劑，和Taqman B-actin測定試劑購自AppliedBiosystems，(Forster City，CA)，測定根據(jù)制造商建議的方案進(jìn)行。一個(gè)0.02的閾值用于乳腺珠蛋白檢測的分析，0.03用于B305D檢測，0.08用于B-actin檢測，0.1用于PBDG檢測。Taqman檢測的三次測定的平均值如圖1和2所示。
在15個(gè)H&E陰性結(jié)節(jié)樣品和16個(gè)H&E陽性結(jié)節(jié)與兩個(gè)對(duì)照cDNA樣品中的管家基因B-肌動(dòng)蛋白與PBDG實(shí)時(shí)測定的比較如表1所示。這些試驗(yàn)的結(jié)果表明本發(fā)明的快速方法與標(biāo)準(zhǔn)商業(yè)方法(QIAGEN)獲得的Ct值一致性較好，說明用快速RNA提取方案提取的RNA與根據(jù)一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)商業(yè)方案提取的RNA能進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和RNA擴(kuò)增到一個(gè)相似的程度。
表2基于乳癌標(biāo)記乳腺珠蛋白和B305D的Ct值，用表1所評(píng)估的相同乳癌結(jié)節(jié)樣品比較了基因表達(dá)結(jié)果。為了確定是否基于實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的H&E陽性和H&E陰性乳癌結(jié)節(jié)樣品之間有一個(gè)相關(guān)，測定了H&E陰性結(jié)節(jié)樣品中的每個(gè)標(biāo)記乳腺珠蛋白和B305DH&E的最低Ct值。任意地，但保守地，H&E陰性樣品值低于這個(gè)最低值的2.5Ct值的關(guān)閉用于H&E陽性樣品。在表2中為陰影的樣品較高地表達(dá)兩個(gè)乳癌標(biāo)記，因?yàn)镃t值至少比在H&E陰性樣品中觀察到的Ct值低2.5Ct。使用本發(fā)明的快速方法和商業(yè)制造商推薦的方案(QIAGEN)測定的這些標(biāo)記的表達(dá)間有一個(gè)相關(guān)。
使用乳腺珠蛋白作為標(biāo)記，本發(fā)明的快速方法與QIAGEN RNA提取方案的15個(gè)H&E結(jié)節(jié)樣品的兩個(gè)樣品的Ct值之間沒有嚴(yán)格的相關(guān)。這些樣品中的GCLNC-24中，Ct值的差異是0.4，其在試驗(yàn)誤差的范圍之內(nèi)。第二個(gè)樣品顯示了一個(gè)大的Ct值差異。乳腺珠蛋白與B305D中較大的Ct值差異可能是由于在這些樣品中難于進(jìn)行光譜RNA定量以及已確定的淋巴結(jié)中轉(zhuǎn)移非均衡分布導(dǎo)致可能取樣問題。(Cserni.1999.通過徹底的組織病理學(xué)分析確定乳腺癌在腋窩崗哨淋巴結(jié)節(jié)中轉(zhuǎn)移(Metastases in axillary sentinel lymph nodes in breast cancer asdetected by intensive histopathological work up.)臨床病理學(xué)雜志(J.ClinPathol)，520922-924.)
表1使用Tapman測試測量看家基因B-肌動(dòng)蛋白和PBDG，比較用快速方法與現(xiàn)有技術(shù)的方法提取的RNA


關(guān)閉值 33.7 37.5 36.136.1
表2通過Taqman測試測量癌癥基因乳腺珠蛋白與B305D，比較用快速方法與現(xiàn)有技術(shù)的方法提取的RNA


關(guān)閉值＝ 33.7 37.5 36.1 36.1
實(shí)施例2.QIAshredder柱評(píng)估這個(gè)實(shí)施例的目的是為了證實(shí)在淋巴結(jié)細(xì)織均質(zhì)后使用QIAshredder柱，并離心勻漿僅30秒就可以產(chǎn)生可接受的RNA提取物。
從Genomics Collabrative(Cambridge，MA)獲得了一個(gè)H&E陰性乳腋結(jié)節(jié)。一個(gè)490mg的組織切片于5.5ml的緩沖液RLT中混合，均質(zhì)結(jié)節(jié)。600微升的勻漿被移走，RNA用實(shí)施例1中所述的快速提取進(jìn)行提取。作為對(duì)照，另一個(gè)600μl的勻漿，除其中3分鐘的離心替換QIAshredder柱外，使用同樣的快速RNA提取方法處理。對(duì)每個(gè)反應(yīng)得到的RNA如實(shí)施例1所述進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和定量。使用Taqman探針進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。
這些研究的結(jié)果表明，包含QIAshredder方法的方案與離心方案有相似的RNA產(chǎn)量，分別為0.31μg/μl和0.34μg/μl。在兩個(gè)樣品中獲得了顯示高質(zhì)量RNA的同樣的2.1的260/280nm比值。實(shí)時(shí)RNA檢測也表明了，與離心方法相比，用QIAshredder柱提取的RNA具有相似的乳腺珠蛋白Ct值(22.5對(duì)2.0)，以及B305D(26.7對(duì)26.6)，看家基因PBDG(29.1對(duì)29.0)和B-肌動(dòng)蛋白(SEQ IDNO19，18.5對(duì)18.2)。
總的來說，這個(gè)試驗(yàn)具有與在均質(zhì)后用含有QLAshredder代替一個(gè)3分鐘離心步驟的方法相似的RNA產(chǎn)量、質(zhì)量和實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增結(jié)果。這使進(jìn)行RNA提取所需的時(shí)間減少了2.5分鐘，其在開發(fā)適于手術(shù)中和其中需要影響患者治療的快速結(jié)果的其它應(yīng)用的方案中是重要的。
實(shí)施例3.溶解產(chǎn)物的稀釋對(duì)RNA產(chǎn)量和精確度的影響下面的實(shí)施例闡述了溶解產(chǎn)物的稀釋對(duì)RNA產(chǎn)量和RNA回收(recovery)精度的影響。在這個(gè)實(shí)施例中，切取20mg，10mg或5mg的冷凍豬結(jié)節(jié)組織。組織用50ml組織研磨機(jī)研磨30秒，并攪拌樣品。對(duì)于每個(gè)結(jié)節(jié)稱重重復(fù)三次。將1ml各個(gè)溶解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到一個(gè)1.7ml微型離心機(jī)的離心管中，然后在Eppendorf微型超速離心機(jī)中以最大速度(14,000RPM)離心30秒鐘。700μL樣品通過QIA切碎筒離心，以最大速度離心30秒鐘。然后如先前在實(shí)施例2的第I部分步驟4-8所述，洗滌該柱、干燥和洗提RNA。通過Gene Spec II定量RNA。這些試驗(yàn)的結(jié)果顯示于表5中，說明與含有10mg和20mg的重量較大的樣品相比，在600ml均質(zhì)緩沖液中均質(zhì)的重2.5mg的初始結(jié)節(jié)組織具有優(yōu)良的精確度。這些結(jié)果表明在較低結(jié)節(jié)重量時(shí)能獲得改進(jìn)的RNA回收精確度。同時(shí)，可以預(yù)期較稀的勻漿可以更快地濾過柱，并且將更不易存在過濾器堵塞的問題。
實(shí)施例4.淋巴結(jié)樣品RNA的Taqman測試反轉(zhuǎn)錄由20μg總RNA于42℃在一個(gè)250μl的反應(yīng)液中反應(yīng)60分鐘合成cDNA，該反應(yīng)液含有50mM Tris-Cl pH8.3，7.5mMKCl，3mM MgCl2，10mM DTT，2000U上標(biāo)(Superscript)，400U Rnasin，2μg寡dT引物，0.08mg/mlBSA和ACT，CTP，GTP和TTP各0.2mM。生成的cDNA與水以1∶8稀釋。
PCR擴(kuò)增稀釋的cDNA各2μl以每孔50ml的總體積在Applied Biosystems7900中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增按以下方案進(jìn)行50℃ 2min，95℃ 10min，然后進(jìn)行(95℃ 15sec，60℃ 1min(B276為58℃)，68℃ 1min)40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)混合成分和終濃度如下1X Taqman緩沖液A(ABI)，3.5mM MgCl2，0.2mM dGTP，dCTP和cATP，0.4mM dUTP(ABI)，0.01U/μl AmpErase UNG(ABI)，0.375U/μl AmpliTaqGold(ABI)，8％甘油(Sigma)，0.01％Tween 20(Kodak)，引物各0.3μM(Invitrogen)，去Rnase/Dnase水(Sigma)，40nM 5’-FAM，3’-TAMRA寡核苷酸探針(Synthegen)。在由PCR產(chǎn)物增加引起熒光強(qiáng)度增加的對(duì)數(shù)線性范圍內(nèi)，相對(duì)于內(nèi)比染料(ROX)的信號(hào)閾值賦予各個(gè)引物/探針組。結(jié)果的Ct值用于確定所有測試樣品基因的相對(duì)表達(dá)。
所用的引物乳腺珠蛋白引物1，SEQ ID NO 3-CAAACGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA引物2，SEQ ID NO 4-TCTGTGAGCCAAAGGTCTTGCAGA探針，SEQ ID NO 7-FAM-TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTTTGTG-TAMRAB305D引物1，SEQ ID NO 11-TCTGATAAAGGCCGTACAATG引物2，SEQ ID NO 12-TCACGACTTGCTGTTTTTGCTC探針，SEQ ID NO 24-FAM ATCAAAAAACAAGCATGGCCTCACACC
PBGD引物1，SEQ ID NO 25-CTGCTTCGCTGCATCGCTGAAA引物2，SEQ ID NO 26-CAGACTCCTCCAGTCAGGTACA探針，SEQ ID NO 23-FAM-CCTGAGGCACCTGGAAGGAGGCTGCAGTGT-TAMRAPIP引物1，SEQ ID NO 27-GCTTGGTGGTTAAAACTTACC引物2，SEQ ID NO 28，-TGAACAGTTCTGTTGGTGTA探針，SEQ ID NO 29-FAM-CTGCCTGCCTATGTGACGACAATCCGG-TAMRAGABA引物1，SEQ ID NO 30-CAATTTTGGTGGAGAACCCG引物2，SEQ ID NO 31-GCTGTCGGAGGTATATGGTG探針，SEQ ID NO 32-FAM CATTTCAGAGAGTAACATGGACTACACATAMRAB726引物1，SEQ ID NO 33-GCAAGTGCCAATGATCAGAGG引物2，SEQ ID NO 34-ATATAGACTCAGGTATACACACT探針，SEQ ID NO 35-FAM TCCCATCAGAATCCAAACAAGAGGAAG結(jié)果附表包含獲得的11個(gè)組織學(xué)陰性和24個(gè)組織學(xué)陽性淋巴結(jié)的Ct值。通過從組織學(xué)陽性樣品觀察到的最小Ct值減去2.5個(gè)循環(huán)來確定每個(gè)標(biāo)記的陽性關(guān)閉。陽性樣品用陰影表示?；谶@些標(biāo)準(zhǔn)，確定單個(gè)標(biāo)記的檢測速率。乳腺珠蛋白與B305DA/C組合檢測23/24個(gè)組織學(xué)陽性樣品，獲得最佳互補(bǔ)。乳腺珠蛋白，B305D和GABA的組合檢測所有的24個(gè)樣品。見表3。
表3 cutoff 33.8 32.3 33.333.6 37.5檢測的陽性樣品 19/24 17/24 21/24 10/24 11/24
實(shí)施例5.多標(biāo)記反轉(zhuǎn)錄由20μg總RNA于42℃在一個(gè)100μl的反應(yīng)液中利用錨定寡dT引物反應(yīng)60分鐘合成cDNA。稀釋的cDNA各20ng以每孔50ml的總體積在AppliedBiosystems7900中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增按以下方案進(jìn)行94℃ 2min，然后進(jìn)行(94℃ 15sec，62℃ 15sec及72℃ 45sec)50個(gè)循環(huán)。反應(yīng)混合成分和終濃度如下1X PCR緩沖液(ABI)，2.5Mm終MgCl2，0.05mM dGTP，dCTP，cATP和TTP，0.05U/μl含有一個(gè)超過5-20X的2種抗-Taq抗體(TP4-9和TP1-12)的Taq聚合酶，引物各0.2μM(Invitrogen)，去Rnase/Dnase水(Sigma)和一個(gè)SYBRGreen母液(Sigma)的1∶20000的稀釋液。擴(kuò)增引物序列與那些用于淋巴結(jié)的TaqMan測試的一致。一個(gè)275熒光單位常用的閾值用于測定Ct值。Ct值然后轉(zhuǎn)換為定量基因表達(dá)并相對(duì)于一個(gè)假定為從背景表達(dá)區(qū)分淋巴結(jié)所需的基因表達(dá)的最小水平的關(guān)閉值進(jìn)行劃分。
所用的引物乳腺珠蛋白引物1，SEQ ID NO 3-CAAACGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA引物2，SEQ ID NO 4-TCTGTGAGCCAAAGGTCTTGCAGAB305D引物1，SEQ ID NO 11-TCTGATAAAGGCCGTACAATG引物2，SEQ ID NO 12-TCACGACTTGCTGTTTTTGCTC圖3-5中顯示的數(shù)據(jù)表明了組合基因乳腺珠蛋白與B305D信號(hào)對(duì)獲得大量的乳癌樣品的平均值的作用。
實(shí)施例5純化的RNA的快速RT-PCR將乳腺珠蛋白體外轉(zhuǎn)錄RNA(100,000拷貝)稀釋到20ng白血細(xì)胞RNA中，并在一個(gè)Cepheid Smart CyclerII中于一個(gè)含有下述成分的反應(yīng)液中進(jìn)行一步RT-PCR擴(kuò)增50mM N-二(羥乙基)甘氨酸/氫氧化鉀，pH 8.2，115mM醋酸鉀，8％v/v甘油，0.2mg/mlBSA，150mM海藻糖，0.2％v/v Tween20，0.2mM Tris-HClpH8，3.5mM硫酸錳，0.3mM dATP，0.3mM dCTP，0.3mM dGTP，0.3mM dTTP，100U/ml Tth，20μg/ml抗體TP6-25.3，0.45μM乳腺珠蛋白Scorpion和0.5μM乳腺珠蛋白引物。
PCR反應(yīng)條件如下(星號(hào)表明其中熒光被測定的循環(huán)部分)條件A-95℃ 3sec，60℃ 7min，70℃ 2min，然后40個(gè)循環(huán)(95℃ 3sec，54℃6sec*，68℃ 6sec)-總時(shí)間＝34min條件B-95℃ 3sec，60℃ 3min，然后40個(gè)循環(huán)(95℃ 3sec，54℃ 6sec*，68℃6sec)-總時(shí)間＝29min條件C-95℃ 3sec，60℃ 3min，然后40個(gè)循環(huán)(95℃ 3sec，58℃ 6sec*，68℃6sec)-總時(shí)間＝26min這個(gè)檢測的結(jié)果如下表所示

從數(shù)據(jù)可以看出，把反轉(zhuǎn)錄步驟由9min減少到3min對(duì)檢測沒有可觀察到的影響。把退火溫度升高到58℃對(duì)擴(kuò)增只有最小的影響，并把總的RT-PCR時(shí)間減少到了26min?？梢酝ㄟ^引物和探針結(jié)構(gòu)和較高的最佳檢測溫度來進(jìn)一步減少循環(huán)的時(shí)間。
實(shí)施例6檢測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的快速多元RT-PCR檢測(預(yù)后的)在這個(gè)實(shí)施例中，純化的淋巴結(jié)RNA(每100μl反應(yīng)液中≥100ng總RNA用于減少產(chǎn)生陽性結(jié)果所需的循環(huán)數(shù))在一個(gè)Cepheid Smart Cycler II中進(jìn)行一步RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)液含有下述成分50mM N-二(羥乙基)甘氨酸/氫氧化鉀，pH8.2，115mM醋酸鉀，8％v/v甘油，0.2mg/ml BSA，150mM海藻糖，0.2％v/v Tween20，0.2mM Tris-Cl，pH 8，3.5mM硫酸錳或醋酸錳，0.3mM dATP，0.3mM dCTP，0.3mM dGTP，0.3mM dTTP，100U/ml Tth，20μg/ml抗體TP6-25.3，Scorpion和引物各0.4-0.8μM。Scorpion和引物序列設(shè)計(jì)成使非特異性引物事件最小化，而且與具有下述的快速RT-PCR模式的多元擴(kuò)增/檢測諧調(diào)95℃ 3sec，60℃ 3min，然后32個(gè)循環(huán)95℃ 1sec，65℃ 6sec*，72℃ 3sec)-總擴(kuò)增時(shí)間＝16min。
描述的快速樣品制備方法需要≤4min完成(參考申請中的樣品制備實(shí)施例)，結(jié)果總的檢測時(shí)間≤20min。
為了檢測乳癌轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)，擴(kuò)增了下述基因乳腺珠蛋白，B305D和PBGD。乳腺珠蛋白和/或B305D信號(hào)指示轉(zhuǎn)移，而PBGD用作一個(gè)看家基因。該實(shí)施例中，癌癥陽性淋巴結(jié)的Ct值范圍為乳腺珠蛋白的是12-30，B305D的是12-28-在該Ct范圍內(nèi)檢測任一基因都能指示一個(gè)癌癥陽性淋巴結(jié)。該實(shí)施例中，對(duì)照基因PBGD的Ct值必須落在24-30個(gè)循環(huán)的范圍內(nèi)，以使一個(gè)癌癥陰性結(jié)果被認(rèn)為是有效的。
為了檢測黑素瘤轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)，利用同樣的條件，除了下述以外(1)處理懷疑含有黑素瘤的淋巴結(jié)和(2)擴(kuò)增以下基因MART，酪氨酸酶和PBGD。MART1和/或酪氨酸酶信號(hào)指示黑素瘤轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)，而PBGD用作一個(gè)看家基因。該實(shí)施例中，癌癥陽性淋巴結(jié)的Ct值范圍為酪氨酸酶的是18-30，MART1的是12-27-在該范圍內(nèi)檢測任一基因都能指示一個(gè)癌癥陽性淋巴結(jié)。該實(shí)施例中，對(duì)照基因PBGD的Ct值必須落在24-30個(gè)循環(huán)的范圍內(nèi)，以使一個(gè)癌癥陰性結(jié)果被認(rèn)為是有效的。
序列表CPCH0461241<110>Johnson & JohnsonAtkins，DavidBackus，JohnBelly，RobertRosen，StevenWhite，Robert<120>手術(shù)中淋巴結(jié)檢測<130>CDS 5009<160>35<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列<400>1atgactgcct tgcctcctca gta23<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是引物<400>2ggctgttgct tggacttctc taaaga 26<210>3<211>29<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列是引物<400>3caaacggatg aaactctgag caatgttga 29<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是引物<400>4tctgtgagcc aaaggtcttg caga 24<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是引物<400>5ggccaacaaa gctcaggaca aca23<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是引物<400>6gcagtgactt cgtcatttgg acgta 25
<210>7<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是一個(gè)探針<400>7tgtttatgca attaatatat gacagcagtc tttgtg 36<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是引物<400>8ctgaggcacc tggaaggagg20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是引物<400>9catcttcatg ctgggcaggg20<210>10<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是引物
<400>10ctgaggcacc tggaaggagg ctgcagtgt 29<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是引物<400>11tctgataaag gccgtacaat g 21<210>12<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是引物<400>12tcacgacttg ctgtttttgc tc 22<210>13<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列是一個(gè)探針<400>13atcaaaaaac aagcatggcc tacacc 26<210>14<211>1155<212>DNA
<213>人類的<400>14atggtggttg aggttgattc catgccggct gcctcttctg tgaagaagcc atttggtctc 60aggagcaaga tgggcaagtg gtgctgccgt tgcttcccct gctgcaggga gagcggcaag120agcaacgtgg gcacttctgg agaccacgac gactctgcta tgaagacact caggagcaag180atgggcaagt ggtgccgcca ctgcttcccc tgctgcaggg ggagtggcaa gagcaacgtg240ggcgcttctg gagaccacga cgactctgct atgaagacac tcaggaacaa gatgggcaag300tggtgctgcc actgcttccc ctgctgcagg gggagcagca agagcaaggt gggcgcttgg360ggagactacg atgacagtgc cttcatggag cccaggtacc acgtccgtgg agaagatctg420gacaagctcc acagagctgc ctggtggggt aaagtcccca gaaaggatct catcgtcatg480ctcagggaca ctgacgtgaa caagcaggac aagcaaaaga ggactgctct acatctggcc540tctgccaatg ggaattcaga agtagtaaaa ctcctgctgg acagacgatg tcaacttaat600gtccttgaca acaaaaagag gacagctctg ataaaggccg tacaatgcca ggaagatgaa660tgtgcgttaa tgttgctgga acatggcact gatccaaata ttccagatga gtatggaaat720accactctgc actacgctat ctataatgaa gataaattaa tggccaaagc actgctctta780tatggtgctg atatcgaatc aaaaaacaag catggcctca caccactgtt acttggtgta840catgagcaaa aacagcaagt cgtgaaattt ttaattaaga aaaaagcgaa tttaaatgca900ctggatagat atggaaggac tgctctcata cttgctgtat gttgtggatc agcaagtata960gtcagccttc tacttgagca aaatattgat gtatcttctc aagatctatc tggacagacg 1020gccagagagt atgctgtttc tagtcatcat catgtaattt gccagttact ttctgactac 1080aaagaaaaac agatgctaaa aatctcttct gaaaacagca atccagaaaa tgtctcaaga 1140accagaaata aataa1155
<210>15<211>3865<212>DNA<213>人類的<400>15tccgagctga ttacagacac caaggaagat gctgtaaaga gtcagcagcc acagccctgg 60ctagctggcc ctgtgggcat ttattagtaa agttttaatg acaaaagctt tgagtcaaca120cacccgtggg taattaacct ggtcatcccc accctggaga gccatcctgc ccatgggtga180tcaaagaagg aacatctgca ggaacacctg atgaggctgc acccttggcg gaaagaacac240ctgacacagc tgaaagcttg gtggaaaaaa cacctgatga ggctgcaccc ttggtggaaa300gaacacctga cacggctgaa agcttggtgg aaaaaacacc tgatgaggct gcatccttgg360tggagggaac atctgacaaa attcaatgtt tggagaaagc gacatctgga aagttcgaac420agtcagcaga agaaacacct agggaaatta cgagtcctgc aaaagaaaca tctgagaaat480ttacgtggcc agcaaaagga agacctagga agatcgcatg ggagaaaaaa gaagacacac540ctagggaaat tatgagtccc gcaaaagaaa catctgagaa atttacgtgg gcagcaaaag600gaagacctag gaagatcgca tgggagaaaa aagaaacacc tgtaaagact ggatgcgtgg660caagagtaac atctaataaa actaaagttt tggaaaaagg aagatctaag atgattgcat720gtcctacaaa agaatcatct acaaaagcaa gtgccaatga tcagaggttc ccatcagaat780ccaaacaaga ggaagatgaa gaatattctt gtgattctcg gagtctcttt gagagttctg840caaagattca agtgtgtata cctgagtcta tatatcaaaa agtaatggag ataaatagag900aagtagaaga gcctcctaag aagccatctg ccttcaagcc tgccattgaa atgcaaaact960ctgttccaaa taaagccttt gaattgaaga atgaacaaac attgagagca gatccgatgt 1020tcccaccaga atccaaacaa aaggactatg aagaaaattc ttgggattct gagagtctct 1080gtgagactgt ttcacagaag gatgtgtgtt tacccaaggc tacacatcaa aaagaaatag 1140
ataaaataaa tggaaaatta gaagagtctc ctaataaaga tggtcttctg aaggctacct 1200gcggaatgaa agtttctatt ccaactaaag ccttagaatt gaaggacatg caaactttca 1260aagcagagcc tccggggaag ccatctgcct tcgagcctgc cactgaaatg caaaagtctg 1320tcccaaataa agccttggaa ttgaaaaatg aacaaacatt gagagcagat gagatactcc 1380catcagaatc caaacaaaag gactatgaag aaagttcttg ggattctgag agtctctgtg 1440agactgtttc acagaaggat gtgtgtttac ccaaggctrc rcatcaaaaa gaaatagata 1500aaataaatgg aaaattagaa gggtctcctg ttaaagatgg tcttctgaag gctaactgcg 1560gaatgaaagt ttctattcca actaaagcct tagaattgat ggacatgcaa actttcaaag 1620cagagcctcc cgagaagcca tctgccttcg agcctgccat tgaaatgcaa aagtctgttc 1680caaataaagc cttggaattg aagaatgaac aaacattgag agcagatgag atactcccat 1740cagaatccaa acaaaaggac tatgaagaaa gttcttggga ttctgagagt ctctgtgaga 1800ctgtttcaca gaaggatgtg tgtttaccca aggctrcrca tcaaaaagaa atagataaaa 1860taaatggaaa attagaagag tctcctgata atgatggttt tctgaaggct ccctgcagaa 1920tgaaagtttc tattccaact aaagccttag aattgatgga catgcaaact ttcaaagcag 1980agcctcccga gaagccatct gccttcgagc ctgccattga aatgcaaaag tctgttccaa 2040ataaagcctt ggaattgaag aatgaacaaa cattgagagc agatcagatg ttcccttcag 2100aatcaaaaca aaagaasgtt gaagaaaatt cttgggattc tgagagtctc cgtgagactg 2160tttcacagaa ggatgtgtgt gtacccaagg ctacacatca aaaagaaatg gataaaataa 2220gtggaaaatt agaagattca actagcctat caaaaatctt ggatacagtt cattcttgtg 2280aaagagcaag ggaacttcaa aaagatcact gtgaacaacg tacaggaaaa atggaacaaa 2340tgaaaaagaa gttttgtgta ctgaaaaaga aactgtcaga agcaaaagaa ataaaatcac 2400agttagagaa ccaaaaagtt aaatgggaac aagagctctg cagtgtgaga ttgactttaa 2460
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atgatcgggt cccgcacttc tcttcccaac accaactgct tcatcaaggc catcgatgtg 1080tacctgggga tctgctttag ctttgtgttt ggggccttgc tagaatatgc agttgctcac 1140tacagttcct tacagcagat ggcagccaaa gataggggga caacaaagga agtagaagaa 1200gtcagtatta ctaatatcat caacagctcc atctccagct ttaaacggaa gatcagcttt 1260gccagcattg aaatttccag cgacaacgtt gactacagtg acttgacaat gaaaaccagc 1320gacaagttca agtttgtctt ccgagaaaag atgggcagga ttgttgatta tttcacaatt 1380caaaacccca gtaatgttga tcactattcc aaactactgt ttcctttgat ttttatgcta 1440gccaatgtat tttactgggc atactacatg tatttttgag tcaatgttaa atttcttgca 1500tgccataggt cttcaacagg acaagataat gatgtaaatg gtattttagg ccaagtgtgc 1560acccacatcc aatggtgcta caagtgactg aaataatatt tgagtctttc tgctcaaaga 1620atgaagctcc aaccattgtt ctaagctgtg tagaagtcct agcattatag gatcttgtaa 1680tagaaacatc agtccattcc tctttcatct taatcaagga cattcccatg gagcccaaga 1740ttacaaatgt actcagggct gtttattcgg tggctccctg gtttgcattt acctcatata 1800aagaatggga aggagaccat tgggtaaccc tcaagtgtca gaagttgttt ctaaagtaac 1860tatacatgtt ttttactaaa tctctgcagt gcttataaaa tacattgttg cctatttagg 1920gagtaacatt ttctagtttt tgtttctggt taaaatgaaa tatgggctta tgtcaattca 1980ttggaagtca atgcactaac tcaataccaa gatgagtttt taaataatga atattattta 2040ataccacaac agaattatcc ccaatttcca ataagtccta tcattgaaaa ttcaaatata 2100agtgaagaaa aaattagtag atcaacaatc taaacaaatc cctcggttct aagatacaat 2160ggattcccca tactggaagg actctgaggc tttattcccc cactatgcat atcttatcat 2220tttattatta tacacacatc catcctaaac tatactaaag cccttttccc atgcatggat 2280ggaaatggaa gatttttttg taacttgttc tagaagtctt aatatgggct gttgccatga 2340
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<223>人工序列是一個(gè)探針<400>35tcccatcaga atccaaacaa gaggaag2權(quán)利要求
1.一種進(jìn)行手術(shù)中分子診斷檢測的方法，包括的步驟為從患者獲得一個(gè)淋巴結(jié)組織樣品；通過核苷酸擴(kuò)增和檢測分析樣品；并確定是否存在超過關(guān)閉值的多個(gè)標(biāo)記。
2.用于檢測微轉(zhuǎn)移的權(quán)利要求1的方法。
3.用于檢測乳腺癌微轉(zhuǎn)移的權(quán)利要求1的方法。
4.用于檢測黑素瘤微轉(zhuǎn)移權(quán)利要求1的方法。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述的標(biāo)記檢測相應(yīng)于Seq ID 17的基因和選自Seq ID Nos14-16和Seq ID No 18中的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述所有步驟在一個(gè)外科手術(shù)程序過程中進(jìn)行。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述的核苷酸擴(kuò)增和檢測通過PCR進(jìn)行。
8.用于檢測微轉(zhuǎn)移的權(quán)利要求7的方法。
9.用于檢測乳癌微轉(zhuǎn)移的權(quán)利要求7的方法。
10.用于檢測黑素瘤微轉(zhuǎn)移的權(quán)利要求7的方法。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述的標(biāo)記是Seq ID No 21和Seq ID No 22。
12.權(quán)利要求7的方法，其中所述的PCR是RT-PCR。
13.權(quán)利要求12的方法，其中反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)進(jìn)行少于9分鐘。
14.權(quán)利要求13的方法，其中反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)進(jìn)行約3分鐘。
15.權(quán)利要求12的方法，其中一個(gè)或多個(gè)內(nèi)對(duì)照試劑被加入到反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中。
16.權(quán)利要求1的方法，其中通過以下步驟從淋巴結(jié)中提取RNA(a)溶解含有感興趣RNA的細(xì)胞，并使其成為勻漿，(b)任選地，稀釋該勻漿，(c)使該濕的勻質(zhì)工作樣品與基質(zhì)接觸，其中所述基質(zhì)含有或粘附有與RNA結(jié)合的物質(zhì)，(d)使樣品與基質(zhì)接合，(e)去除雜質(zhì)和干擾物，(f)干燥基質(zhì)，和(g)從基質(zhì)質(zhì)上洗提RNA；并在提取步驟中應(yīng)用過濾。
17.一種進(jìn)行手術(shù)中淋巴結(jié)檢測的試劑盒，包括核苷酸擴(kuò)增和檢測試劑。
18.權(quán)利要求17的試劑盒，其中所述的試劑包括具有檢測存在選自Seq IDNo.14-18和Seq ID No21-22的標(biāo)記的序列的引物。
19.權(quán)利要求18的試劑盒，其中所述的引物選自包括Seq ID No1-6，8-12，25-28和33-35。
20.權(quán)利要求17的試劑盒還包括RT-PCR試劑。
21.一種方法，包括進(jìn)行手術(shù)中分子診斷檢測和根據(jù)這種檢測的結(jié)果治療患者，其中該檢測包括以下步驟從患者獲得一個(gè)淋巴結(jié)組織樣品；通過核苷酸擴(kuò)增和檢測分析樣品；并確定是否存在超過關(guān)閉值的多個(gè)標(biāo)記。
全文摘要
在一個(gè)微轉(zhuǎn)移的手術(shù)中淋巴結(jié)檢測中，外科醫(yī)生根據(jù)已知的方法在外科手術(shù)中確定崗哨淋巴結(jié)。崗哨結(jié)節(jié)被切除并準(zhǔn)備用于核苷酸的提取。然后從崗哨結(jié)節(jié)中快速提取核苷酸(如RNA)。指示微轉(zhuǎn)移的標(biāo)記，如果存在，然后被擴(kuò)增和檢測。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1618987SQ20041005952
公開日2005年5月25日 申請日期2004年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月1日
發(fā)明者D·阿特金斯, J·巴庫斯, R·貝利, S·羅森, R·懷特 申請人:維里德克斯有限責(zé)任公司