專利名稱：鵝細小病毒vp1與vp3基因非重疊序列原核表達蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種基因工程制品的制作方法，具體地說是一種鑒別鵝細小病毒抗體及鵝細小病毒VP3基因亞單位抗體的VP1與VP3基因非重疊序列原核表達蛋白抗原及其制備方法。
背景技術(shù)：
鵝細小病毒(Goose parvovirus，GPV)是鵝細小病毒感染(俗稱小鵝瘟或Derzsy’s病)的病原。該病是養(yǎng)鵝業(yè)危害最大的傳染病之一，感染鵝的死亡率在90-100％。自1956年發(fā)現(xiàn)本病以來，在全世界各養(yǎng)鵝國家和地區(qū)均有發(fā)生，造成巨大的經(jīng)濟損失。對于該病的防制，目前主要應(yīng)用GPV全病毒疫苗進行預(yù)防，全病毒滅活苗及弱毒苗有較高的保護率，但是應(yīng)用全毒疫苗后的確存在散毒、潛伏感染，尤其對自然感染抗體及全毒疫苗免疫抗體無法進行鑒別，導(dǎo)致小鵝瘟免疫的地區(qū)在發(fā)生疫情時無法進行有效的監(jiān)測，無法采取有效的防制措施。而解決這一難題的唯一途徑就是研究和開發(fā)VP3基因工程疫苗，而VP1-VP3抗原為基礎(chǔ)的鑒別方法的建立是VP3基因工程疫苗能夠?qū)嶋H應(yīng)用的先決條件。因此研究和應(yīng)用鵝細小病毒VP1-VP3基因片段原核表達產(chǎn)物具有重要的應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種鵝細小病毒VP1與VP3基因非重疊序列原核表達蛋白及其制備方法。其目的在于提供一種鑒別鵝細小病毒抗體與鵝細小病毒VP3基因亞單位抗體的無散毒危險、穩(wěn)定性好、靈敏度高、可實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)、成本低的原核表達檢測抗原及其制備方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的鵝細小病毒VP1與VP3基因非重疊序列原核表達蛋白它是一種鵝細小病毒衣殼蛋白核苷酸VP1與VP3基因非重疊序列原核表達產(chǎn)物，VP1-VP3基因片段含有594個堿基，編碼198個氨基酸殘基，在用原核表達載體pGEX-6p-1進行表達時，VP1-VP3基因片段與融合表達載體上的谷胱苷肽前導(dǎo)肽得到融合表達，融合蛋白的分子量大小約為47KU。
其非重疊序列的核苷酸序列及其推倒的氨基酸序列為
ATGCGGAATCTGAAAGCTGGAGCCCCTCAGCCAAAACCAAACCAGCAGTCTCAGTCTGTG1 M R N L K A G A P Q P K P N Q Q S Q S V61 TCTCCAGACAGAGAACCCGAACGAAGAGATAATAATCGGGGCTTTGTACTTCCTGGCTAT21S P D R E P E R R D N N R G F V L P G Y121 AAGTATCTTGGGCCTGGTAACGGCCTTGATAAAGGCCCACCTGTCAATAACGCGGACACC41K Y L G P G N G L D K G P P V N N A D T181 GTCGCGCTTGAACACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTTAAAGCGGGAGACAATCCATAT61V A L E H D K A Y D Q Q L K A G D N P Y241 ATAAAATTCAATCACGCTGACCAGGACTTTATAGATAGTCTCCAAGACGACCAGTCATTC81I K F N H A D Q D F I D S L Q D D Q S F301 GGAGGTAATCTTGGAAAGGCTGTATTTCAGGCCAAAAAACGTATCTTAGAGCCATTTGGC101 G G N L G K A V F Q A K K R I L E P F G361 CTAGTAGAAGATCCTATCAACACGGCACCTGCAAAAAAAAATACAGGGAAGCTTACTGAC121 L V E D P I N T A P A K K N T G K L T D421 CATTACCCGGTAGTTAAGAAGCCTAAACTTACCGAGGAAGTCAGTGCGGGAGGTGGTAGC141 H Y P V V K K P K L T E E V S A G G G S481 AGTGCCGTAGAAGACGGAGGAGCCACCGCGGAGGGCACCGAACCTGTGCGGCCG161 S A V E D G G A T A E G T E P V R P本發(fā)明的產(chǎn)品是這樣制備的(1)、設(shè)計擴增GPV PV1-VP3基因的特異性引物；(2)、通過PCR擴增獲得VP1-VP3基因片段；(3)、對VP1-VP3基因進行克隆、測序鑒定；(4)、將VP1-VP3基因定向亞克隆至pGEX-6p-1原核表達載體；(5)、VP1-VP3基因在大腸桿菌的誘導(dǎo)表達；將重組表達質(zhì)粒pGEX-6p-(VP1-VP3)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plysS，進行表達；(6)、VP1-VP3基因表達蛋白的親合層析純化，主要包括①待純化樣的制備離心收集表達細菌離心取沉淀，用1mol/L、pH7.4的PBS洗滌3次，將沉淀用PBS溶液重懸起；裂解菌體獲取上清可溶性蛋白與包涵體沉淀加入溶菌酶至重量體積比終濃度為1％，冰浴30min，然后進行超聲處理，離心取上清并加入1％的TritionX-100及DTT至終濃度為1mmol/L后于-20℃保存，以備純化，沉淀即為包涵體；
包涵體的裂解及可溶性蛋白的回收包涵體用30％蔗糖、100mol/LNaCl、50mmol/L Tris、1％TritionX-100組成的pH8.0的包涵體洗滌液洗滌2次，加入由1.5％N-十二烷基肌氨酸鈉、25mmol/L三乙醇胺、1mmol/LEDTA組成的pH8.0的包涵體裂解液重懸，4℃處理2h，再超聲處理，除去不溶性沉淀，取上清即為可溶性包涵體蛋白，可溶性上清按上述方法處理；②表達蛋白的純化前復(fù)性上清中加入終濃度為2％的Trition X-100，加入9倍體積的由0.8mmol/L氧化型谷胱苷肽GSSH、2mmol/L還原型谷胱苷肽GSH、2mmol/LEDTA、20mmol/L Tris組成的pH8.5的復(fù)性緩沖液，用0.01mol/L PBS、pH7.4透析48h，取出復(fù)性的包涵體蛋白液，經(jīng)聚乙醇-8000進行濃縮，加入2％的Trition X-100后，于-20℃保存?zhèn)溆诩兓籚P1-VP3基因原核表達蛋白的親合層析純化包括①用20ml PBS沖洗柱子，以洗去保存液；②用6ml PBS+1％ Trition X-100進行平衡凝膠層；③往柱內(nèi)加樣，每次加2ml樣，加樣后于27℃溫箱中感作30min，然后才棄掉流出液，釋放的速率要求1滴/30秒；④用10ml PBS緩沖液沖洗柱子4次，以充分洗去大腸桿菌菌體雜蛋白，保證產(chǎn)品的純度；⑤用10ml洗脫液沖洗結(jié)合物，按1-2ml量于潔凈Eppendorf管內(nèi)收集洗脫液；⑥純化柱的再生與保存用5倍于膠層體積的由3mol/L PBS+3mol/LNaCl溶液組成的高鹽溶液液洗2次，用5倍于膠層體積的20％乙醇洗2次，于4℃保存。
本發(fā)明提供的VP1與VP3基因非重疊序列原核表達抗原，是利用基因工程技術(shù)，對鵝細小病毒(GPV)衣殼蛋白基因VP1與VP3非重疊序列進行克隆的基礎(chǔ)上，將其與原核表達載體pGEX-6p-1(是一種帶有GST前導(dǎo)肽的融合表達載體)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21表達系統(tǒng)進行誘導(dǎo)、表達的基因工程產(chǎn)品。該蛋白的表達形式是VP3/GST融合蛋白，表達的融合蛋白的分子量為47KU，將產(chǎn)品設(shè)計為融合表達一是考慮便于純化，二是能增加表達蛋白的免疫原性。該基因編碼蛋白是非糖基化蛋白，因此，經(jīng)原核表達系統(tǒng)表達后的產(chǎn)品經(jīng)Western blot、Dot-ELISA進行鑒定后均表明具有與天然蛋白相似的免疫反應(yīng)活性。
融合表達的優(yōu)點一是便于親合層析純化，二是增加蛋白分子量后免疫原性得到提高。該融合蛋白在表達時，大部分以非可溶性的包涵體形式表達，在純化之前對于包涵體我們采用了較為溫和的包涵體裂解方式，因此包涵體蛋白裂解后又經(jīng)復(fù)性處理后，根據(jù)Dot-ELISA及Western blot鑒定結(jié)果認為有一部分蛋白基本保持了天然蛋白的特性，其線性抗原及空間依賴性抗原結(jié)構(gòu)依然保持。經(jīng)裂解的包涵體蛋白經(jīng)24個月仍保持良好的均質(zhì)膠體狀態(tài)，無析出和沉淀現(xiàn)象，表明狀態(tài)穩(wěn)定。
應(yīng)用該原核表達檢測抗原鑒別鵝細小病毒抗體與鵝細小病毒VP3亞單位抗體的優(yōu)點一是因為該產(chǎn)品是病毒亞單位基因的表達產(chǎn)物，并非全病毒，因此在應(yīng)用該抗原進行檢測過程中絕無散毒危險；二是檢測反應(yīng)的靈敏度高，無交叉反應(yīng)現(xiàn)象；三是因為VP3基因是鵝細小病毒的主要保護性基因，用VP3基因研制基因工程疫苗應(yīng)用后，衣殼蛋白序列中只有避開VP3基因片段的VP1與VP3基因非重疊序列才能夠鑒別GPV全病毒抗體及VP3基因亞單位抗體。該鑒別方法的建立是VP3基因工程疫苗能夠?qū)嶋H應(yīng)用的先決條件。
采用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的產(chǎn)品可用于鑒別鵝細小病毒抗體與鵝細小病毒VP3基因亞單位抗體的間接-ELISA及Dot-ELISA方法的檢測抗原。
本發(fā)明的產(chǎn)品優(yōu)點體現(xiàn)在①由于該檢測抗原是VP1-VP3基因片段原核表達蛋白，并非全病毒，因此應(yīng)用該抗原進行檢測時絕無散毒危險。
②作為ELISA抗原檢測鵝細小病毒抗體，其檢測靈敏度高，特異性強，無交叉反應(yīng)。
③生產(chǎn)工藝先進、性能穩(wěn)定，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)品付加值高，適合工廠化生產(chǎn)，市場應(yīng)用前景廣。
(四)、具體實施方案鵝細小病毒VP1與VP3基因非重疊序列原核表達抗原的制備生產(chǎn)工藝過程為1.設(shè)計擴增GPV VP1-VP3基因的特異性引物；2.通過PCR擴增獲得VP1-VP3基因片段；3.對VP1-VP3基因進行克隆、測序鑒定；4.將VP1-VP3基因定向亞克隆至pGEX-6p-1原核表達載體；5.VP1-VP3基因在大腸桿菌的誘導(dǎo)表達
將重組表達質(zhì)粒pGEX-6p-(VP1-VP3)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plysS，然后進行誘導(dǎo)表達。
6.VP1-VP3基因表達蛋白的親合層析純化(1)待純化樣的制備離心收集表達細菌離心取沉淀，用PBS(1mol/L，pH7.4)洗滌3次，細菌沉淀用PBS溶液重懸起。
裂解菌體獲取上清可溶性蛋白與包涵體沉淀加入溶菌酶至終濃度為1％(1mg/ml)，冰浴30min，然后進行超聲處理，以懸液趨于透明、用移液槍吸吹時無明顯凝塊為度。離心取上清(即為可溶性蛋白)并加入1％的TritionX-100及1mmol/L的DTT至終濃度為1mmol/L后于-20℃保存，以備純化。沉淀即為包涵體。
包涵體的裂解及可溶性蛋白的回收包涵體部分用包涵體洗滌液(30％蔗糖，100mol/L NaCl，50mmol/L Tris，pH8.0，1％TritionX-100)以12000r/m，4℃離心洗滌2次，重懸沉淀，加入16ml包涵體裂解液(1.5％(m/v)N-十二烷基肌氨酸鈉，25mmol/L三乙醇胺，1mmol/L EDTA，pH8.0)重懸，4℃處理2h，再超聲處理20S，以12000r/m，4℃離心20min，除去不溶性沉淀，取上清即為可溶性包涵體蛋白?？扇苄陨锨灏瓷鲜龇椒ㄌ幚?。
(3)表達蛋白的純化前復(fù)性在包涵體溶解上清中立即加入終濃度為2％的Trition X-100，加入9倍體積的復(fù)性緩沖液(0.8mmol/L氧化型谷胱苷肽GSSH，2mmol/L還原型谷胱苷肽GSH，2mmol/L EDTA，20mmol/L Tris，pH8.5)，用0.01mol/LPBS(pH7.4)透析48h，每12h更換一次透析液。取出復(fù)性的包涵體蛋白液，經(jīng)聚乙醇-8000進行濃縮，加入2％的Trition X-100后，于-20℃保存?zhèn)溆诩兓?br> (4)表達蛋白的親合層析純化流程①用20ml PBS沖洗柱子，以洗去保存液；②用6ml PBS+1％Trition X-100進行平衡凝膠層；③往柱內(nèi)加樣，加樣時可用小濾器(0.22μm孔徑)過濾上樣，每次上樣2ml，并在27℃條件下感作30min后緩慢棄掉流出液，釋放流出液的速率為1滴/15秒。
④用10ml PBS緩沖液沖洗柱子2次；⑤用10ml洗脫液沖洗結(jié)合物，按1-2ml量于潔凈Eppendorf管內(nèi)收集洗脫液；⑥純化柱的再生與保存用高鹽再生液(1mol/L PBS+3molo/L NaCl)洗滌凝膠2次可以再生利用。為了長期保存，用5倍于膠層體積的PBS液洗2次，用5倍于膠層體積的20％乙醇洗2次，于4℃保存。
(5)表達蛋白含量的測定采用紫外線吸收法定量蛋白質(zhì)。將待檢樣品適當(dāng)稀釋后，同時測定該蛋白質(zhì)溶液在λ260nm和λ280nm處的OD值，同時用稀釋液作為空白對照，按下列公式計算蛋白含量(1.46×A280 0.74×A260)×稀釋倍數(shù)＝(mg)/ml蛋白含量VP1-VP3/GST純化蛋白的質(zhì)量濃度為≥1.5mg/ml。
權(quán)利要求
1.一種鵝細小病毒VP1與VP3基因非重疊序列原核表達蛋白，其特征是它是一種鵝細小病毒衣殼蛋白核苷酸VP1與VP3基因非重疊序列原核表達產(chǎn)物，VP1-VP3基因片段含有594個堿基，編碼198個氨基酸殘基，在用原核表達載體pGEX-6p-1進行表達時，VP1-VP3基因片段與融合表達載體上的谷胱苷肽前導(dǎo)肽得到融合表達，融合蛋白的分子量大小約為47KU。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鵝細小病毒VP1與VP3基因非重疊序列原核表達蛋白，其特征是非重疊序列的核苷酸序列及其推倒的氨基酸序列為ATGCGGAATCTGAAAGCTGGAGCCCCTCAGCCAAAACCAAACCAGCAGTCTCAGTCTGTG1 M R N L K A G A P Q P K P N Q Q S Q S V61TCTCCAGACAGAGAACCCGAACGAAGAGATAATAATCGGGGCTTTGTACTTCCTGGCTAT21 S P D R E P E R R D N N R G F V L P G Y121AAGTATCTTGGGCCTGGTAACGGCCTTGATAAAGGCCCACCTGTCAATAACGCGGACACC41 K Y L G P G N G L D K G P P V N N A D T181GTCGCGCTTGAACACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTTAAAGCGGGAGACAATCCATAT61 V A L E H D K A Y D Q Q L K A G D N P Y241ATAAAATTCAATCACGCTGACCAGGACTTTATAGATAGTCTCCAAGACGACCAGTCATTC81 I K F N H A D Q D F I D S L Q D D Q S F301GGAGGTAATCTTGGAAAGGCTGTATTTCAGGCCAAAAAACGTATCTTAGAGCCATTTGGC101 G G N L G K A V F Q A K K R I L E P F G361CTAGTAGAAGATCCTATCAACACGGCACCTGCAAAAAAAAATACAGGGAAGCTTACTGAC121 L V E D P I N T A P A K K N T G K L T D421CATTACCCGGTAGTTAAGAAGCCTAAACTTACCGAGGAAGTCAGTGCGGGAGGTGGTAGC141 H Y P V V K K P K L T E E V S A G G G S481AGTGCCGTAGAAGACGGAGGAGCCACCGCGGAGGGCACCGAACCTGTGCGGCCG161S A V E D G G A T A E G T E P V R P
3.鵝細小病毒VP1與VP3基因非重疊序列原核表達蛋白抗原的制備方法，其特征是(1)、設(shè)計擴增GPV PV1-VP3基因的特異性引物；(2)、通過PCR擴增獲得VP1-VP3基因片段；(3)、對VP1-VP3基因進行克隆、測序鑒定；(4)、將VP1-VP3基因定向亞克隆至pGEX-6p-1原核表達載體；(5)、VP1-VP3基因在大腸桿菌的誘導(dǎo)表達；將重組表達質(zhì)粒pGEX-6p-(VP1-VP3)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plysS，進行表達；(6)、VP1-VP3基因表達蛋白的親合層析純化，主要包括①待純化樣的制備離心收集表達細菌離心取沉淀，用1mol/L、pH7.4的PBS洗滌3次，將沉淀用PBS溶液重懸起；裂解菌體獲取上清可溶性蛋白與包涵體沉淀加入溶菌酶至重量體積比終濃度為1％，冰浴30min，然后進行超聲處理，離心取上清并加入1％的TritionX-100及DTT至終濃度為1mmol/L后于-20℃保存，以備純化，沉淀即為包涵體；包涵體的裂解及可溶性蛋白的回收包涵體用30％蔗糖、100mol/LNaCl、50mmol/L Tris、1％TritionX-100組成的pH8.0的包涵體洗滌液洗滌2次，加入由1.5％N-十二烷基肌氨酸鈉、2 5mmol/L三乙醇胺、1mmol/L EDTA、組成的pH8.0的包涵體裂解液重懸，4℃處理2h，再超聲處理，除去不溶性沉淀，取上清即為可溶性包涵體蛋白，可溶性上清按上述方法處理；②表達蛋白的純化前復(fù)性上清中加入終濃度為2％的Trition X-100，加入9倍體積的由0.8mmol/L氧化型谷胱苷肽GSSH、2mmol/L還原型谷胱苷肽GSH、2mmol/LEDTA、20mmol/L Tris組成的pH8.5的復(fù)性緩沖液，用0.01mol/L PBS、pH7.4透析48h，取出復(fù)性的包涵體蛋白液，經(jīng)聚乙醇-8000進行濃縮，加入2％的Trition X-100后，于-20℃保存?zhèn)溆诩兓?；VP1-VP3基因原核表達蛋白的親合層析純化包括①用20ml PBS沖洗柱子，以洗去保存液；②用6ml PBS+1％Trition X-100進行平衡凝膠層；③往柱內(nèi)加樣，每次加2ml樣，加樣后于27℃溫箱中感作30min，然后才棄掉流出液，釋放的速率要求1滴/30秒；④用10ml PBS緩沖液沖洗柱子4次，以充分洗去大腸桿菌菌體雜蛋白，保證產(chǎn)品的純度；⑤用10ml洗脫液沖洗結(jié)合物，按1-2ml量于潔凈Eppendorf管內(nèi)收集洗脫液；⑥純化柱的再生與保存用5倍于膠層體積的由3mol/L PBS+3mol/LNaCl溶液組成的高鹽溶液洗2次，用5倍于膠層體積的20％乙醇洗2次，于4℃保存。
全文摘要
本發(fā)明提供的是一種鵝細小病毒VP1與VP3基因非重疊序列原核表達蛋白及其制備方法。本產(chǎn)品制備過程包括(1)、設(shè)計擴增鵝細小病毒VP1與VP 3基因核苷酸非重疊序列的特異性引物；(2)、通過PCR擴增獲得VP1與VP3基因非重疊序列片段；(3)、對VP1與VP3基因非重疊序列進行克隆、測序鑒定；(4)、將VP1與VP3基因非重疊序列定向亞克隆至pGEX－6p－1原核表達載體；(5)、VP1與VP3基因非重疊序列在大腸桿菌的誘導(dǎo)表達；(6)VP1與VP3基因非重疊序列表達蛋白的親合層析純化。本產(chǎn)品可作為鑒別鵝細小病毒抗體及鵝細小病毒VP3基因亞單位抗體的間接－ELISA及Dot－ELISA方法的檢測抗原。
文檔編號C12N15/70GK1648254SQ200410043810
公開日2005年8月3日 申請日期2004年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月18日
發(fā)明者王君偉, 布日額, 馬波, 李勐, 吳金花, 劉洪雨 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)