專利名稱：激光－微波誘變選育富硒紫球藻變株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用激光和微波誘變手段，結(jié)合富硒馴化，篩選富硒紫球藻突變株的方法，屬于新藻種的誘變選育技術(shù)。
紫球藻屬于紅藻門、紅毛菜藻綱、紫球藻目、紫球藻科、紫球藻屬的一種單細(xì)胞紅藻，分布于海水、淡水、咸水及潮濕的土地中。細(xì)胞外包圍著一層粘質(zhì)鞘，粘質(zhì)鞘由細(xì)胞分泌出來的水溶性紫球藻多糖形成。生長過程受溫度、光照、pH、鹽度、碳源、三十烷醇的影響。在生長過程中，紫球藻能合成藻膽蛋白、多糖、不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)等多種生物活性物質(zhì)。紫球藻所含的多種富有開發(fā)價值的生物活性物質(zhì)引起人們極大的研究興趣。Ginzberg等將紫球藻粗粉按雞食量的一定比例喂養(yǎng)來亨雞，觀察到可降低雞血清膽固醇水平，雞蛋蛋黃的膽固醇水平有大幅下降，而亞油酸和花生四烯酸含量上升；Dvir等發(fā)現(xiàn)紫球藻影響大鼠胃腸生理功能和脂代謝，使大小腸和結(jié)腸的長度增加，血清膽固醇水平下降。
紫球藻生長階段進(jìn)入穩(wěn)定期后，細(xì)胞大量產(chǎn)生胞外多糖，并逐漸溶入培養(yǎng)液中，使其變得十分粘稠，在其細(xì)胞膜外層也分布并形成粘性鞘膜，在適宜條件下，可達(dá)到生物量的50％左右。紫球藻多糖含硫酸基團(tuán)，由木糖、葡萄糖、半乳糖等單糖組成。Minkova等研究表明紫球藻的胞外多糖能抑制流行性感冒病毒A/Sofia/80/93/H3N2的生長；Huleihel等的研究表明，紫球藻細(xì)胞壁硫酸多糖對單皰疹病毒I型(HSV-1)和II型(HSV-2)及水痘—帶狀皰疹病毒(VZV)具有明顯抗性；進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)該多糖能在離體(細(xì)胞培養(yǎng))和活體(鼠和兔)條件下對HSV-1和HSV-2表現(xiàn)出明顯抗性。
紫球藻細(xì)胞內(nèi)有一個大而呈星壯的色素體，內(nèi)含豐富的藻紅蛋白和藻藍(lán)蛋白，其中以B-PE含量最多。藻膽蛋白含量可達(dá)到細(xì)胞總蛋白量的50％，其中藻紅蛋白(包括B-PE)占84％，是B-PE的一個重要來源。在較低光強(qiáng)及適宜溫度條件下，藻體可合成占總生物量5％-10％的B-PE。通過對光強(qiáng)、光質(zhì)、培養(yǎng)條件的調(diào)控可獲得更高的產(chǎn)量。Bermejo等采用兩步法快速制備紫球藻B-藻紅蛋白，經(jīng)過均質(zhì)的藻膽蛋白通過SDS-PAGE測定出與它的三個亞基相對應(yīng)的遷移帶。Bermejo Roma`n等用簡便便宜的方法制備紫球藻的自然態(tài)的B-藻紅蛋白和R-藻藍(lán)蛋白，藻中含有32％的B-藻紅蛋白和12％R-藻藍(lán)蛋白。
國內(nèi)對紫球藻的開發(fā)應(yīng)用研究報(bào)道很少，只有福建師范大學(xué)生物工程學(xué)院、煙臺大學(xué)海洋生化工程研究所有相關(guān)論文報(bào)道，煙臺大學(xué)的王長海等利用內(nèi)環(huán)流氣升式光生物反應(yīng)器就碳源及供給形式、光強(qiáng)和反應(yīng)器的操作條件等對紫球藻生長的影響進(jìn)行研究；他們還采用水提法、堿提法、凍融水提法提取藻體細(xì)胞中的多糖。福建師范大學(xué)生物工程學(xué)院結(jié)合自身研究基礎(chǔ)，對藻種的選育、規(guī)?；囵B(yǎng)、藻粉降血脂和降血糖等問題進(jìn)行了有意義的探索工作。
硒是人和動物所必需的微量元素，具有多種重要的生物學(xué)功能，構(gòu)成若干抗氧化酶的活性中心，可影響機(jī)體抗氧化能力和對相關(guān)疾病的抵抗能力。為了維持生理活動的正常需要，每天的硒攝入量應(yīng)為150-200μg。我國目前大體上平均一個人每天只攝入30-70μg硒。硒的攝入不足給人和動物造成多種傷害，影響生物體的正常功能，損害機(jī)體免疫力，引起諸如克山病、大骨節(jié)病、地方性甲狀腺腫等多種疾病，我國有10多個省、310個病區(qū)縣8295萬人受缺硒引起的克山病的威脅。
硒的有機(jī)態(tài)與無機(jī)態(tài)相比，具有吸收率高、生物活性強(qiáng)、環(huán)境污染小等特點(diǎn)。通過生物進(jìn)行硒的轉(zhuǎn)化為獲取有機(jī)硒提供一條簡便經(jīng)濟(jì)的途徑，有利于實(shí)際生產(chǎn)中大量應(yīng)用。有機(jī)硒與無機(jī)硒相比具有以下特點(diǎn)有機(jī)硒的生物利用率明顯高于亞硒酸鈉；從提高人體血硒水平來看，有機(jī)硒比無機(jī)硒更有效；有機(jī)硒的毒性比無機(jī)硒小。目前，硒的有機(jī)化有兩種手段人工合成和生物轉(zhuǎn)化。人工合成的產(chǎn)品很多，有硒化亞油酸、硒化脂多糖、肌醇硒酸脂等。這些產(chǎn)品由于生產(chǎn)工藝復(fù)雜，價格昂貴，難以在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。硒的生物有機(jī)化主要是通過動物、植物、微生物轉(zhuǎn)化無機(jī)硒生產(chǎn)有機(jī)硒，如富硒螺旋藻、富硒雞蛋、富硒大蒜、富硒酵母、富硒牛奶和富硒茶。其中的硒主要是以硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸等形式存在。盡管在藻類方面已有富硒的產(chǎn)品，如富硒螺旋藻，但是作為富集體的螺旋藻僅僅是未進(jìn)行有效的正誘變的普通藻株，對硒的吸收、轉(zhuǎn)化能力弱，藻體硒含量低，無實(shí)際開發(fā)價值。
目前微藻藻種選育，物理誘變方法中常選用激光、紫外線、60Co-γ射線等照射等，化學(xué)誘變劑多選用DES及亞硝基胍等。這些方法誘變劑量小，突變株少，而當(dāng)致死率99.5％時，雖然突變株較多，但大多數(shù)為負(fù)突變株，不易獲的具有優(yōu)良性狀的突變株。激光照射技術(shù)在微生物誘變育種中的應(yīng)用較為廣泛，其作用于微生物細(xì)胞產(chǎn)生光、熱、壓力、電磁場、弱刺激作用等，改變了微生物細(xì)胞中DNA和RNA遺傳密碼的次序，引起變異。而把激光應(yīng)用在藻種的選育方面的技術(shù)，則剛剛起步。
本發(fā)明專利的目的就是利用紫球藻的吸收、轉(zhuǎn)化作用強(qiáng)的特點(diǎn)，采用YAG(λ＝1060nm)激光輻照和微波輻射相結(jié)合的方式以及單獨(dú)采用微波進(jìn)行有效誘變，同時結(jié)合硒的富集馴化方法，篩選具有高富硒能力的紫球藻突變株。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)首先利用微波(功率600W，脈沖頻率2450MHz)進(jìn)行20～60s輻射處理，或再利用YAG(λ＝1060nm)激光對紫球藻進(jìn)行10～80s輻照，經(jīng)處理的紫球藻置于含有濃度為15～500mg/L亞硒酸鈉的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，從中分離獲得富硒紫球藻突變株。本發(fā)明具體包括以下內(nèi)容1、突變株的獲得微波輻射取對數(shù)生長期的藻液，用無菌培養(yǎng)液稀釋、離心、洗凈，將懸浮藻液分裝于無菌玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行微波誘變，采用的微波爐最大功率600W，脈沖頻率2450M Hz，以輻照不同的時間(20～60s)對藻細(xì)胞進(jìn)行誘變處理。
激光輻照經(jīng)微波輻射后的藻液置于無菌小玻璃管內(nèi)進(jìn)行YAG激光(λ＝1060nm)輻照10-80s，照射后移入內(nèi)裝培養(yǎng)液的三角瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)液含有亞硒酸鈉，濃度為15～500mg/L。處理液稀釋后一部分涂布于含一定濃度亞硒酸鈉的平板，從中挑出富硒紫球藻突變株；另一部分移入含有300～550mg/L的亞硒酸鈉的培養(yǎng)液中進(jìn)行富硒馴化，從中也可獲得富硒紫球藻突變株。
2、富硒紫球藻突變株的培養(yǎng)在培養(yǎng)液中加入亞硒酸鈉，其濃度為15-500mg/L，最佳的添加量為80mg/L。接入富硒紫球藻突變株進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)周期結(jié)束，即可得到硒含量高的富硒紫球藻粉和富硒紫球藻多糖。
本發(fā)明的具有的優(yōu)點(diǎn)激光、微波誘變設(shè)備簡單、方法易行、操作安全，誘變效果遠(yuǎn)較傳統(tǒng)的理化因子好，在微藻藻種選育中有較大的推廣價值。本發(fā)明利用紫球藻含有多種生理活性物質(zhì)的特點(diǎn)，通過利用激光輻照和微波輻射相結(jié)合方式或單獨(dú)利用微波進(jìn)行誘變，結(jié)合富硒馴化，選育出富硒紫球藻突變株。該突變株對無機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率高，當(dāng)培養(yǎng)液的硒濃度為80mg/L，藻粉的硒含量由0.35μg/g提高到4500μg/g，目前未見有關(guān)富硒紫球藻的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。通過動物實(shí)驗(yàn)表明，富硒紫球藻及其富硒胞外多糖對實(shí)驗(yàn)動物血糖和血脂的調(diào)節(jié)作用、對腫瘤細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用、抗流感病毒等作用明顯，分離獲得富硒藻膽蛋白具有性質(zhì)穩(wěn)定、熒光量子產(chǎn)率高、背景干擾小、易于同生物素、抗體和糖蛋白等大分子交聯(lián)等特點(diǎn)。
下面結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例1
1、突變株的獲得微波輻射/激光輻照誘變?nèi)?shù)生長期的藻液，用無菌培養(yǎng)液稀釋、離心、洗凈，將懸浮藻液25mL分裝于直徑9cm無菌培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行20s的微波輻照誘變，微波誘變采用的微波爐最大功率600W，脈沖頻率2450MHz。照射后分別移入內(nèi)裝120mL培養(yǎng)液的300mL三角瓶中，取上述經(jīng)微波輻照的藻液3mL于直徑2cm無菌小玻璃管內(nèi)進(jìn)行YAG激光(λ＝1060nm)輻照10s，移入內(nèi)裝20mL培養(yǎng)液的100mL三角瓶中，培養(yǎng)液含有濃度為50mg/L亞硒酸鈉。處理液稀釋后涂布于含一定濃度亞硒酸鈉的平板。
2、富硒紫球藻突變株的培養(yǎng)在培養(yǎng)液中加入濃度為25mg/L亞硒酸鈉，接入富硒紫球藻突變株進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)周期結(jié)束，即可得到富硒紫球藻粉和富硒紫球藻多糖。
實(shí)施例21、突變株的獲得取對數(shù)生長期的藻液，用無菌培養(yǎng)液稀釋、離心、洗凈，將懸浮藻液15mL分裝于直徑12cm無菌培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行微波誘變，微波誘變采用的微波爐最大功率600W，脈沖頻率2450MHz，輻照60s進(jìn)行誘變處理，移入內(nèi)裝120mL培養(yǎng)液的300mL三角瓶中，培養(yǎng)液含有濃度為500mg/L亞硒酸鈉。處理液稀釋后一部分涂布于含一定濃度亞硒酸鈉的平板。另一部分移入含有300mg/L的亞硒酸鈉的培養(yǎng)液中進(jìn)行富硒馴化，從中也可獲得富硒紫球藻突變株。
2、富硒紫球藻突變株的培養(yǎng)在培養(yǎng)液中加入濃度為80mg/L亞硒酸鈉，接入富硒紫球藻突變株進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)周期結(jié)束，即可得到富硒紫球藻粉和富硒紫球藻多糖。
實(shí)施例31、突變株的獲得
微波輻射/激光輻照誘變?nèi)?shù)生長期的藻液，用無菌培養(yǎng)液稀釋、離心、洗凈，將懸浮藻液25mL分裝于直徑9cm無菌培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行40s的微波輻照誘變，微波誘變采用的微波爐最大功率600W，脈沖頻率2450MHz。照射后分別移入內(nèi)裝120mL培養(yǎng)液的300mL三角瓶中，取上述經(jīng)微波輻照的藻液3mL于直徑2cm無菌小玻璃管內(nèi)進(jìn)行YAG激光(λ＝1060nm)輻照80s，取一部分移入內(nèi)裝20mL培養(yǎng)液的100mL三角瓶中，培養(yǎng)液含有濃度為300mg/L亞硒酸鈉。處理液稀釋后一部分涂布于含一定濃度亞硒酸鈉的平板。另一部分移入含有520mg/L的亞硒酸鈉的培養(yǎng)液中進(jìn)行富硒馴化，從中也可獲得富硒紫球藻突變株。
2、富硒紫球藻突變株的獲得在培養(yǎng)液中加入濃度為120mg/L亞硒酸鈉，接入富硒紫球藻突變株進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)周期結(jié)束，即可得到富硒紫球藻粉和富硒紫球藻多糖。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及利用激光誘變手段，篩選紫球藻變株的方法，其特征是首先利用微波進(jìn)行輻射處理，再利用YAG激光對紫球藻進(jìn)行輻照，或單獨(dú)利用微波輻射處理，后置于亞硒酸鈉的培養(yǎng)液中進(jìn)行富硒馴化培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘變選育方法，其特征是輻射處理時使用的微波功率為600W，脈沖頻率為2450MHz
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘變選育方法，其特征是微波輻射處理的時間20～60s，最佳輻射時間20s。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘變選育方法，其特征是輻照處理時使用的YAG激光，其波長為1060nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘變選育方法，其特征是輻照處理的時間10-80s。最佳輻照時間30s。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘變選育方法，其特征是經(jīng)輻照處理的藻液移入內(nèi)裝培養(yǎng)液的三角瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)液含有亞硒酸鈉，濃度為15-500mg/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的誘變選育方法，其特征是經(jīng)培養(yǎng)后涂布于含一定濃度亞硒酸鈉的平板。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的誘變選育方法，其特征是經(jīng)培養(yǎng)后移入含有300～550mg/L的亞硒酸鈉的培養(yǎng)液中進(jìn)行富硒馴化。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用激光和微波誘變結(jié)合富硒馴化，篩選富硒紫球藻變株的方法。首先利用微波(功率600W，脈沖頻率2450MHz)進(jìn)行20－60s輻射處理，或再利用YAG(λ＝1060nm)激光對紫球藻進(jìn)行10－80s輻照；經(jīng)處理的紫球藻置于濃度為15－500mg/L亞硒酸鈉的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，獲得富硒紫球藻突變株。本發(fā)明通過誘變和富硒馴化方法，選育出富硒紫球藻變株，該突變株對無機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率高，當(dāng)培養(yǎng)液的硒濃度為80mg/L，藻粉的硒含量為4500μg/g；所采用的激光、微波誘變設(shè)備簡單、操作安全、誘變效果遠(yuǎn)較傳統(tǒng)的理化因子好，在微藻藻種選育中有較大的推廣價值。動物實(shí)驗(yàn)表明，富硒紫球藻及其富硒多糖對實(shí)驗(yàn)動物血糖、血脂、腫瘤細(xì)胞的調(diào)節(jié)、抗流感病毒等作用明顯。
文檔編號C12N13/00GK1563375SQ20041003982
公開日2005年1月12日 申請日期2004年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月19日
發(fā)明者陳必鏈, 黃鍵, 王娟 申請人:福建師范大學(xué)