專利名稱：檢驗(yàn)牛乳中抗生素殘留量的微生物制劑制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢驗(yàn)牛乳及其制品中抗生素殘留量的高活性干微生物制劑的制備，及其在牛乳及其制品中抗生素殘留量快速檢驗(yàn)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，抗生素給人類和動(dòng)物防治疾病做出了很大的貢獻(xiàn)，但同時(shí)又給人類帶來(lái)了很多的副作用，例如藥物殘留引起的耐藥菌株在人體內(nèi)潛在的危害已相當(dāng)大。
牛乳中抗生素殘留的主要危害有(1)對(duì)人類健康的危害使人被動(dòng)地接受、積累抗生素，對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性，患者用抗生素治療的效果下降。有些過(guò)敏體質(zhì)的人食用含抗生素的乳制品后會(huì)引起不良反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)可危及生命。此外，經(jīng)常食用抗生素殘留超標(biāo)的乳制品會(huì)破壞人體內(nèi)腸道菌群的自然平衡，對(duì)人體產(chǎn)生直接或間接損傷，甚至有致癌、致畸和致突變的作用。
(2)對(duì)乳制品生產(chǎn)的危害沒(méi)有優(yōu)質(zhì)的原料乳就無(wú)法生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的乳制品。原料乳中抗生素殘留物嚴(yán)重干擾發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)，影響發(fā)酵乳、奶酪、黃油等的起酵和后期風(fēng)味的形成，破壞了牛乳的純凈和加工價(jià)值，造成原料乳的大量浪費(fèi)，致使企業(yè)遭受巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
世界各地區(qū)或組織機(jī)構(gòu)對(duì)牛乳中抗生素都加以嚴(yán)格的控制和管理。我國(guó)的相關(guān)規(guī)定中也明確指出原料乳中的抗生素不得檢出。
目前檢測(cè)鮮牛乳中抗生素殘留的主要方法有(1)理化分析法色譜技術(shù)；準(zhǔn)確，但需要特殊的檢測(cè)設(shè)備和藥品，檢測(cè)成本高，樣品的預(yù)處理過(guò)程繁雜。
(2)免疫受體試驗(yàn)法放射免疫法、熒光免疫法、酶聯(lián)免疫法等；方便快捷，但特異性很強(qiáng)，檢測(cè)成本較高。
(3)微生物受阻檢測(cè)法TTC法、混濁度實(shí)驗(yàn)等；可靠性高，操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用低，但是整體檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，檢測(cè)結(jié)果對(duì)標(biāo)識(shí)微生物的活性有一定依賴性。
目前我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB4789.27-94)中只規(guī)定了TTC法為法定的檢測(cè)乳品中抗生素殘留的方法。根據(jù)國(guó)標(biāo)，在正式檢測(cè)之前，需要對(duì)菌種進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)15小時(shí)的活化過(guò)程，然后稀釋一倍待用；在實(shí)際操作中，經(jīng)常由于保藏不當(dāng)造成菌種衰退、活化不當(dāng)引起菌種活力下降，或由于過(guò)早活化導(dǎo)致實(shí)際測(cè)定時(shí)菌種老化等因素引起實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏差。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是解決TTC法檢測(cè)牛乳中抗生素殘留實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)和標(biāo)識(shí)微生物活性不穩(wěn)定的問(wèn)題，有效地避免菌種保藏、傳代和活化等過(guò)程中的菌種性能退化的現(xiàn)象，提供一種檢驗(yàn)牛乳及其制品中抗生素殘留量的微生物制劑的制備方法及其應(yīng)用。
本發(fā)明提供的檢驗(yàn)牛乳中抗生素殘留量的微生物制劑的制備方法，是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的——a標(biāo)識(shí)菌液的高濃度培養(yǎng)以去離子水為溶劑，按重量體積百分比(g/100mL)依次加入脫脂乳粉9～11％，乳清粉0.5～2％，酵母膏0.5～2％，磷酸氫二銨0.20～0.4％，配制培養(yǎng)基；按3～5％接入嗜熱乳酸鏈球菌母種，培養(yǎng)溫度為40～45℃，培養(yǎng)過(guò)程中按重量體積百分比補(bǔ)加2～4％乳糖，控制培養(yǎng)基的pH值為5.8～6.3，控制溶氧濃度為0.1～1.0mg/L，培養(yǎng)時(shí)間5～7小時(shí)，至菌數(shù)達(dá)到20～40億/mL，得到嗜熱乳酸鏈球菌高濃度培養(yǎng)物；——b濃縮將上述高濃度培養(yǎng)物經(jīng)3000～5000轉(zhuǎn)離心10～25min，得到活性嗜熱乳酸鏈球菌的濃縮物；——c添加保護(hù)劑向上述嗜熱乳酸鏈球菌的濃縮物中加入保護(hù)劑，用量為離心濃縮前菌液體積的10～20％，制成菌懸液；——d干燥將添加保護(hù)劑的菌懸液置于-80～-60℃冰箱中，冷凍1.5～3小時(shí)后，放入冷凍干燥機(jī)中，調(diào)冷阱溫度-50～-40℃，真空度20～30pa，經(jīng)5℃/30min緩慢升溫，3.5～6小時(shí)后取出，得到高活性的干發(fā)酵劑菌粉；——e微生物制劑的制備以脫脂乳粉或乳清粉為填充劑，用量為菌粉的1～2倍，充分混合后真空包裝，活菌數(shù)為600～800億/克。
上述c步中的保護(hù)劑為蔗糖、果膠、脫脂乳、乳清、海藻糖、甘油、維生素中的一種或多種。
一種檢驗(yàn)牛乳中抗生素殘留量的微生物制劑的應(yīng)用，即對(duì)牛乳中抗生素殘留量的快速檢測(cè)，具體步驟如下——取上述制備方法中生產(chǎn)的微生物制劑菌粉1g，以無(wú)菌操作倒入20～30mL無(wú)菌水中，充分混勻，40～45℃保溫30～50分鐘，作為測(cè)試菌液待用；——取待檢乳樣9mL于無(wú)菌試管中，80℃水浴加熱5min后冷卻至37℃以下，加入上步中待用測(cè)試菌液1mL，36±1℃水浴培養(yǎng)2h，加TTC 0.3mL，36±1℃水浴培養(yǎng)30min，根據(jù)顯色狀態(tài)判定試驗(yàn)結(jié)果檢樣呈乳的原色時(shí)為陽(yáng)性，呈紅色為陰性，見(jiàn)表1。——總體檢測(cè)時(shí)間為4～6h。
表1 顯色狀態(tài)判斷標(biāo)準(zhǔn)顯色狀態(tài)判斷未顯色者陽(yáng)性微紅色者可疑桃紅色—紅色陰性判斷方法準(zhǔn)確培養(yǎng)30min觀察結(jié)果，如為陽(yáng)性，再繼續(xù)培養(yǎng)30min作第二次觀察。觀察時(shí)要迅速，避免光照過(guò)久發(fā)生干擾。乳中有抗生素存在，則檢樣中雖加入菌液培養(yǎng)物，但因細(xì)菌的繁殖受到抑制，因此指示劑TTC不還原，不顯色。與此相反，如果沒(méi)有抗生素存在，則加入菌液即行增殖，TTC被還原而顯紅色，也就是說(shuō)檢樣呈乳的原色時(shí)為陽(yáng)性，呈紅色為陰性。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及效果本發(fā)明在保持了TTC檢測(cè)法可靠性的基礎(chǔ)上解決了該方法中的菌種保藏和活力不穩(wěn)的問(wèn)題，將檢測(cè)菌種制成活性微生物制劑，節(jié)省了原實(shí)驗(yàn)中“菌液制備”步驟；減少了菌種保藏和傳代過(guò)程中資金、設(shè)備和人員的投入，使原檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的總體時(shí)間從20小時(shí)縮短至5小時(shí)左右，并且使檢測(cè)過(guò)程易于控制和管理，檢測(cè)結(jié)果更加穩(wěn)定可靠，便于乳品企業(yè)和廣大消費(fèi)者對(duì)牛奶中抗生素的快速檢測(cè)。
具體實(shí)施方式實(shí)施例1在500mL三角瓶中加入去離子水300mL、脫脂乳粉30g、乳清粉3g、酵母膏1.5g、磷酸氫二銨0.9g。滅菌后加入5％(重量體積百分比)嗜熱乳酸鏈球菌母種，控制培養(yǎng)基的pH值為5.8～6.3，搖床轉(zhuǎn)速80rpm，培養(yǎng)溫度為43℃，培養(yǎng)過(guò)程中按重量體積百分比分三次間歇補(bǔ)加2％乳糖，培養(yǎng)時(shí)間6～7小時(shí)，至菌數(shù)達(dá)到20～30億/mL，得到嗜熱乳酸鏈球菌的高濃度培養(yǎng)物；經(jīng)轉(zhuǎn)速4000rpm/20min離心濃縮，棄去上清液，在沉淀中加入3％脫脂乳粉為保護(hù)劑，用量相當(dāng)于離心前高濃度培養(yǎng)液體積的20％；將添加保護(hù)劑的菌懸液置于-60℃冰箱中，冷凍3小時(shí)后，取出放入冷凍干燥機(jī)中，調(diào)冷阱溫度-45℃，真空度20～30pa，經(jīng)5℃/30min緩慢升溫，5.5～6小時(shí)后取出，得到高活性干發(fā)酵劑菌粉，加入脫脂乳粉或乳清粉(上步菌粉的1～2倍)作為填充劑，充分混合后真空包裝，1克/袋，活菌數(shù)為600～800億/袋。
實(shí)施例2在5L全自動(dòng)發(fā)酵罐中加入去離子水3000mL、脫脂乳粉270g、乳清粉60g、酵母膏30g、磷酸氫二銨7.5g。滅菌后加入嗜熱乳酸鏈球菌母種3％，培養(yǎng)過(guò)程中按重量體積百分比流加4％乳糖，控制培養(yǎng)基的pH值為5.8～6.3，控制溶氧濃度為1.0mg/L，培養(yǎng)溫度為45℃，培養(yǎng)時(shí)間5～6小時(shí)，至菌數(shù)達(dá)到30～40億/mL，得到嗜熱乳酸鏈球菌的高濃度培養(yǎng)物；離心濃縮后以10％脫脂乳粉+2.7％甘油為保護(hù)劑，總用量為離心前高濃度培養(yǎng)液體積的10％，進(jìn)行冷凍干燥。其它參數(shù)同實(shí)施例1。
實(shí)施例3取菌粉一袋，以無(wú)菌操作倒入30mL無(wú)菌水中，充分混勻，43℃保溫30分鐘，活菌數(shù)達(dá)到40～80億/毫升，作為測(cè)試菌液待用。
取待檢乳樣9mL，置15mm×15mm試管內(nèi)，80℃水浴加熱5min冷卻37℃以下，加入待測(cè)菌液1mL，36±1℃水浴培養(yǎng)2h，加TTC 0.3mL，36±1℃水浴培養(yǎng)30min，觀察如為陽(yáng)性，再于水浴中培養(yǎng)30min作第二次觀察，每份檢樣作二份。另外再作陰性和陽(yáng)性對(duì)照各一份，陽(yáng)性對(duì)照管用無(wú)抗生素的乳8mL加抗生素及菌液和TTC。陰性對(duì)照管用無(wú)抗生素乳9mL加菌液和TTC。
4％2，3，5-氯化三苯四氮唑(TTC)水溶液稱取1g TTC，融于5mL滅菌蒸餾水中，裝褐色瓶?jī)?nèi)于7℃冰箱保存，臨用時(shí)用滅菌蒸餾水稀釋至5倍。如遇溶液變?yōu)橛裆虻稚?，則不能再用。
權(quán)利要求
1.一種檢驗(yàn)牛乳中抗生素殘留量的微生物制劑的制備方法，其特征是該方法是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的——a標(biāo)志菌液的高濃度培養(yǎng)以去離子水為溶劑，按重量體積百分比依次加入脫脂乳粉9～11％，乳清粉0.5～2％，酵母膏0.5～2％，磷酸氫二銨0.20～0.4％，配制培養(yǎng)基；按3～5％接入嗜熱乳酸鏈球菌母種，培養(yǎng)溫度為40～45℃，培養(yǎng)過(guò)程中按重量體積百分比補(bǔ)加2～4％乳糖，控制培養(yǎng)基的pH值為5.8～6.3，控制溶氧濃度為0.1～1.0mg/L，培養(yǎng)時(shí)間5～7小時(shí)，至菌數(shù)達(dá)到20～40億/mL，得到嗜熱乳酸鏈球菌高濃度培養(yǎng)物；——b微生物制劑的制備將上述高濃度培養(yǎng)物經(jīng)離心濃縮、添加保護(hù)劑、冷凍干燥后，得到高活性干發(fā)酵劑菌粉；加入脫脂乳粉或乳清粉作為填充劑，用量為菌粉的1～2倍，充分混合后真空包裝，活菌數(shù)為600～800億/克。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢驗(yàn)牛乳中抗生素殘留量的微生物制劑的應(yīng)用，即對(duì)牛乳中抗生素殘留量的快速檢測(cè)，其特征是——取權(quán)利要求1中生產(chǎn)的微生物制劑菌粉1g，以無(wú)菌操作倒入20～30mL無(wú)菌水中，充分混勻，40～45℃保溫30～50分鐘，作為測(cè)試菌液待用；——取測(cè)試菌液1mL，參照TTC法，檢驗(yàn)牛乳或乳制品中抗生素的殘留量。
全文摘要
一種檢驗(yàn)牛乳中抗生素殘留量的微生物制劑的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明制備方法包括標(biāo)志菌液的高濃度培養(yǎng)，濃縮，添加保護(hù)劑，干燥，加入填充劑，充分混合后真空包裝制得。其應(yīng)用包括待用測(cè)試菌液配制，待檢乳樣加入上步中待用測(cè)試菌液，水浴培養(yǎng)，檢樣呈乳的原色時(shí)為陽(yáng)性，呈紅色為陰性。本發(fā)明在保持了TTC檢測(cè)法可靠性的基礎(chǔ)上解決了菌種保藏和活力不穩(wěn)的問(wèn)題；制成微生物制劑，節(jié)省了原實(shí)驗(yàn)中“菌液制備”步驟；減少了菌種保藏和傳代過(guò)程中資金、設(shè)備和人員的投入，使原檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的總體時(shí)間從20小時(shí)縮短至5小時(shí)左右，并且使檢測(cè)過(guò)程易于控制和管理，檢測(cè)結(jié)果更加穩(wěn)定可靠，便于乳品企業(yè)和廣大消費(fèi)者對(duì)牛奶中抗生素的快速檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK1584046SQ200410019478
公開(kāi)日2005年2月23日 申請(qǐng)日期2004年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月7日
發(fā)明者肖冬光, 汪建明 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)