專利名稱：：強(qiáng)有力的誘導(dǎo)型心臟優(yōu)先的轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及組織優(yōu)先的基因表達(dá)調(diào)控領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：表現(xiàn)為心臟異常或心臟功能障礙的多種疾病或狀況能夠?qū)е滦牧λソ?。心力衰竭是心臟不能泵動(dòng)足夠的血液以滿足機(jī)體循環(huán)需求的生理狀況。在遺傳多樣的人中研究這樣的疾病和狀況是困難的，而且不可預(yù)測(cè)。因此，需要一種模型系統(tǒng)以便于對(duì)心臟疾病和狀況機(jī)制和成因的研究、以及對(duì)有潛力的治療性靶物的鑒定。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)為獲得體內(nèi)復(fù)雜系統(tǒng)的更完整信息提供了重要的進(jìn)步。通過控制單個(gè)或多個(gè)基因的體內(nèi)表達(dá)，有可能洞察這樣的基因在特定系統(tǒng)中的作用或者研究該系統(tǒng)在受遺傳控制環(huán)境中的情況。盡管在大量大型或小型動(dòng)物物種中已經(jīng)完成了成功的轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)，但是小鼠已經(jīng)成為理想的心血管研究動(dòng)物。參見，例如，美國(guó)專利6,353,151，引入本文作為參考。已經(jīng)將心臟優(yōu)先的轉(zhuǎn)基因用于建立某一特定蛋白質(zhì)(或其突變形式)的存在或缺失的結(jié)構(gòu)一功能關(guān)聯(lián)以及分子、細(xì)胞、以及生理水平上的正?；虍惓Ｐ呐K功能。然而，即使是帶有心臟優(yōu)先啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)基因也可能不靈敏，尤其是在研究以低豐度存在時(shí)就能對(duì)心血管結(jié)構(gòu)、代謝及功能有多向效應(yīng)的強(qiáng)有力的生物信號(hào)蛋白的時(shí)候。例如，鼠α-肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子在早期心臟管以及發(fā)育的動(dòng)脈中引發(fā)轉(zhuǎn)錄；因此貫穿發(fā)育過程的大鼠α-肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因表達(dá)具有混淆后期(post-term)表型的潛力。因此，多個(gè)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)致力于開發(fā)條件性或誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)。一種最廣泛使用的條件性系統(tǒng)是二元、以四環(huán)素為基礎(chǔ)的系統(tǒng)，它已經(jīng)被廣泛用于細(xì)胞或動(dòng)物中通過四環(huán)素或其類似物的加入或去除來可逆地誘導(dǎo)表達(dá)。(參見Bujard(1999)。J.GeneMed.1372-374；Furth，等人(1994)。Proc.Natl.Acad.Sci.USA919302-9306；和Mansuy&Bujard(2000)。Curr.Opin.Neurobiol.10593-596，引入本文作為參考。)盡管上述四環(huán)素靶基因誘導(dǎo)/失活系統(tǒng)具有潛在優(yōu)點(diǎn)，卻幾乎未曾報(bào)道過心臟中的成功。來自心血管系統(tǒng)的極小量數(shù)據(jù)暗示，上述二元系統(tǒng)在心臟組織中不是強(qiáng)有力的，并且不可能獲得常規(guī)的成功。此外，這些系統(tǒng)需要開發(fā)大量轉(zhuǎn)基因系以獲得適合于受調(diào)控的、心臟優(yōu)先的轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因工作對(duì)。而且，某些激活物轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體在宿主動(dòng)物中誘導(dǎo)心臟病表型——甚至當(dāng)該動(dòng)物不含有靶轉(zhuǎn)基因或效應(yīng)器構(gòu)建體時(shí)。心臟病表型在靶轉(zhuǎn)基因缺失時(shí)的出現(xiàn)使得這些動(dòng)物對(duì)于用作心臟病和心臟疾病的轉(zhuǎn)基因模型不夠理想。因此，需要開發(fā)用于研究心臟疾病和狀況的可調(diào)控、轉(zhuǎn)基因模型系統(tǒng)。重要的是開發(fā)允許靶轉(zhuǎn)基因在任何發(fā)育階段受控表達(dá)的可調(diào)控的心臟優(yōu)先的轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)。尤其重要的是開發(fā)用于研究心臟病的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)模型。發(fā)明概述本發(fā)明提供用于異源核苷酸序列的心臟優(yōu)先表達(dá)的組合物及方法。本發(fā)明的組成包括誘導(dǎo)型心臟優(yōu)選啟動(dòng)子核苷酸序列、表達(dá)盒、載體、宿主細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞以及動(dòng)物，尤其是含有本發(fā)明核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因小鼠。本發(fā)明的表達(dá)盒、載體、宿主細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和動(dòng)物含有一個(gè)包含與目的核苷酸序列可操作性相連的本發(fā)明核苷酸序列的表達(dá)盒。在一種實(shí)施方式中，該啟動(dòng)子能夠引發(fā)心臟優(yōu)先的轉(zhuǎn)錄，特別是心室優(yōu)先的轉(zhuǎn)錄。在本發(fā)明的動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因小鼠中，目的核苷酸序列的表達(dá)，尤其是在心臟組織中的表達(dá)得以改變。在一種實(shí)施方式中，目的核苷酸序列的表達(dá)是心室優(yōu)先的。在一種實(shí)施方式中，目的核苷酸序列的表達(dá)是誘導(dǎo)型的。在一種實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因小鼠基因組含有與編碼心肌成分的目的核苷酸序列可操作性相連的能夠引發(fā)心室優(yōu)先轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。含有與本發(fā)明核苷酸序列可操作性相連的目的核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出目的核苷酸序列誘導(dǎo)型的改變的表達(dá)。在一種實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因小鼠基因組含有與編碼ELC1a的核苷酸序列可操作性相連的本發(fā)明的核苷酸序列。在一種實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因小鼠基因組含有與編碼組成型活性形式GSK-3β的核苷酸序列可操作性相連的本發(fā)明的核苷酸序列。本發(fā)明包括強(qiáng)誘導(dǎo)型以及最低程度泄漏的效應(yīng)器基因座(responderlocus)。該效應(yīng)器基因座示于SEQIDNO1中。本發(fā)明的效應(yīng)器衍生自小鼠α-肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子序列。介于核苷酸-3000和-40間的核苷酸序列替換五個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控盒。所得的效應(yīng)器基因座是一個(gè)依賴于拷貝數(shù)、不依賴位置的基因座，其中可以插入各種不同的目的轉(zhuǎn)基因。當(dāng)未被誘導(dǎo)時(shí)，這些轉(zhuǎn)基因是沉默的。當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)，這些轉(zhuǎn)基因是非?；钴S的。之后可以利用誘導(dǎo)型系統(tǒng)將這些基因關(guān)閉。本發(fā)明提供了在動(dòng)物中改變目的核苷酸序列表達(dá)的方法。通過本發(fā)明的方法可以改變動(dòng)物對(duì)各種心臟病的易感性，包括但不限于心肌病。心肌病包括，但不限于，家族性肥厚型心肌病、擴(kuò)張性心肌病、圍產(chǎn)期心肌病和限制性心肌病。在一種實(shí)施方式中，動(dòng)物表現(xiàn)出心臟病易感性增加。在一種實(shí)施方式中，動(dòng)物表現(xiàn)出心臟病易感性降低。開發(fā)了含有一個(gè)帶有能夠在動(dòng)物中引發(fā)組織優(yōu)先(特別是心臟優(yōu)先)的轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列的啟動(dòng)子的表達(dá)盒。該啟動(dòng)子與異源目的核苷酸序列可操作性相連。利用含有與異源目的核苷酸序列可操作性相連的能夠引發(fā)心臟優(yōu)先表達(dá)的本發(fā)明核苷酸序列的表達(dá)盒來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。該動(dòng)物的基因組整合了至少一個(gè)含有該啟動(dòng)子和目的核苷酸序列的表達(dá)盒。在對(duì)啟動(dòng)子的誘導(dǎo)下，目的核苷酸序列優(yōu)先在心臟組織中表達(dá)。目的核苷酸序列的誘導(dǎo)型表達(dá)以可探測(cè)的水平出現(xiàn)。在一種實(shí)施方式中，目的核苷酸序列編碼心肌成分，例如，但不限于，α-肌球蛋白重鏈、β-肌球蛋白重鏈、基本肌球蛋白輕鏈-1、肌動(dòng)蛋白、兒茶酚胺受體和糖原合酶3-β。本發(fā)明提供了鑒定抗心臟病成分的方法。在一種實(shí)施方式中，提供了至少兩只在其基因組中含有至少一個(gè)穩(wěn)定整合的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因小鼠，所述表達(dá)盒含有與異源目的核苷酸序列可操作性相連的本發(fā)明核苷酸序列。向第一小鼠施用一種化合物。將第一和第二小鼠飼養(yǎng)一段時(shí)間。監(jiān)控兩種小鼠的心臟病表型。心臟病表型包括，但不限于，死亡率、心肌細(xì)胞混亂、間隙纖維化、心臟收縮功能障礙、心臟舒張功能障礙、左心室肥大、心臟質(zhì)量異常(cardiacmassabnormalities)、右心室流出管阻塞、形態(tài)學(xué)變化、細(xì)胞退化、和過度收縮。附圖簡(jiǎn)述附圖1描寫與本發(fā)明核苷酸序列(SEQIDNO1)可操作性相連的心房形式基本輕鏈-1(ELC1a，SEQIDNO5)基因的心室優(yōu)先表達(dá)。版A示出分離自非轉(zhuǎn)基因(NTG)對(duì)照小鼠和三個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠系的RNA斑點(diǎn)印跡分析結(jié)果。硝化纖維膜上印跡了5μgRNA。用ELC1a特異性寡核苷酸探針與膜雜交。用甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)表達(dá)將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。泳道1和2分別包含分離自心房和左心室組織的RNA。泳道3、5、和7包含分離自左心室(LV)組織的RNA。泳道4、6、和8包含分離自右心室(RV)組織的RNA。三個(gè)轉(zhuǎn)基因系不含激活物構(gòu)建體。版B示出非轉(zhuǎn)基因小鼠和三個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠系的蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果。泳道1和2包含來自非轉(zhuǎn)基因小鼠心房(泳道2)和心室(泳道1)組織的蛋白質(zhì)。泳道3、5、和7包含來自三個(gè)轉(zhuǎn)基因系左心室(LV)組織的蛋白質(zhì)。泳道4、6、和8包含來自三個(gè)轉(zhuǎn)基因系右心室(RV)組織的蛋白質(zhì)。版C示出非轉(zhuǎn)基因小鼠心房組織(泳道1)以及轉(zhuǎn)基因系各種不同組織的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果。各泳道包含30μg來自下列組織的蛋白質(zhì)泳道2，左心室(LV)；泳道3，右心室(RV)；泳道4，心房(At)；泳道5，橫隔膜(Dia)；泳道6，比目魚肌(Sol)；泳道7，二頭肌(Bi)；泳道8，脛骨肌(Tib)；泳道9，咬肌(Mass)；泳道10，舌(Ton)；泳道11，胃(Sto)；泳道12，小腸(S.int)；泳道13，主動(dòng)脈(Ao)；泳道14，肺；泳道15，肝(Liv)；和泳道16，脾(Spl)。肺組織包含肺心肌層，其衍生自心房組織并由環(huán)繞肺靜脈和小靜脈亞群的一薄層心房樣細(xì)胞組成。附圖2示出肌絲蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果。凝膠用考馬斯染色。在凝膠右側(cè)用箭頭指示了心室(ELC1v)和心房(ELC1a)同工型的遷移圖。各泳道下方指示了轉(zhuǎn)基因心房同工型取代天然ELC1v同工型的百分?jǐn)?shù)。版A示出，強(qiáng)力霉素(625mg/kg食物)存在和缺失情況下幾個(gè)小鼠系的結(jié)果。泳道1含有分子量標(biāo)記，凝膠左側(cè)標(biāo)示了大小。泳道2和3包含分別分離自非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏男姆亢妥笮氖医M織的蛋白質(zhì)。泳道4-9包含分離自幾個(gè)轉(zhuǎn)基因系心室組織的蛋白質(zhì)。泳道4中所示的轉(zhuǎn)基因系包含激活物構(gòu)建體(tTA)。泳道5中所示的轉(zhuǎn)基因系包含與ELC1a基因(MHCminTet0-ELC1a)可操作性相連的本發(fā)明效應(yīng)器構(gòu)建體。泳道6中所示的雙重轉(zhuǎn)基因系同時(shí)包含激活物構(gòu)建體(tTA)和與ELC1a基因(MHCminTet0-ELC1a)可操作性相連的效應(yīng)器構(gòu)建體兩者。來自MHCminTet0-ELC1a同源轉(zhuǎn)基因系的蛋白載入了泳道7中。泳道8和9包含來自用強(qiáng)力霉素(Dox)(625mg/kg飼料)飼喂的動(dòng)物的蛋白質(zhì)。雙重轉(zhuǎn)基因系示于泳道8。泳道9包含來自MHCminTet0-ELC1a同源轉(zhuǎn)基因系的蛋白質(zhì)。附圖2，版B示出對(duì)小鼠食譜中的強(qiáng)力霉素的滴定結(jié)果。泳道1包含分子量標(biāo)記。泳道2和3包含來自非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈笮姆亢妥笮氖业牡鞍踪|(zhì)。泳道4中所示的轉(zhuǎn)基因系包含激活物構(gòu)建體(tTA)。泳道5中所示的轉(zhuǎn)基因系包含與ELC1a基因(MHCminTet0-ELC1a)可操作性相連的效應(yīng)器構(gòu)建體。雙重轉(zhuǎn)基因系示于泳道6。泳道7-9包含獲自異源、雙重轉(zhuǎn)基因小鼠的蛋白質(zhì)。小鼠先用指定水平的強(qiáng)力霉素飼喂了三周，然后收集心室組織。泳道7，100mg強(qiáng)力霉素/kg食物；泳道8，200mg強(qiáng)力霉素/kg食物；泳道9，625mg強(qiáng)力霉素/kg食物。附圖3描述，在表達(dá)活性GSK-3β的動(dòng)物中的肥大應(yīng)答調(diào)控的分析結(jié)果。試驗(yàn)細(xì)節(jié)在本文其它部分得以描述。編碼在C末端帶有血凝素表位的GSK-3β組成型活性形式的核酸分子與本發(fā)明的啟動(dòng)子可操作性相連。版A描述了各種試驗(yàn)方案。用于方案1的動(dòng)物不接受強(qiáng)力毒素處理。用于方案2的動(dòng)物在TAC前用強(qiáng)力霉素飼喂四周。TAC步驟后，撤出或者保持強(qiáng)力霉素。版B描繪了，接受TAC或者假步驟的動(dòng)物的左心室重量與體重比率的時(shí)間過程。版C描繪，來自幾個(gè)小鼠群的左心室重量與體重的比率。泳道1-4包含非轉(zhuǎn)基因小鼠(泳道1)、含有tTA激活物構(gòu)建體的小鼠(泳道2)、含有GSK-CA(組成型活性GSK-3β)效應(yīng)器構(gòu)建體(泳道3)、以及含有tTA激活物構(gòu)建體和GSK-CA效應(yīng)器構(gòu)建體的雙重轉(zhuǎn)基因小鼠(泳道4)的左心室體重比率。泳道5描述TAC步驟后兩周時(shí)非轉(zhuǎn)基因小鼠的左心室體重比率。泳道6描述TAC步驟后兩周時(shí)雙重轉(zhuǎn)基因小鼠的左心室體重比率。泳道7-9TAC步驟后七周時(shí)小鼠的左心室體重比率。泳道7描述來自非轉(zhuǎn)基因小鼠的結(jié)果。泳道8描述來自用強(qiáng)力霉素維持的雙重轉(zhuǎn)基因小鼠的結(jié)果。泳道9描述TAC步驟后一周撤出強(qiáng)力霉素的雙重轉(zhuǎn)基因小鼠的結(jié)果。版D示出在方案2小鼠中的GSK-3β表達(dá)蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果。蛋白質(zhì)平樣品用抗-GSK-3β抗體或抗血凝素抗體進(jìn)行探測(cè)。泳道1和2描述獲自缺失或存在強(qiáng)力霉素的非轉(zhuǎn)基因小鼠的結(jié)果。泳道3-5描述獲自飼喂過程中維持強(qiáng)力霉素的3只雙重轉(zhuǎn)基因小鼠的結(jié)果。泳道6-8描述獲自飼喂過程中撤出了強(qiáng)力霉素的3只雙重轉(zhuǎn)基因小鼠的結(jié)果。發(fā)明詳述本發(fā)明提供動(dòng)物中轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)型心臟優(yōu)先表達(dá)。本發(fā)明的組成包括分離的核酸分子、表達(dá)盒、載體、宿主細(xì)胞和含有本發(fā)明分離的核酸分子的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本發(fā)明提供在動(dòng)物中改變目的核苷酸序列表達(dá)的方法。目的核苷酸序列的表達(dá)能改變轉(zhuǎn)基因動(dòng)物對(duì)心臟病的易感性。本發(fā)明進(jìn)一步提供鑒定抗心臟病化合物的方法。本發(fā)明涉及有關(guān)可調(diào)控的心臟優(yōu)先啟動(dòng)子(SEQIDNO1)的組合物和方法以及應(yīng)用方法。本發(fā)明的動(dòng)物細(xì)胞或動(dòng)物穩(wěn)定轉(zhuǎn)化了含有與目的核苷酸序列可操作性相連的SEQIDNO1所示的心臟優(yōu)先啟動(dòng)子的表達(dá)盒。該啟動(dòng)子序列可用于以組織優(yōu)先，優(yōu)選以心臟組織優(yōu)先的表達(dá)方式來表達(dá)可操作性相連的序列。在一種實(shí)施方式中，該啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型的。含有本發(fā)明核苷酸序列的質(zhì)粒保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物專利保藏處(PatentDepositoryoftheAmericanTypeCultureCollection，(ATCC))，馬納薩斯，維吉尼亞，于_________，____，并指定專利保藏編號(hào)________。這些保藏物在國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約的條款下保持。這些保藏僅僅是為了本領(lǐng)域技術(shù)人員的方便，并不承認(rèn)根據(jù)35U.S.C?！?12必需保藏。如同一般在整體動(dòng)物中所使用的，誘導(dǎo)型表達(dá)依賴于二元系統(tǒng)且需要兩種轉(zhuǎn)基因。這兩種轉(zhuǎn)基因是激活物表達(dá)盒和含有與效應(yīng)器啟動(dòng)子可操作性連接的目的靶核苷酸序列的靶物表達(dá)盒。這樣的動(dòng)物可以通過“雙重”轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的構(gòu)建來獲得，例如，通過將兩種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物雜交，其中一種含有編碼所選蛋白的靶轉(zhuǎn)基因而另一種含有激活物轉(zhuǎn)基因。雙重轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)還用在細(xì)胞培養(yǎng)中。在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，通過幾種方法中的任一種來產(chǎn)生雙重轉(zhuǎn)基因細(xì)胞?？梢詮碾p重轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或分離細(xì)胞，或者可以將兩種轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化進(jìn)細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因可以同時(shí)或相繼的轉(zhuǎn)化進(jìn)細(xì)胞。這樣的二元系統(tǒng)的一個(gè)例子是噬菌體P1的cre/loxP重組酶系統(tǒng)。cre/loxP重組酶系統(tǒng)的描述參見例如，Lakso等人(1992)PNAS896232-6236。在Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)中，激活物轉(zhuǎn)基因編碼重組酶。如果用cre/loxP重組酶系統(tǒng)調(diào)控轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，那么需要含有同時(shí)編碼Cre重組酶以及所選靶蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物。重組酶系統(tǒng)的另一個(gè)例子是啤酒酵母(S.cerevisiae)的FLP重組酶系統(tǒng)(O′Gorman等人(1991)Science2511351-1355。一種最廣泛使用的可誘導(dǎo)系統(tǒng)是二元的、基于四環(huán)素的系統(tǒng)，它已經(jīng)被用于細(xì)胞或動(dòng)物中以通過四環(huán)素或其類似物的加入或去除來可逆地誘導(dǎo)表達(dá)。(參見Bujard(1999)。J.GeneMed.1372-374；Furth，等人(1994)。Proc.Natl.Acad.Sci.USA919302-9306；和Mansuy&Bujard(2000)。Curr.Opin.Neurobiol.10593-596，引入本文作為參考。)四環(huán)素類似物包括，但不限于，強(qiáng)力霉素；去甲基金霉素；土霉素；米諾環(huán)素；高壓滅菌的金霉素；偉霸霉素；賴氨甲四環(huán)素；DMG-米諾環(huán)素；經(jīng)過化學(xué)修飾的四環(huán)素例如CMT-5、CMT-3、和CMT-8；Co13；以及glycylcyclines，例如GAR-936和9-(N-N-二甲基甘氨酰胺)6二甲基6脫氧土霉素。在基于四環(huán)素的系統(tǒng)中，兩個(gè)轉(zhuǎn)基因是1)驅(qū)動(dòng)與轉(zhuǎn)錄激活物蛋白質(zhì)VP-16相連的tet-控制的反式激活物(tTA)序列的心臟優(yōu)先啟動(dòng)子，和2)由與5-7個(gè)tet操縱子拷貝相連的巨細(xì)胞病毒最小啟動(dòng)子構(gòu)成的效應(yīng)器啟動(dòng)子。對(duì)于心臟優(yōu)先表達(dá)，心臟優(yōu)先啟動(dòng)子，例如α-肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子，控制tTA蛋白質(zhì)的表達(dá)。之后將效應(yīng)器啟動(dòng)子可操作性連接于將要被條件化控制的靶轉(zhuǎn)基因。在四環(huán)素或其類似物存在下，tTA蛋白質(zhì)與該藥物結(jié)合并且僅從效應(yīng)器啟動(dòng)子出現(xiàn)靶基因的轉(zhuǎn)錄。如果系統(tǒng)中不存在該藥物，則tTA與tetO序列結(jié)合，從而允許VP16反式激活物蛋白提高由最小啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的分離的核酸分子是一種誘導(dǎo)型、心臟優(yōu)先效應(yīng)器啟動(dòng)子?！罢T導(dǎo)型”意指，化學(xué)刺激以至少1％、5％，優(yōu)選10％、20％，更優(yōu)選30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或更高程度地改變操作性連接的目的核苷酸序列的表達(dá)。這種變化可能是表達(dá)水平上的提升或降低。本文其它部分描述了檢測(cè)表達(dá)水平的方法。化學(xué)刺激可以施加也可以撤出。各種化學(xué)刺激是本領(lǐng)域已知的。在一種實(shí)施方式中，該化學(xué)刺激是四環(huán)素或其類似物?！胺€(wěn)定轉(zhuǎn)化的”意指，動(dòng)物細(xì)胞的核基因組或者動(dòng)物的至少一個(gè)細(xì)胞的核基因組已經(jīng)整合了至少一個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)基因。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物含有至少一個(gè)含有目的核苷酸序列的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在一種實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生殖系細(xì)胞的基因組中含有目的核苷酸序列。本發(fā)明包括分離的或基本純化的核酸或蛋白質(zhì)組合物?！胺蛛x的”或基本“純化的”核酸分子或其生物活性蛋白質(zhì)是指當(dāng)其是由重組技術(shù)制備而得時(shí)其基本不含其它細(xì)胞物質(zhì)、或培養(yǎng)基或者當(dāng)其是由化學(xué)合成時(shí)基本不含化學(xué)前體或其它化學(xué)藥品。優(yōu)選地，“分離的”核酸分子不含在該核酸所來源的生物的基因組DNA中天然存在于該核酸側(cè)翼(也即，位于該核酸5′和3′末端)的序列(優(yōu)選多肽編碼序列)。例如、在不同的實(shí)施方式中、分離的核酸分子可包含小于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、或0.1kb的在該核酸所來源的細(xì)胞的基因組DNA中天然存在于該核酸分子側(cè)翼的核苷酸序列。分離啟動(dòng)子區(qū)域的方法是本領(lǐng)域熟知的?！胺蛛x的”意指，該啟動(dòng)子序列已經(jīng)被確定，并且可以通過分子技術(shù)提取或通過化學(xué)手段合成。在任一實(shí)例中，該啟動(dòng)子都被除去了其至少一個(gè)天然狀態(tài)下的側(cè)翼序列。所公開的核苷酸序列的片段或變體也包括在本發(fā)明內(nèi)?！捌巍币庵负塑账嵝蛄械囊徊糠?。核苷酸序列片段可能保持生物活性并驅(qū)動(dòng)表達(dá)，特別是心臟優(yōu)先的表達(dá)，更特別是心室優(yōu)先表達(dá)，以及更特別優(yōu)選誘導(dǎo)型、心臟優(yōu)先表達(dá)?；蛘撸米麟s交探針的核苷酸序列片段通常不保持生物活性。因此，核苷酸序列片段可以介于SEQIDNO1的至少約25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、2950、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3450、3500、3550、3600、3650、3700、3750、3800、3850、3900、3950、4000、4050、4100、4150、4200、4250、4300、4350、4400、4450、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、4950、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、4950、5000、5050、5100、5150、5200、5250、5300、5350、5400、5450、5500、5550、5600、5650、5700、至高達(dá)約5735個(gè)核苷酸。因此誘導(dǎo)型心臟優(yōu)先啟動(dòng)子的核苷酸序列片段可以編碼誘導(dǎo)型、心臟組織優(yōu)先的啟動(dòng)子的生物活性部分，或者它可以是可用作以下所公開的方法的雜交探針或PCR引物的片段。可以通過分離本文所公開的啟動(dòng)子核苷酸序列的一部分、以及評(píng)估該啟動(dòng)子部分的活性來制備誘導(dǎo)型心臟優(yōu)先啟動(dòng)子的生物活性部分。作為可誘導(dǎo)心臟優(yōu)先啟動(dòng)子片段的核酸分子含有SEQIDNO1的25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、2950、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400、3450、3500、3550、3600、3650、3700、3750、3800、3850、3900、3950、4000、4050、4100、4150、4200、4250、4300、4350、4400、4450、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、4950、4500、4550、4600、4650、4700、4750、4800、4850、4900、4950、5000、5050、5100、5150、5200、5250、5300、5350、5400、5450、5500、5550、5600、5650、5700、至高達(dá)約5735個(gè)核苷酸?！白凅w”意指基本相似的序列。對(duì)于核苷酸序列，可以用熟知的分子生物技術(shù)鑒定天然存在的變體，例如，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)以及下述的雜交技術(shù)。變體核苷酸序列還包括合成衍生的核苷酸序列，例如通過利用，例如，定點(diǎn)誘變產(chǎn)生的那些變體。通常，本發(fā)明特定核苷酸序列的變體將與該特定核苷酸序列具有利用本文其它部分所述的序列比對(duì)程序以默認(rèn)參數(shù)確定的至少95％、96％、97％，優(yōu)選98％、99％或更高的同一性。誘變以及核苷酸序列改變的方法是本領(lǐng)域熟知的。參見，例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82488-492；Kunkel等人(1987)MethodsinEnzymol.154367-382；美國(guó)專利4,873,192；Walker和Gaastra，eds.(1983)TechniquesinMolecularBiology(MacMillanPublishingCo.，NewYork)以及其中所引用的文獻(xiàn)。變體核苷酸序列還包括衍生自突變或重組方法例如DNA穿梭產(chǎn)生的序列。通過這樣一種方法，可以對(duì)包括本文所公開的啟動(dòng)子序列的一個(gè)或多個(gè)不同啟動(dòng)子序列進(jìn)行操作以創(chuàng)造出具有目的特性的新啟動(dòng)子序列。以這種方式，可以從含有具有基本序列同一性并能在體內(nèi)或體外發(fā)生同源重組的序列區(qū)域的相關(guān)序列多核苷酸群體產(chǎn)生重組多核苷酸文庫。這樣的DNA穿梭策略是本領(lǐng)域已知的。參見，例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.9110747-10751；Stemmer(1994)Nature370389-391；Crameri等人(1997)NatureBiotech.15436-438；Moore等人(1997)J.Mol.Biol.272336-347；Zhang等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.944504-4509；Crameri等人(1998)Nature391288-291；Miyazaki(2002)NucleicAcidsResearch30E139-9；Song等人(2002)Appl.Environ.Microbiol.686146-51；Hayes等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.9915926-31；Coco等人(2001)NatureBiotechnol.19354-9；Kikuchi等人(2000)Gene243133-7；及美國(guó)專利5,606,793和5,837,458。以下術(shù)語用于描述兩條或多條核酸或核苷酸序列間的序列關(guān)系(a)“查詢序列”，(b)“對(duì)比窗”，c)“序列同一性”，(d)“序列同一性百分?jǐn)?shù)”，和(e)“基本同一”。(a)如本文所使用，“查詢序列”是一條用作序列比較基礎(chǔ)的確定的序列。查詢序列可以是某一特異序列的亞組或完整序列；例如，是全長(zhǎng)cDNA或基因序列或完整cDNA或基因序列的片段。(b)如本文所使用，“對(duì)比窗”是指多核苷酸序列的連續(xù)且特異的片段，其中為進(jìn)行兩條序列間的最理想比對(duì)，該多核苷酸序列與查詢序列(其不含添加或缺失)相比在對(duì)比窗中可能含有添加或缺失部分(即空缺)。通常對(duì)比窗為至少長(zhǎng)為20個(gè)連續(xù)的核苷酸，而且可選30、40、50、100個(gè)或更長(zhǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，為避免由于多核苷酸序列中包括缺口而產(chǎn)生的與查詢序列的高度相似性，通常引入缺口罰分，并將其從匹配數(shù)中減去。用于比較的序列的比對(duì)方法是本領(lǐng)域熟知的。因此，可以用數(shù)學(xué)算法來完成任意兩條序列間的序列同一性百分?jǐn)?shù)的確定。這樣的數(shù)學(xué)算法的優(yōu)選非限制性例子有Myers和Miller(1988)的算法，CABIOS411-17；Smith等人(1981)的局部同源性算法，Adv.Appl.Math.2482；Needleman和Wunsch(1970)的同源性比對(duì)算法，J.Mol.Bio1.48443-453；Pearson和Lipman(1988)的相似性搜索方法，Proc.Natl.Acad.Sci.852444-2448；Karlin和Altschul(1990)的算法，Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264，Karlin和Altschul所改良的(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873-5877?？梢詫⑦@些數(shù)學(xué)算法的計(jì)算機(jī)執(zhí)行用于序列比較以確定序列同一性。為本發(fā)明目的，優(yōu)選用GCG程序GAP(版本10.00或更新)以其默認(rèn)參數(shù)或任何相當(dāng)?shù)某绦騺肀容^核苷酸或蛋白質(zhì)以確定與本發(fā)明所公開序列的序列同一性百分?jǐn)?shù)?！跋喈?dāng)?shù)某绦颉币庵溉魏涡蛄斜容^程序，對(duì)于任意兩條待查詢的序列，它都產(chǎn)生與由優(yōu)選程序所產(chǎn)生的對(duì)應(yīng)比對(duì)相同的核苷酸或氨基酸殘基匹配以及相同的百分?jǐn)?shù)序列同一性的比對(duì)。序列比較程序包括，但不限于PC/Gene程序(可獲自Intelligenetics，MountainView，California)中的CLUSTAL；WisconsinGeneticsSoftwarePackage，第8版(可獲自GeneticsComputerGroup(GCG)，575ScienceDrive，Madison，Wis.，USA)中的ALIGN程序(2.0版)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、以及TFASTA?？梢杂眠@些程序以默認(rèn)參數(shù)完成比對(duì)。Higgins等人(1988)Gene73237-244(1988)；Higgins等人(1989)CABIOS5151-153；Corpet等人(1988)NucleicAcidsRes.1610881-90；Huang等人(1992)CABIOS8155-65；和Pearson等人(1994)Meth.Mol.Biol.24307-331都詳細(xì)描述了CLUSTAL程序。ALIGN程序是以上述Myers和Miller(1988)的算法為基礎(chǔ)的。當(dāng)比較氨基酸序列時(shí)，可以使用PAM120重量殘基表(weightresiduetable)、缺口長(zhǎng)度罰分12、以及缺口罰分4。Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215403的BLAST程序是以上述Karlin和Altschul(1990)的算法為基礎(chǔ)的?？梢杂肂LASTN程序、分值＝100、字長(zhǎng)＝12，來完成BLAST核苷酸搜索，以獲得與編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核苷酸序列同源的核苷酸序列。可以用BLASTX程序、分值＝50、字長(zhǎng)＝3，來完成BLAST蛋白質(zhì)搜索，以獲得與本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽同源的氨基酸序列。為得到比較為目的的缺口比對(duì)，可以利用如Altschul等人(1997)NucleicAcidsRes.253389中所描述的GappedBLAST(在BLAST2.0中)?；蛘撸梢杂肞SI-BLAST(在BLAST2.0中)完成探測(cè)分子間遠(yuǎn)近關(guān)系(distantrelationships)的重復(fù)搜索。參見上述Altschul等人(1997)。當(dāng)利用BLAST、GappedBLAST、PSI-BLAST的時(shí)候，各程序可以使用各自的默認(rèn)參數(shù)(例如，核苷酸序列的BLASTN，蛋白質(zhì)的BLASTX)。參見http//www.ncbi.nlm.nih.gov。也可以通過人工檢查來完成比對(duì)。(c)如本文所使用，多肽或核酸序列在上下文中的“序列同一性”或“同一性”是指，當(dāng)在某一特定對(duì)比窗兩條序列進(jìn)行最大比對(duì)時(shí)兩條序列中相同的殘基。當(dāng)用序列同一性百分?jǐn)?shù)來指示蛋白質(zhì)時(shí)，可以認(rèn)識(shí)到不一致的殘基位置常常由于保守氨基酸取代而不同，此處氨基酸殘基被具有相似化學(xué)特性(例如，電荷或疏水性)的其它氨基酸殘基取代且因此不改變?cè)摲肿拥墓δ芴匦?。?dāng)序列區(qū)別在于保守取代時(shí)，可以將百分比序列同一性上調(diào)以校正取代的保守本質(zhì)。以這樣的保守取代相區(qū)別的序列被稱作具有“序列相似性”或“相似性”。這一調(diào)整手段是本領(lǐng)域熟知的。這典型地涉及將保守取代記為部分而非完全不匹配，從而提高序列同一性百分?jǐn)?shù)。因此，例如，當(dāng)給相同的氨基酸記分為I且非保守取代記分為零時(shí)，對(duì)保守取代的記分介于零和一之間。例如，如同程序PC/GENE(Intelligenetics，MountainView，Calif.)中所執(zhí)行的來計(jì)算保守取代的記分。(d)如本文所使用，“序列同一性百分?jǐn)?shù)”意指通過將兩條最理想比對(duì)的序列在對(duì)比窗中做比較而測(cè)定的值，其中為進(jìn)行兩條序列間的最理想比對(duì)，與查詢序列(其不含添加或缺失)相比該多核苷酸序列在對(duì)比窗中的部分可能含有添加或缺失。該百分?jǐn)?shù)通過如下來計(jì)算確定在兩條序列中都出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)量以得到匹配位置的數(shù)量、用匹配位置的數(shù)量除對(duì)比窗中的位置總數(shù)、以及將該結(jié)果乘以100以得到序列同一性百分?jǐn)?shù)。(e)(i)術(shù)語多核苷酸序列的“基本同一”意指某一多核苷酸序列含有，用上述比對(duì)程序以標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)與查詢序列進(jìn)行比較時(shí)具有至少70％序列同一性、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％、以及最優(yōu)選至少95％的序列同一性。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，通過考慮密碼子簡(jiǎn)并、氨基酸相似性、閱讀框位置等，可以適當(dāng)?shù)恼{(diào)整這些值以確定由兩條核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的對(duì)應(yīng)同一。為此目的氨基酸序列的基本同一通常意味著至少60％的序列同一性，更優(yōu)選至少70％、80％、90％，以及最優(yōu)選至少95％的序列同一性。另一種表明核苷酸序列基本相同的指示是兩個(gè)分子在嚴(yán)緊條件下相互雜交。通常，在所限定的離子強(qiáng)度和pH下對(duì)特異序列選擇的嚴(yán)緊條件為低于熱解鏈溫度(Tm)約5℃。然而，依賴于本文中另外限制的目的嚴(yán)緊程度，嚴(yán)緊條件包括比Tm低約1℃至約20℃范圍內(nèi)的溫度。在嚴(yán)緊條件下不相互雜交的核酸如果所編碼的多肽基本相同，則仍然是基本相同的。這可能出現(xiàn)在，例如，當(dāng)一個(gè)核酸拷貝是用遺傳密碼允許的最大密碼簡(jiǎn)并產(chǎn)生的時(shí)候。兩條核酸序列基本相同的指示是，第一條核酸所編碼的多肽與第二條核酸所編碼的多肽具有免疫交叉反應(yīng)性。(e)(ii)術(shù)語肽的“基本相同”是指含有在特異對(duì)比窗中與查詢序列具有至少70％序列同一性、優(yōu)選80％、更優(yōu)選85％、最優(yōu)選至少90％或95％序列同一性的序列的肽。優(yōu)選，用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48443-453的同源性比對(duì)算法來完成最理想的比對(duì)。表示兩條肽序列基本相同的指示是，一條肽與針對(duì)第二條肽的抗體具有免疫反應(yīng)性。因此，例如，當(dāng)兩條肽區(qū)別僅在于保守取代時(shí)，某肽與第二條肽基本相同?！盎鞠嗨频摹彪娜缟纤龉蚕硇蛄?，除了不相同的殘基的位置可能由于保守氨基酸改變而不同。本文所公開的核苷酸序列可用于鑒定細(xì)胞、組織以及動(dòng)物中的對(duì)應(yīng)序列。以這種方式，可以使用象PCR、雜交、以及類似的這樣的方法基于與本文所示序列的序列同源性來鑒定這樣的序列。這些技術(shù)可以用作確定動(dòng)物或動(dòng)物細(xì)胞中存在本發(fā)明啟動(dòng)子序列的診斷檢測(cè)方法。在PCR方法中，可以設(shè)計(jì)寡核苷酸引物用于PCR反應(yīng)以從抽提自任何目的動(dòng)物的cDNA或基因組DNA擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的DNA序列。設(shè)計(jì)PCR引物和PCR克隆的方法是本領(lǐng)域公知的，而且公開在Sambrook等人(1989)MolecularCloningALaboratoryManual(2ded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress，Plainview，N.Y.)中。還可參見Innis等人，eds.(1990)PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplications(AcademicPress，NewYork)；Innis和Gelfand，eds.(1995)PCRStrategies(AcademicPress，NewYork)；以及Innis和Gelfand，eds.(1999)PCRMethodsManual(AcademicPress，NewYork)。已知的PCR方法包括，但不限于，使用配對(duì)引物、巢式引物、單特異性引物、簡(jiǎn)并引物、基因特異性引物、載體特異性引物、部分錯(cuò)配的引物等的方法。在雜交技術(shù)中，將全部或部分已知的核苷酸序列用作選擇性與存在于所選生物的克隆基因組DNA片段或cDNA片段群體(即，基因組或cDNA文庫)中的其它對(duì)應(yīng)序列雜交的探針。該雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段、或其它寡核苷酸，且可以用可探測(cè)的基團(tuán)例如32P、或任何其它可探測(cè)的標(biāo)記來標(biāo)記。因此，例如，可以通過對(duì)基于本發(fā)明啟動(dòng)子序列的合成寡核苷酸進(jìn)行標(biāo)記來制備雜交探針。制備雜交探針、構(gòu)建cDNA和基因組文庫的方法是本領(lǐng)域公知的，并公開于Sambrook等人(1989)MolecularCloningALaboratoryManual(第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，Plainview，N.Y.)。例如，本文公開的完整啟動(dòng)子序列、或其一個(gè)或多個(gè)部分，可用作能特異性與相應(yīng)啟動(dòng)子序列雜交的探針。為在各種條件下實(shí)現(xiàn)雜交，這樣的探針包括在誘導(dǎo)型心臟優(yōu)選啟動(dòng)子中獨(dú)特的序列，且優(yōu)選至少長(zhǎng)約10核苷酸、以及最優(yōu)選至少長(zhǎng)約20核苷酸。這樣的探針可用于利用PCR從所選動(dòng)物擴(kuò)增相應(yīng)的啟動(dòng)子序列。雜交技術(shù)包括平皿DNA文庫(或噬斑或菌落；參見，例如，Sambrook等人(1989)MolecularCloningALaboratoryManual(第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，Plainview，N.Y.)的雜交篩選。可以在嚴(yán)緊條件下完成這樣的序列的雜交。“嚴(yán)緊條件”或“嚴(yán)緊雜交條件”意指這樣的條件，在該條件下探針以比對(duì)其它序列更高的可探測(cè)程度與其靶序列雜交(例如，至少是背景的兩倍)。嚴(yán)緊條件是序列依賴性的而且在不同情況中會(huì)不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)緊度，可以鑒定與探針100％互補(bǔ)的靶序列(同源探測(cè))?；蛘撸梢哉{(diào)節(jié)嚴(yán)緊條件以允許序列中的一些錯(cuò)配從而能夠檢測(cè)低程度相似性(異源探測(cè))。一般，探針長(zhǎng)度小于約1000核苷酸，優(yōu)選小于500核苷酸。典型地，嚴(yán)緊條件可以是這樣的條件，其中鹽濃度低于約1.5MNa離子，典型地約0.01至1.0MNa離子濃度(或其它鹽)，pH7.0至8.3，且溫度對(duì)于短探針(例如，10至50個(gè)核苷酸)為至少約30℃和對(duì)于長(zhǎng)探針(例如，大于50個(gè)核苷酸)為至少約60℃。添加去穩(wěn)定劑例如甲酰胺可以實(shí)現(xiàn)嚴(yán)緊條件。示例性的低嚴(yán)緊條件包括在30至35％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS(十二烷基磺酸鈉)中于37℃雜交，并在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0MNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中于50至55℃洗滌。示例性的中度嚴(yán)緊條件包括在40至45％甲酰胺、1.0MNaCl、1％SDS(十二烷基磺酸鈉)中于37℃雜交，并在0.5×至1×SSC(20×SSC＝3.0MNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中于50至60℃洗滌。示例性的高度嚴(yán)緊條件包括與含有50％甲酰胺、1.0MNaCl、1％SDS中于37℃雜交，并在0.1×SSC中于60至65℃洗滌。通常雜交持續(xù)時(shí)間小于約24小時(shí)，通常約4至約12小時(shí)。特異性典型地是雜交后洗滌的函數(shù)，關(guān)鍵因子是終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度。對(duì)于DNA-DNA雜合體，Tm可以從Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138267-284的方程Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％形式)-500/L估算出來；其中M是單價(jià)陽離子的摩爾濃度，％GC是DNA中鳥嘌呤和胞嘧啶的百分?jǐn)?shù)，％形式是雜交溶液甲酰胺的百分?jǐn)?shù)％，以及L是雜合體的堿基對(duì)長(zhǎng)度。Tm是50％互補(bǔ)靶序列與完全匹配探針雜交的溫度(在所限定的離子強(qiáng)度和pH下)。每錯(cuò)配1％Tm降低約1℃；因此，可以調(diào)節(jié)Ta、雜交和/或洗滌條件以與具有目的同一性的序列雜交。例如，如果要尋找具有約90％同一性的序列，則可以使Tm降低10℃。通常，選擇嚴(yán)緊條件為在限定的離子強(qiáng)度和pH下低于特異序列及其互補(bǔ)物熱解鏈溫度(Tm)約5℃。然而，極嚴(yán)緊條件可以使用低于熱解鏈溫度(Tm)1、2、3、或4℃下的雜交和/或洗滌；中度嚴(yán)緊條件可以利用低于熱解鏈溫度(Tm)6、7、8、9、或10℃下的雜交和/或洗滌；低嚴(yán)緊條件可以利用低于熱解鏈溫度(Tm)11、12、13、14、15、或20℃下的雜交和/或洗滌。利用該方程、雜交和洗滌組合物、以及目的Tm，普通技術(shù)人員可以理解雜交和/或洗滌溶液嚴(yán)緊度的變化自然得到了描述。如果目的錯(cuò)配程度導(dǎo)致低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的Tm，則優(yōu)選將SSC濃度提高以能夠使用更高的溫度。在Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology--HybridizationwithNucleicAcidProbes，第一部分，第二章(Elsevier，N.Y.)；和Ausubel等人，eds.(1995)CurrentProtocolsinMolecularBiology，第二章(GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork)中可以找得有關(guān)核酸雜交的一般指南。參見Sambrook等人(1989)MolecularCloningALaboratoryManual(第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，Plainview，N.Y.)。因此，本發(fā)明包括，具有啟動(dòng)子活性且在嚴(yán)緊條件下與本文所公開的誘導(dǎo)型心臟優(yōu)先啟動(dòng)子序列雜交的分離的序列或其片段。這樣的序列與所公開的序列至少95％、96％、97％、98％至99％同源或更高。也即，序列的序列同一性可以在至少95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的范圍變化?？梢哉J(rèn)識(shí)到，任何目的核苷酸序列可以可操作性連接于本發(fā)明的啟動(dòng)子并在心臟組織中表達(dá)。“心臟組織”意指任何獲自心臟的組織，包括但不限于，發(fā)育上與心臟相關(guān)的組織例如肺心肌層。“心室組織”意指任何獲自心臟任一心室任何部分的組織。為本發(fā)明目的的一般目的核苷酸序列種類包括例如，涉及那些信息的基因，例如鋅指，那些涉及通訊的基因，例如激酶，和那些涉及管家的基因，例如熱休克蛋白。例如，目的核苷酸序列包括但不限于那些編碼絲氨酸-蘇氨酸激酶、鉀通道基因、一氧化氮合酶、糖蛋白受體、1類HLA、2類HLA、組織蛋白酶B、半胱氨酸氨基肽酶、酸性凝膠酶、類胰蛋白酶內(nèi)肽酶、類胰凝乳蛋白酶內(nèi)肽酶、中性凝膠酶、血管緊張素II型受體、心肌肌漿網(wǎng)狀組織Ca2+-ATP酶、肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白I、α-原肌球蛋白、TGF-β1、IGF-I、IGF-II、PDGF-B、GSK-3β、原腎素、腎素、肌球蛋白結(jié)合蛋白C、離子通道基因、視黃酸受體、α-肌球蛋白重鏈、β-肌蛋白重鏈、基本肌球蛋白輕鏈、肌動(dòng)蛋白、肌節(jié)成分、陪護(hù)蛋白、凋亡途徑元素、以及包括但不限于間線蛋白的細(xì)胞骨架元素。由本發(fā)明啟動(dòng)子表達(dá)的目的核苷酸序列可用于改變心臟表型。心臟組織的各種目的表型包括包括，但不限于，肥大；形態(tài)學(xué)，例如心室間隔厚度；左心室收縮末期或舒張末期內(nèi)徑；乳頭肌大??；左心室流出管阻塞；肌節(jié)結(jié)構(gòu)，尤其是導(dǎo)致家族性肥厚型心肌病的變化；肌球蛋白同工型表達(dá)的變化，尤其是導(dǎo)致改變心臟病易感性的變化；肌原纖維功能；心臟病易感性；對(duì)抗心臟病化合物的反應(yīng)性；受體表達(dá)；心率；心室收縮壓，心室舒張壓；動(dòng)脈收縮壓；動(dòng)脈舒張壓；收縮性；間隙纖維化；心肌細(xì)胞混亂；Ca2+敏感性；catecholine敏感性；α-腎上腺素敏感性；β-腎上腺素敏感性；血管緊張素-轉(zhuǎn)換酶抑制劑敏感性；乙胺碘呋酮敏感性；利多卡因敏感性；糖蛋白受體拮抗劑敏感性；合成代謝類固醇敏感性；細(xì)胞死亡；細(xì)胞類型可塑性；以及類似。可以在心臟組中中使異源產(chǎn)物表達(dá)或者提高內(nèi)源產(chǎn)物表達(dá)來實(shí)現(xiàn)這些結(jié)果?；蛘撸€可以通過使心臟組織中一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源產(chǎn)物，(尤其是酶或輔助因子)的表達(dá)降低來實(shí)現(xiàn)這些結(jié)果。這些變化導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表型變化。例如，本發(fā)明的啟動(dòng)子序列可用于在心室中優(yōu)先表達(dá)ELC1a(基本輕鏈1，心房同工型)并改變ELC1同工型的表達(dá)模式。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的啟動(dòng)子序列可用于表達(dá)絲氨酸-蘇氨酸激酶例如GSK-3β或GSK-3β的組成型活性形式例如GSK-CA?；蛘撸景l(fā)明的啟動(dòng)子序列可用于產(chǎn)生與心臟蛋白質(zhì)編碼序列互補(bǔ)的反義mRNA、抑制蛋白質(zhì)生產(chǎn)、以及改變異源核苷酸序列的表達(dá)?；蛘撸景l(fā)明的啟動(dòng)子序列可用于生產(chǎn)小的干擾RNA。異源核苷酸序列產(chǎn)物包括結(jié)構(gòu)蛋白、酶、輔助因子、激素、信號(hào)蛋白，以及類似。如所注釋的，與本發(fā)明所公開的一種啟動(dòng)子可操作性相連的異源核苷酸序列可以是靶基因的反義序列。因此，用這些啟動(dòng)子可以構(gòu)建與靶序列信使RNA(mRNA)至少部分互補(bǔ)的反義構(gòu)建物。構(gòu)建反義核苷酸以與相應(yīng)的mRNA雜交?？梢詫?duì)反義序列做修飾，只要該序列與相應(yīng)的序列雜交并干擾其表達(dá)。以這種方式，可以使用與相應(yīng)的被反義的序列具有70％、優(yōu)選80％、更優(yōu)選85％序列同一性的反義構(gòu)建物。此外，可以使用反義核苷酸的部分來破壞靶基因的表達(dá)。通常，可以使用具有至少50個(gè)核苷酸、100個(gè)核苷酸、200個(gè)核苷酸、或更多個(gè)核苷酸的序列。因此，本文所公開的啟動(dòng)子序列可以與反義DNA序列可操作性相連以降低或抑制心臟組織中天然蛋白質(zhì)的表達(dá)?！皢?dòng)子”或“轉(zhuǎn)錄起始區(qū)”意指一段調(diào)控區(qū)域，其通常含有TATA盒的能夠指導(dǎo)RNA聚合酶II在適當(dāng)?shù)钠鹗嘉稽c(diǎn)起始特定編碼序列的RNA合成的DNA調(diào)控區(qū)。啟動(dòng)子還可含有通常位于TATA盒上游或5′的其他識(shí)別序列，稱作上游啟動(dòng)子元件，它影響轉(zhuǎn)錄起始速率。可以認(rèn)識(shí)到，在已經(jīng)鑒定了本文所公開的啟動(dòng)子區(qū)域的核苷酸序列時(shí)，進(jìn)一步分離和鑒定5′非翻譯區(qū)中的調(diào)控元件是在現(xiàn)有技術(shù)范圍內(nèi)的。因此，本文公開的啟動(dòng)子通常進(jìn)一步定義為含有上游調(diào)控元件例如那些負(fù)責(zé)編碼基因的組織或時(shí)間性表達(dá)的元件、增強(qiáng)子及類似。這樣的元件典型地經(jīng)5′非翻譯區(qū)與目的編碼區(qū)相連，5′非翻譯區(qū)進(jìn)一步調(diào)節(jié)基因表達(dá)。以相同的方式，可以鑒定、分離能促成在目的組織例如心臟組中發(fā)生表達(dá)的啟動(dòng)子元件，并將它們與其它核心啟動(dòng)子一起使用以鞏固心臟優(yōu)先的表達(dá)。對(duì)于其5′非翻譯區(qū)不會(huì)影響細(xì)胞特異性的基因，5′非翻譯引導(dǎo)序列的替代來源可以與這些啟動(dòng)子元件結(jié)合使用。本發(fā)明的調(diào)控序列，當(dāng)其與異源目的核苷酸序列可操作性相連的并插入載體時(shí)，能夠使得用該載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的動(dòng)物心臟組織中目的核苷酸序列進(jìn)行誘導(dǎo)型心臟優(yōu)先的表達(dá)?！靶呐K優(yōu)先的(cardiac-preferred)”意指，異源序列的表達(dá)在心臟組織中是豐度最高的，盡管在其它組織類型中可能出現(xiàn)一些表達(dá)，尤其是在發(fā)育上與心臟組織相關(guān)的組織中。目的異源核苷酸序列的心臟優(yōu)先表達(dá)比在非心臟組織中目的核苷酸序列的表達(dá)高至少1％、5％、優(yōu)選10％、20％、更優(yōu)選30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高的水平?！靶氖覂?yōu)先的(ventricle-preferred)”意指，異源序列的表達(dá)在心室組織中是豐度最高的，盡管在其它組織類型中可能出現(xiàn)一些表達(dá)。目的異源核苷酸序列的心室優(yōu)先表達(dá)比在非心室組織中目的核苷酸序列的表達(dá)高至少1％、5％、優(yōu)選10％、20％、更優(yōu)選30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高的水平。在一種實(shí)施方式中，可能需要在心室中優(yōu)先表達(dá)天然在心房組織中表達(dá)的異源核苷酸序列。異源核苷酸序列從心室優(yōu)先啟動(dòng)子的表達(dá)可能不會(huì)影響與其天然啟動(dòng)子可操作相連的該核苷酸序列的心房表達(dá)?！靶姆?jī)?yōu)先的(atria-preferred)”意指，異源序列的表達(dá)在心房組織中是豐度最高的，盡管在其它組織類型中可能出現(xiàn)一些表達(dá)。目的異源核苷酸序列的心房?jī)?yōu)先表達(dá)比在非心房組織中目的核苷酸序列的表達(dá)高至少1％、5％、優(yōu)選10％、20％、更優(yōu)選30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高的水平?！爱愒春塑账嵝蛄小币庵柑烊磺闆r下不具有該啟動(dòng)子序列的序列。盡管該核苷酸序列對(duì)于該啟動(dòng)子序列是異源的，但是對(duì)于動(dòng)物宿主來說它可能是同源的、或天然的、或外源的?？梢哉J(rèn)識(shí)到，啟動(dòng)子可以與其天然編碼序列一起使用以提高或降低表達(dá)從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的動(dòng)物的心臟組織中的表型改變?？梢詫?duì)本發(fā)明分離的啟動(dòng)子序列進(jìn)行修飾以提供異源核苷酸序列一定范圍的表達(dá)水平。因此，可以使用小于整個(gè)啟動(dòng)子的區(qū)域且保持驅(qū)動(dòng)誘導(dǎo)型、心臟優(yōu)先表達(dá)的能力。然而，可以認(rèn)識(shí)到，mRNA的表達(dá)水平可以被改變并且通常通過啟動(dòng)子序列的部分缺失而降低。一般，可以用分離的啟動(dòng)子序列的至少約20個(gè)核苷酸來驅(qū)動(dòng)核苷酸序列的表達(dá)?？梢哉J(rèn)識(shí)到，為提高轉(zhuǎn)錄水平或改變組織特異性，可以將增強(qiáng)子和/或組織-優(yōu)先元件與本發(fā)明的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合使用。例如，可以將來自其它心臟優(yōu)先啟動(dòng)子的定量或組織特異性上游元件與本發(fā)明的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合使用以提高心臟優(yōu)先轉(zhuǎn)錄。這樣的元件其特征已經(jīng)得到描述，例如，鼠TIMP-4啟動(dòng)子(Rahkonen，等人(2002)BiochimBiophysActa157745-52)，A和B-型促尿鈉排肽啟動(dòng)子(Grepin等人(1994)Mol.CellBiol.143115-29)，人心臟肌鈣蛋白I啟動(dòng)子(Dellow，等人(2001)Cardiovasc.Res.503-6)、小鼠S100A1啟動(dòng)子(Kiewitz，等人(2000)BiochimBiophysActa1498207-19)、鮭魚心臟肽啟動(dòng)子(Majalahti-Palviainen，etal(2000)Endocrinology141731-740)、GATA應(yīng)答元件(Charron等人(1999)Molecular&CellularBiology194355-4365)以及類似，引入本文作為參考.可以通過在其它組織以及心臟組織中驅(qū)動(dòng)表達(dá)來改變組織特異性的其它增強(qiáng)子是本領(lǐng)域公知的，其它組織例如骨骼組織、CNS組織、肺組織、唾液腺組織、淚腺組織、以及血管組織等。這些包括，例如，水通道蛋白-5啟動(dòng)子的啟動(dòng)子上游元件(Borok，等人(2000)J.Biol.Chem.27526507-14，引入本文作為參考)，它們能給出肺和唾液腺優(yōu)先表達(dá)以及心臟優(yōu)先表達(dá)。另一個(gè)例子包括來自人α-骨骼肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的上游元件，它們能給出骨骼肌中的表達(dá)，以及心臟優(yōu)先表達(dá)。對(duì)本發(fā)明分離的啟動(dòng)子序列的修飾可以提供一定范圍的異源核苷酸序列的表達(dá)。因此，可以將它們修飾成強(qiáng)或弱啟動(dòng)子。通常，“弱啟動(dòng)子”意指以低水平驅(qū)動(dòng)編碼序列表達(dá)的啟動(dòng)子?！暗退健币庵?，約1/10,000轉(zhuǎn)錄物至約1/100,000轉(zhuǎn)錄物至約1/500,000轉(zhuǎn)錄物的水平；相反，強(qiáng)啟動(dòng)子以高水平驅(qū)動(dòng)編碼序列的表達(dá)，或以約1/10轉(zhuǎn)錄物至約1/100轉(zhuǎn)錄物至約1/1000轉(zhuǎn)錄物的水平。當(dāng)本發(fā)明所公開的心臟優(yōu)先啟動(dòng)子的核苷酸序列、及其變體或片段與異源核苷酸序列(要控制其表達(dá)以達(dá)到所需的表型應(yīng)答)可操作性相連時(shí)，其可用于任何動(dòng)物的遺傳操作?！翱刹僮餍韵噙B”意指，異源核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄受啟動(dòng)子序列的影響。以這種方式，本發(fā)明啟動(dòng)子的核苷酸序列可以在表達(dá)盒中與要將在目的動(dòng)物(更特別的是在動(dòng)物心臟)中表達(dá)的異源核苷酸序列一起提供。這樣的表達(dá)盒含有與目的核苷酸序列可操作性相連的、含有本發(fā)明啟動(dòng)子核苷酸序列或其變體或片段的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，其中目的核苷酸序列的表達(dá)受本文所公開的心臟優(yōu)先啟動(dòng)子控制。這樣的表達(dá)盒中提供了至少了一個(gè)供插入要受到調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的核苷酸序列的限制性位點(diǎn)。該表達(dá)還可以包含選擇性標(biāo)記基因。該表達(dá)盒在5′-至-3′的轉(zhuǎn)錄方向中包括，轉(zhuǎn)錄及翻譯起始區(qū)、以及異源目的核苷酸序列。除了包含轉(zhuǎn)錄起始及控制位點(diǎn)外，表達(dá)盒還可包含轉(zhuǎn)錄終止所必需的序列以及在轉(zhuǎn)錄區(qū)中含有用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。其它用于表達(dá)的調(diào)控控制元件包括起始和終止密碼子以及多聚腺苷酸化信號(hào)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠知道許多可以用于表達(dá)載體的調(diào)控序列。例如，在Sambrook等人(1989)MolecularCloningALaboratoryManual第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.)中描述了這樣的調(diào)控序列。含有與異源核苷酸序列可操作性相連的本發(fā)明啟動(dòng)子序列的表達(dá)盒還可以包含至少一條將被共轉(zhuǎn)化進(jìn)生物體中的附加的核苷酸序列。或者，該附加的序列可以在另一表達(dá)盒上提供。本文所描述的多核苷酸序列可以與之可操作性相連的調(diào)控序列包括用于指導(dǎo)mRNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這些包括，但不限于，λ噬菌體的左啟動(dòng)子，大腸桿菌的1ac、TRP和TAC啟動(dòng)子，SV40的早期和晚期啟動(dòng)子，CMV立即早期啟動(dòng)子，腺病毒早期和晚期啟動(dòng)子，以及逆轉(zhuǎn)錄病毒長(zhǎng)末端重復(fù)。除了促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的控制區(qū)，表達(dá)載體還包括調(diào)控轉(zhuǎn)錄的區(qū)域，例如阻遏物結(jié)合位點(diǎn)和增強(qiáng)子。例子包括SV40增強(qiáng)子，巨細(xì)胞病毒立即早期增強(qiáng)子，多瘤病毒增強(qiáng)子，腺病毒增強(qiáng)子以及逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR增強(qiáng)子。適當(dāng)?shù)臅r(shí)候，可以對(duì)異源核苷酸序列——其表達(dá)受本發(fā)明啟動(dòng)子序列的控制，以及任何附加核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化以在轉(zhuǎn)化動(dòng)物中提高表達(dá)。也即，可以用物種優(yōu)選的密碼子合成這些核苷酸序列以促進(jìn)表達(dá)，例如在小鼠中用小鼠優(yōu)先密碼子以促進(jìn)表達(dá)。本領(lǐng)域中可以獲得合成物種優(yōu)選的核苷酸序列的方法。參見，例如，Wada等人(1992)NucleicAcidsRes.20(Suppl.)，2111-2118；Butku8等人(1998)ClinExpPharmacolPhysiolSuppl.25S28-33；和Sambrook等人(1989)MolecularCloningALaboratoryManual第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，引入本文作為參考。為增強(qiáng)細(xì)胞宿主中基因表達(dá)的其它序列修飾是已知的。這些包括剔除假多聚腺苷酸化信號(hào)編碼序列、外顯子-內(nèi)含子拼接位點(diǎn)信號(hào)、轉(zhuǎn)座子樣重復(fù)、以及其它可能對(duì)基因表達(dá)有害的已知其特征的序列?？梢詫愒春塑账嵝蛄械腉-C含量調(diào)節(jié)到給定細(xì)胞宿主的平均水平，參照已知在該宿主細(xì)胞中表達(dá)的基因來計(jì)算?？赡艿脑挘瑢?duì)序列做修飾以避免可以預(yù)計(jì)的發(fā)夾環(huán)二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)。表達(dá)盒還可以在表達(dá)盒構(gòu)建體中包含5′前導(dǎo)序列。這樣的前導(dǎo)序列可以起增強(qiáng)翻譯的作用。翻譯前導(dǎo)序列是本領(lǐng)域已知的，包括小核糖核酸病毒前導(dǎo)序列，例如，EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎5′非編碼區(qū))(Elroy-Stein等人(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA866126-6130)；馬鈴薯Y病毒組前導(dǎo)序列，例如，TEV前導(dǎo)序列(TobaccoEtchVirus)(Allison等人(1986))；MDMV前導(dǎo)序列(玉米矮縮花葉病毒)(Virology1549-20)；和人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP)(Macejak等人(1991)Nature35390-94)。還可以利用其它增強(qiáng)翻譯和/或mRNA穩(wěn)定性的已知方法，例如，內(nèi)含子等。當(dāng)需要將異源核苷酸序列表達(dá)產(chǎn)物指向特定細(xì)胞器，尤其是線粒體、核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、或高爾基體，或分泌至細(xì)胞表面或細(xì)胞外時(shí)，表達(dá)盒可能進(jìn)一步含有編碼轉(zhuǎn)送肽的序列。這樣的轉(zhuǎn)送肽是本領(lǐng)域熟知的，且包括但不限于，?；d體蛋白的轉(zhuǎn)送肽、RUBISCO小亞基，以及類似。在制備表達(dá)盒的過程中，可以操作各種DNA片段，以為DNA序列提供正確方向且如果適當(dāng)?shù)脑?，提供正確的閱讀框。為此目的，可以利用銜接子或接頭來連接DNA片段或者可以使用其它的操作以提供便利的限制性位點(diǎn)、除去多余的DNA、除去限制性位點(diǎn)等。為此目的，可以利用體外誘變；引物修補(bǔ)；限制性；退火；取代，例如，轉(zhuǎn)換和顛換；或其任何組合。表達(dá)盒中可以包括報(bào)告基因或選擇性標(biāo)記基因。例如，Ausubel等人(2002)CurrentProtocolsinMolecularBiology.JohnWiley&Sons，NewYork，NewYork，引入本文作為參考，中可以找到本領(lǐng)域已知的適宜報(bào)告基因的例子。用于選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織的選擇性標(biāo)記基因可以包括賦予抗生素抗性的基因。適宜的選擇性標(biāo)記基因的例子包括，但不限于，編碼對(duì)下列藥物抗性的基因氯霉素(HerreraEstrella等人(1983)EMBOJ.2987-992)；氨甲蝶呤(HerreraEstrella等人(1983)Nature303209-213；Meijer等人(1991)PlantMol.Biol.16807-820)；潮霉素(Waldron等人(1985)PlantMol.Biol.5103-108；Zhijian等人(1995)PlantScience108219-227)；鏈霉素(Jones等人(1987)Mol.Gen.Genet.21086-91)；壯觀霉素(Bretagne-Sagnard等人(1996)TransgenicRes.5131-137)；博來霉素(Hille等人(1990)PlantMol.Biol.7171-176)；磺胺藥物(Guerineau等人(1990)PlantMol.Biol.15127-136)；嘌呤霉素(Abbate等人(2001)Biotechniques31336-40)；胞嘧啶阿拉伯糖苷(Eliopoulos等人(2002)GeneTher.9452-462)；6-硫鳥嘌呤(Tucker等人(1997)NucleicAcidResearch253745-46)。其它可以在轉(zhuǎn)基因事件回收中起作用但是可能在終產(chǎn)物中不是必需的基因包括但不限于，比如GUS(b-glucoronidase；Jefferson(1987)PlantMol.Biol.Rep.5387)；GFP(綠色熒光蛋白；Wang等人(2001)AnimBiotechnol12101-110；Chalfie等人(1994)Science263802)，BFP(藍(lán)色熒光蛋白；Yang等人(1998)J.Biol.Chem.2738212-6)，CAT；和熒光素酶(Riggs等人(1987)NucleicAcidRes.15(19)8115；Luchrsen等人(1992)MethodsEnzyMol.216397-414)這樣的例子。在表達(dá)載體中有用的任何調(diào)控或其它序列可以形成部分轉(zhuǎn)基因序列。這包括基因內(nèi)的序列和多聚腺苷酸化信號(hào)，如果還未包括在內(nèi)的話。在一種實(shí)施方式中，動(dòng)物細(xì)胞可以是可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的已受精卵母細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物含有至少一個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的含有目的核苷酸序列的表達(dá)盒?；蛘?，宿主細(xì)胞可以是干細(xì)胞、或其它產(chǎn)生特異細(xì)胞亞組和可用于在動(dòng)物中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因組織的早期組織前體。亦參見Thomas等人，(1987)Cell51503，對(duì)同源重組載體的描述。載體被導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞(例如，通過電穿孔)，并選擇其中所導(dǎo)入的基因與基因組間發(fā)生了重組的細(xì)胞(參見例如，Li，E.等人(1992)Cell69915)。之后將所選擇的細(xì)胞注射進(jìn)動(dòng)物的胚泡(例如，小鼠)以形成凝集嵌合體(參見例如，Bradley，A.，TeratocarcinomasandEmbryonicStemCellsAPracticalApproach，E.J.Robertson，ed.(IRL，Oxford，1987)第113-152頁)。之后可以將嵌合胚泡植入適宜的假孕雌性代孕動(dòng)物，并育至足月。生殖細(xì)胞中帶有重組DNA的后代可用于繁育動(dòng)物，通過生殖細(xì)胞傳遞轉(zhuǎn)基因，這些繁育出的動(dòng)物在其所有細(xì)胞中都含有重組DNA。構(gòu)建同源重組載體和同源重組動(dòng)物的方法進(jìn)一步描述于Bradley，A.(1991)CurrentOpinioninBiotechnology2823-829和PCT國(guó)際發(fā)明者J·羅賓斯申請(qǐng)人:兒童醫(yī)院醫(yī)療中心