專利名稱：非病毒類基因送遞系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的用于送遞核酸的非病毒類送遞系統(tǒng)。更具體而言，本發(fā)明涉及一種系統(tǒng)，在給予宿主組織后，它促進(jìn)核酸導(dǎo)入該宿主組織的細(xì)胞中。該系統(tǒng)是以含有特定化學(xué)和物理化學(xué)特征的、衍生自可生物降解的脫乙酰殼多糖多糖類的陽離子脫乙酰殼多糖寡聚物的組合物為基礎(chǔ)，該組合物能有效地送遞生物學(xué)活性核酸(如編碼所需產(chǎn)品的寡核苷酸或聚核苷酸)，并促進(jìn)所需產(chǎn)品在所述組織的細(xì)胞中表達(dá)。
背景技術(shù)：
基因治療的概念是以核酸(DNA或RNA)可作為藥物產(chǎn)品從而在適當(dāng)位點(diǎn)引起治療性蛋白質(zhì)的體內(nèi)生產(chǎn)為基礎(chǔ)。通常將送遞核酸的系統(tǒng)分為病毒類送遞系統(tǒng)和非病毒類送遞系統(tǒng)。由于其高度進(jìn)化和特化的組分，病毒類系統(tǒng)是目前最有效的DNA送遞工具，該系統(tǒng)可產(chǎn)生高效的送遞和表達(dá)。但是，病毒類送遞系統(tǒng)存在安全性問題。毒性、免疫原性、限于靶向特定細(xì)胞類型、有限的DNA攜帶能力、生產(chǎn)和包裝問題、重組和非常高的生產(chǎn)成本都阻礙了它們的臨床應(yīng)用(Luo和Saltzman，2000)。為此，在基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)室和臨床應(yīng)用中越來越需要非病毒類送遞系統(tǒng)。但是，從制藥學(xué)的角度看，由于與病毒類送遞系統(tǒng)相比非病毒類送遞系統(tǒng)在體內(nèi)獲得的表達(dá)相對(duì)較低，送遞核酸的途徑仍然是一個(gè)難題(Saeki等，1997)。
現(xiàn)有技術(shù)已描述了多種非病毒類送遞系統(tǒng)，包括陽離子脂質(zhì)、肽或聚合物與質(zhì)粒DNA(pDNA)形成的復(fù)合物(Boussif等，1995；Felgner等，1994；Hudde等，1999)。帶負(fù)電的核酸主要通過離子-離子相互作用而與陽離子分子相互作用，并從游離形式轉(zhuǎn)變形成緊密狀態(tài)。在這種狀態(tài)下，陽離子分子可提供針對(duì)核酸酶降解的保護(hù)，而且還使該核酸-陽離子復(fù)合物更易與細(xì)胞相互作用并被其攝取的表面特性(Ledley，1996)。
在這些陽離子分子中，已顯示合成的聚合物聚氮丙啶(PEI)能與pDNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物，并介導(dǎo)了轉(zhuǎn)基因在體外和體內(nèi)的相對(duì)高的表達(dá)(Boussif等，1995；Ferrari等，1997；Gautam等，2001)。為此，常用PEI作為試驗(yàn)設(shè)計(jì)的參比系統(tǒng)。但是，已提出PEI的毒性和效率之間的大致相關(guān)性(Luo和Saltzman，2000)，最近的研究還提出使用PEI所涉及到的毒性(Godbey等，2001；Putnam等，2001)。PEI的另一缺點(diǎn)是，它不是可生物降解的，因此，它可能被長時(shí)間存儲(chǔ)在體內(nèi)。因此，仍非常需要尋找有效、無毒的可生物降解的非病毒類送遞系統(tǒng)。
最常見的是通過腸胃外途徑將非病毒類送遞系統(tǒng)體內(nèi)送遞。靜脈給予小鼠后，緊密的核酸-陽離子分子復(fù)合物主要沉積在肺毛細(xì)血管中，在那基因在肺泡隔膜(alveolar septi)中毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)(Li和Huang，1997；Ki等，2000；Song等，1997)，甚至在肺泡細(xì)胞中表達(dá)(Bragonzi等，2000；Griesenbach等，1998)，但是不在上皮細(xì)胞中表達(dá)。但未配制的裸DNA在達(dá)到目的地前在血液循環(huán)中快速降解，因此通常沒有基因表達(dá)。相反，將裸DNA注射到骨骼肌肉則導(dǎo)致劑量依賴性的基因表達(dá)(Wolff等，1990)，當(dāng)將該DNA與非緊密但“相互作用”的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或聚乙烯醇(PVA)復(fù)合時(shí)，這種基因表達(dá)進(jìn)一步提高(WO 96/21470)(Mumper等，1996；Mumper等，1998)。因此，體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染是組織依賴性的，其方式不可預(yù)測(cè)，因而這仍是個(gè)挑戰(zhàn)。
還描述了非病毒類送遞系統(tǒng)的粘膜送遞，即送遞給胃腸道、鼻和呼吸道(Koping-Hoggard等，2001；Roy等，1999，WO 01/41810)。除了DNA以非緊密形式送遞到鼻組織獲得最佳的基因表達(dá)(WO 01/41810)外，當(dāng)需要在粘膜組織中獲得高基因表達(dá)時(shí)，緊密型核酸-陽離子分子復(fù)合物要優(yōu)于非緊密型DNA。
現(xiàn)有技術(shù)中，非病毒類送遞系統(tǒng)是以分子量相當(dāng)高的陽離子聚合物(如脫乙酰殼多糖)為基礎(chǔ)的，通常具有幾百個(gè)千道爾頓(kDa)，5kDa是下限(如MacLaughlin等，1998；Roy等，1999；WO 97/42975)。主要的原因是低分子量聚合物(＜5kDa)與DNA形成不穩(wěn)定的復(fù)合物，導(dǎo)致基因表達(dá)少(Koping-Hoggard，2001)。但是，使用高分子量陽離子分子具有很多缺點(diǎn)，如緊密型核酸-陽離子分子復(fù)合物的聚集增加和溶解度問題(MacLaughlin等，1998)。此外，使用較低分子量的陽離子分子存在一些生物學(xué)優(yōu)點(diǎn)，即與較高分子量的陽離子分子相比，它們通常顯示出較低的毒性和較弱的補(bǔ)體激活(Fischer等，1999；Plank等，1999)。
現(xiàn)有技術(shù)已描述了使用低分子量陽離子分子與核酸復(fù)合的一些例子(Florea，2001；Godbey等，1999；Koping-Hoggard，2001；MacLaughlin等，1998；Sato等，2001)。但是，這些低分子量陽離子分子與DNA形成不穩(wěn)定的密合體(compact)，該密合體在電場(chǎng)中分離(瓊脂糖凝膠電泳)，結(jié)果導(dǎo)致與較佳分子量陽離子分子相比沒有體外基因表達(dá)或表達(dá)量很少。這可以解釋為DNA和低分子量陽離子分子之間形成的復(fù)合物通常是不穩(wěn)定的，易于解離(Koping-Hoggard，2001)。實(shí)際上，瓊脂糖凝膠電泳期間陽離子分子-DNA密合體的離解和裸DNA的釋放在文獻(xiàn)中被用作區(qū)分無效制劑與有效制劑的試驗(yàn)(Fischer等，1999；Gebhart和Kabanov，2001；Koping-Hoggard等，2001)。這樣，現(xiàn)有技術(shù)已知DNA和陽離子之間形成的復(fù)合物必須穩(wěn)定才能介導(dǎo)高的基因表達(dá)。
現(xiàn)有技術(shù)公開了使用非病毒載體將核酸送遞給呼吸道的方法的各種例子(Deshpande等，1998；Ferrari等，1997；Gautam等，2000)。我們最近鑒別和表征了基于DNA-復(fù)合性聚合物脫乙酰殼多糖的這樣一種系統(tǒng)(Koping-Hoggard等，2001)，該脫乙酰殼多糖是一種線性多糖，可從殼多糖衍生得到。在美國專利5972707(Roy等，1999)、美國專利申請(qǐng)?zhí)?001/0031497(Rolland等，2001)和WO 98/01160中也描述了脫乙酰殼多糖基的基因送遞系統(tǒng)。
已將脫乙酰殼多糖作為緊密連接-修飾劑引入，以促進(jìn)藥物送遞通過上皮屏障(Artursson等，1994)。認(rèn)為它在給人口服后是無毒的，而且已被批準(zhǔn)作為食物添加劑使用，并且還被加到愈創(chuàng)產(chǎn)品中(Illum，1998)。
脫乙酰殼多糖包括一類由(1→4)-連接的2-乙酰胺基-2-脫氧-β-D-葡萄糖(GlcNAc，A單元)和2-氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖(GlcN，D單元)以各種組成和順序形成的水溶性的線性多糖，可參見

圖1。在此采用的將殼多糖和脫乙酰殼多糖區(qū)分開的定義是以殼多糖在稀釋的酸溶液中的不溶性和脫乙酰殼多糖在相同的稀釋酸溶液中的可溶性為基礎(chǔ)的(Roberts，1992)。
A單元和D單元的相對(duì)含量可以A單元的分?jǐn)?shù)表示
FA＝A單元數(shù)量/(A單元數(shù)量+D單元數(shù)量)FA與去-N-乙?；瘑卧陌俜直染哂幸韵玛P(guān)系％去-N-乙酰化單元＝100％-(1-FA)。
每個(gè)D單元含有親水性可質(zhì)子化的氨基基團(tuán)，而每一A單元含有疏水性乙酰基。兩種單體的相對(duì)量(如A/D＝FA/(1-FA))可大范圍地變化，導(dǎo)致它們的化學(xué)、物理和生物學(xué)性能的廣泛多樣性。這包括脫乙酰殼多糖在溶液、膠凝狀態(tài)和固體狀態(tài)下的性能，以及它們與其他分子、細(xì)胞和其他生物的和非生物的物質(zhì)的相互作用。
當(dāng)脫乙酰殼多糖被用于非病毒類基因送遞系統(tǒng)時(shí)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)的影響最近被證實(shí)(Koping-Hoggard等，2001)。不同化學(xué)組成的脫乙酰殼多糖顯示作為基因送遞系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)依賴性效率。僅有與pDNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物的脫乙酰殼多糖能引起顯著的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。這些復(fù)合物要求至少65％的脫乙酰殼多糖單糖被脫乙?；?。
可通過化學(xué)或酶學(xué)方式將脫乙酰殼多糖解聚，得到所需分子大小的脫乙酰殼多糖聚合物或寡聚物?？墒褂酶鞣N化學(xué)降解機(jī)制將脫乙酰殼多糖解聚，包括酸水解，亞硝酸和氧化-還原解聚作用。也可使用聚合物的超聲波解聚作用，但對(duì)于要產(chǎn)生非常低分子量的產(chǎn)物而言都是非常不方便的。使用亞硝酸將脫乙酰殼多糖解聚是常規(guī)的制備低分子量脫乙酰殼多糖的方法，這在如US3922260和US 5312908中有描述。這一機(jī)制涉及D單元的脫氨基，在新的還原端形成2，5-脫水-D-甘露糖單元，可使用NaBH4將該甘露糖單元還原成2，5-脫水-D-甘露醇(參見圖2)?；蛘哌€可使用各種酶將脫乙酰殼多糖解聚，如US5482843所述，所述酶包括脫乙酰殼多糖酶、殼多糖酶和溶菌酶。還可使用酸水解將脫乙酰殼多糖解聚(Varum等，2001；以及本文所引用的各文獻(xiàn))。
在現(xiàn)有技術(shù)中，對(duì)脫乙酰殼多糖的分子量對(duì)脫乙酰殼多糖-pDNA復(fù)合物體外轉(zhuǎn)染效率的影響的研究顯示，在20-200kDa的范圍內(nèi)轉(zhuǎn)染效率對(duì)分子量的依賴性不明顯(Koping-Hoggard等，2001；Maclaughlin等，1998)。但是，在另一研究中(Sato等，2001)，15kDa和52kDa脫乙酰殼多糖的基因表達(dá)比＞100kDa的高，但用1.3kDa脫乙酰殼多糖沒有檢測(cè)到基因表達(dá)。此外，使用一系列低分子量脫乙酰殼多糖(1.2kDa、2.4kDa和4.7kDa)的體外基因表達(dá)和肺組織體內(nèi)基因表達(dá)研究顯示，僅4.7kDa的脫乙酰殼多糖介導(dǎo)了顯著的基因表達(dá)(Koping-Hoggard，2001)。
已使用不同分子量的脫乙酰殼多糖作為用于非病毒類基因送遞的復(fù)合物的組分。例如，美國專利申請(qǐng)2001/0031497A提出使用低分子量脫乙酰殼多糖作為送遞系統(tǒng)的組分，即2-4kDa Mw的脫乙酰殼多糖，使用此類脫乙酰殼多糖得到最小的基因送遞系統(tǒng)顆粒，而且在體外用此濃縮的送遞系統(tǒng)還獲得增強(qiáng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
用于基因送遞系統(tǒng)的不同分子量脫乙酰殼多糖是從商業(yè)供應(yīng)者獲得的通常未分級(jí)分離的樣品，可使用降解劑如有機(jī)酸或無機(jī)酸、硝酸或脫乙酰殼多糖降解酶對(duì)所述樣品進(jìn)行部分降解，得到較低分子量的產(chǎn)物。但不管怎樣，分子量分布仍維持較高。舉例而言，使用折射率檢測(cè)器和多角度激光光散射檢測(cè)器對(duì)重均分子量(Mw)為180.000的市售獲得的脫乙酰殼多糖進(jìn)行尺寸排阻色譜法分析。圖3A顯示洗脫圖，即折射率檢測(cè)器信號(hào)，它與脫乙酰殼多糖的濃度成正比，圖中還結(jié)合有作為洗脫體積的函數(shù)的計(jì)算分子量(表示為成乙酸鹽形式的脫乙酰殼多糖)的圖。明顯的是，該樣品在峰的開始部分含有高達(dá)106克/摩爾(1000kDa)的分子量和在峰的末端含有低至104(10kDa)的分子量。重新計(jì)算這些數(shù)據(jù)得到的結(jié)果是累積分子量分布(圖3B)?？蓮倪@些計(jì)算值推斷，樣品的12％(w/w)的分子量低于40kDa，38％低于100kDa。同樣地，樣品的18％的分子量高于300kDa，9％高于400kDa。因此，樣品是多分散性的，因?yàn)樗胁煌肿恿炕蜴滈L的聚合物。
可以游離胺的形式或不同的鹽的形式(如脫乙酰殼多糖氯化物、脫乙酰殼多糖谷氨酸鹽和脫乙酰殼多糖乙酸鹽)提供脫乙酰殼多糖。鹽形式影響了分子量(M)和DP(每分子的糖殘基數(shù))的關(guān)系。下述方程描述了DP和M之間的關(guān)系游離堿M＝DP(161(1-FA)+203FA)＝DP(161+42FA)脫乙酰殼多糖氯化物M＝DP(197.45(1-FA)+203FA)＝DP(197.45+5.55FA)脫乙酰殼多糖乙酸鹽M＝DP(221(1-FA)+203FA)＝DP(221-18FA)脫乙酰殼多糖谷氨酸鹽M＝DP(308(1-FA)+203FA)＝DP(308-105FA)多分散性樣品的重均分子量(Mw)可表示為Mw＝∑ciMi/∑ci，其中ci是該分布內(nèi)特定分子量(Mi)的濃度(g/l)(Tanford，C.，1961，大分子的物理化學(xué)，JohnWiley和Sons，紐約，8b章節(jié))。同樣地，數(shù)均分子量(Mn)可表示為Mn＝∑ci/∑(ci/Mi)。在上述例子中，Mw＝180kDa，Mn＝84.5kDa，定義為Mw/Mn的多分散性指數(shù)為2.1。接近2的多分散性是已經(jīng)經(jīng)過隨機(jī)解聚的線性聚合物的一個(gè)特征(Tanford，C.，1961，大分子的物理化學(xué)，John Wiley和Sons，紐約，第33a章節(jié))。
線性聚合物如脫乙酰殼多糖隨機(jī)解聚后鏈長的分布由以下方程式表示(Tanford，1961)Wx＝xpx-1(1-p)2Wx是含有x個(gè)單體(對(duì)于脫乙酰殼多糖而言，單體是糖殘基)的鏈的重量分?jǐn)?shù)，p是未解離的鍵的分?jǐn)?shù)，1-p是解離的鍵的分?jǐn)?shù)。數(shù)均聚合度(xn)等于1/(1-q)。由于Mn＝M0xn，其中M0等于單體的當(dāng)量，對(duì)于N-乙?；?葡糖胺而言，當(dāng)它出現(xiàn)在脫乙酰殼多糖中時(shí)，M0為203克/摩爾，對(duì)于成游離堿形式的葡糖胺殘基而言，當(dāng)它出現(xiàn)在脫乙酰殼多糖中時(shí)，M0為161克/摩爾。對(duì)于給定的FA，平均M0等于203·FA+161·(1-FA)。
圖4顯示已被亞硝酸解聚而獲得范圍在41.500-13.400內(nèi)的重均分子量的脫乙酰殼多糖的SEC-MALLS色譜圖(4A)、微分分子量分布(4B)和累積分子量分布(4C)。圖中清楚地顯示計(jì)算的分子量分布仍然很寬。這些數(shù)據(jù)清楚表明，采用部分降解由高分子量的脫乙酰殼多糖生產(chǎn)得到的不同分子量的脫乙酰殼多糖維持著多分散性，并含有分子量迥異的鏈。
可通過選擇性除去某些部分的分布而改變聚合物的分子量分布?？刹捎媚z過濾分離具有相對(duì)短的鏈的脫乙酰殼多糖樣品，以獲得具有相對(duì)窄的分子量分布的各種寡聚物或級(jí)分。Tommerass等(2001)提供了一個(gè)例子，該文獻(xiàn)獲得了每鏈有2-10個(gè)殘基的純化的脫乙酰殼多糖寡聚物。
還可如Ottoy等(1996)就脫乙酰殼多糖所證明的那樣，用凝膠過濾將具有較高分子量的樣品分離。通常，使用含有Sepharose CL-4B和Sepharose CL-6B的凝膠過濾柱通過將MW＝270.00的常規(guī)多分散性樣品分離，獲得MW/Mn值為1.2-1.5的級(jí)分。
在另一方法中，可通過能選擇性獲得最短的鏈的透析或膜技術(shù)分離多分散性脫乙酰殼多糖，此時(shí)所得的分布依賴于最初的分布以及膜的性能，如孔度、轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)以及操作條件。
根據(jù)本發(fā)明，令人驚訝的是，單一鏈長或分子量分布窄的脫乙酰殼多糖作為基因送遞的復(fù)合劑與具有相當(dāng)?shù)腗W或Mn但分子量分布較寬的其他樣品相比具有不同的性能。
用于核酸的復(fù)合的許多陽離子(如PEI、聚賴氨酸和脫乙酰殼多糖)的另一缺點(diǎn)是，它們是具有寬的分子量分布的經(jīng)粗加工的大批量化學(xué)物質(zhì)，因而特性相當(dāng)不確定(Godbey等，1999)。已公認(rèn)這些化合物每一批次間是不同的。因此，從制藥學(xué)的角度看，具有窄的分子量分布的確定的多陽離子是優(yōu)選的。
將寬分子量分布的多陽離子用于核酸的復(fù)合以及隨后的轉(zhuǎn)染的另一缺點(diǎn)是不同長度的鏈可能具有不同的復(fù)合和轉(zhuǎn)染效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種組合物，它含有以下組分的復(fù)合物(a)從陽離子多糖脫乙酰殼多糖衍生得到的陽離子脫乙酰殼多糖寡聚物，其中，除了重量分?jǐn)?shù)少于20％的聚合度(DP)＞50的寡聚物外，所述陽離子寡聚物還含有重量分?jǐn)?shù)小于20％的DP＜10的寡聚物；和(b)核酸。
根據(jù)本發(fā)明，令人意想不到的是，含有確定的、具有某個(gè)鏈長分布的陽離子脫乙酰殼多糖寡聚物與核酸的組合物有利于將該核酸送遞到所選擇的組織的細(xì)胞中，并獲得由所述核酸編碼的所需分子的體內(nèi)表達(dá)。
本發(fā)明的另一目的是提供一種制備本發(fā)明組合物的方法，該方法包括(a)將所述陽離子脫乙酰殼多糖寡聚物暴露于水性溶劑中；(b)將步驟(a)所得的水性溶液與水性溶劑中的核酸混合；和(c)減少步驟(b)所得的產(chǎn)品溶液的體積，以達(dá)到所述組合物的所需濃度。
本發(fā)明的又一目的是提供一種給予哺乳動(dòng)物核酸的方法，該方法包括向哺乳動(dòng)物導(dǎo)入本發(fā)明的組合物。
本發(fā)明的又一目的是本發(fā)明組合物在制備哺乳動(dòng)物的預(yù)防用或治療用的藥劑中的用途，或者在制備用于體外或體內(nèi)診斷方法的診斷劑中的用途。
下文所述的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例將提供本發(fā)明的這些和其他目的。
發(fā)明詳述可采用化學(xué)或酶學(xué)方法由陽離子多糖脫乙酰殼多糖得到本發(fā)明的組合物。
本發(fā)明的優(yōu)選組合物之一中，其陽離子寡聚物較佳除重量分?jǐn)?shù)少于20％的DP＞40的寡聚物外還含有重量分?jǐn)?shù)少于20％的DP＜12的寡聚物、最佳除重量分?jǐn)?shù)少于20％的DP＞30的寡聚物外還含有重量分?jǐn)?shù)少于20％的DP＜15的寡聚物。
本發(fā)明描述了含有在低分子量陽離子脫乙酰殼多糖寡聚物與核酸形成復(fù)合物的組合物，其中，所述陽離子脫乙酰殼多糖寡聚物具有確定的鏈長、窄的鏈長分布和確定的化學(xué)組成。通常，陽離子脫乙酰殼多糖寡聚物的分子量為500-10000Da，較佳為1200-5000Da，最佳為3000-4700Da。通常，陽離子脫乙酰殼多糖寡聚物A單元的分?jǐn)?shù)(FA)為0-0.35(65-100％去-N乙?；瘑卧?、較佳為0-0.1(90-100％的去-N-乙?；瘑卧?，最佳為0-0.1(99-100％的去-N-乙酰化單元)。合適的，所述核酸含有編碼序列，在所述核酸被導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)該編碼序列將表達(dá)其功能。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述寡聚物衍生自多糖脫乙酰殼多糖，接著將多分散性寡聚物化合物分離成具有很好定義的鏈長、窄的鏈長分布和A單元的分?jǐn)?shù)(FA)為0-0.35(65-100％去-N乙酰化單元)、較佳為0-0.1(90-100％的去-N-乙?；瘑卧?、最佳為0-0.01(99-100％的去-N-乙?；瘑卧?的寡聚物。通常，所述寡聚物由6-50個(gè)單體單元組成，較佳為10-30個(gè)單體單元，最佳為15-25個(gè)單體單元，分子量為3000-4700Da，F(xiàn)A少于0.01(大于99％的去-N-乙?；瘑卧?。
根據(jù)本發(fā)明組合物的另一實(shí)施例，所述核酸選自RNA和DNA分子。這些RNA和DNA分子可由環(huán)形分子、線性分子或它們的混合物組成。較佳的是，所述核酸分子由質(zhì)粒DNA組成。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所述核酸含有一編碼序列，當(dāng)該核酸被導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，所述編碼序列將表達(dá)其功能。例如，它可編碼生物學(xué)活性產(chǎn)品，如具有治療、診斷、免疫或抗原活性的蛋白質(zhì)、多肽或肽。
本發(fā)明還涉及上述組合物，其中所述核酸含有編碼蛋白質(zhì)、酶、多肽抗原或多肽激素的編碼序列，或所述核酸含有起到反義分子作用的核苷酸序列，如RNA。
較佳的是，本發(fā)明的組合物的pH范圍為3.5-8。
本發(fā)明的組合物還適宜用靶向配體和/或穩(wěn)定劑進(jìn)行衍生。
本發(fā)明的又一方面涉及霧化后得到的液滴大小的所述組合物。較佳的是，霧化后本發(fā)明組合物的液滴大小基本上等于裸pDNA的液滴大小。
本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明組合物的方法，其中該方法包括以下步驟提供上述陽離子脫乙酰殼多糖，(a)將所述陽離子脫乙酰殼多糖暴露于pH為3.5-8.0的水性溶劑中，(b)將步驟(a)所得的水性溶液與水性溶劑中的所述核酸混合，和(c)將步驟(b)中獲得的產(chǎn)品溶液脫水，得到體內(nèi)給藥前的高濃度的該組合物?？刹捎靡韵路绞綄?shí)現(xiàn)步驟(c)(1)將步驟(b)的產(chǎn)品溶液中的液體蒸發(fā)，獲得所需的濃度，或者(2)將步驟(b)的產(chǎn)品溶液凍干，接著重新配制以獲得所需的濃度。通常，步驟(b)中所述核酸的濃度為1ng/ml-300μg/ml，較佳是1μg/ml-100μg/ml，更佳是10-50μg/ml；使用蒸發(fā)方法(1)的步驟(c)中所述核酸的濃度為10ng/ml-3000μg/ml，較佳為10μg/ml-1000μg/ml，更佳是100-500μg/ml。
應(yīng)理解，本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員能配制不同胺/磷酸鹽電荷比的本發(fā)明組合物，以包括各種負(fù)電荷比、中性電荷比或正電荷比。但是，優(yōu)選的實(shí)施例是本發(fā)明組合物為凈正電荷的組合物。
本發(fā)明還涉及一種將本發(fā)明的組合物導(dǎo)入哺乳動(dòng)物從而向哺乳動(dòng)物給予核酸的方法。較佳的是，通過肺部、鼻、口腔、頰、舌下、直腸或陰道途徑經(jīng)粘膜組織給予所述組合物。根據(jù)另一優(yōu)選實(shí)施例，通過腸胃外如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下或心臟內(nèi)給藥給予哺乳動(dòng)物所述組合物。
本發(fā)明還涉及上述組合物在制備用于哺乳動(dòng)物的預(yù)防用或治療用的藥劑中的用途，或者在制備用于體內(nèi)或體外診斷方法的診斷劑的用途。本發(fā)明還特別涉及所述組合物在制備用于基因治療、反義治療或遺傳接種以預(yù)防或治療惡性腫瘤、自身免疫疾病、遺傳病、病原性感染以及其他病理性疾病的藥劑中的用途。
在下文詳細(xì)描述的基礎(chǔ)上將能更容易理解本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)。但是，應(yīng)當(dāng)主要的是，這些詳細(xì)的描述和具體實(shí)施例雖然表明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但它們僅僅是闡述性的，因?yàn)樵谶@些詳細(xì)描述的基礎(chǔ)上，在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的各種改變和變動(dòng)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。
附圖描述圖1顯示脫乙酰殼多糖的化學(xué)組成，其中脫乙酰殼多糖鏈的一個(gè)片段含有一個(gè)N-乙酰基-β-D-葡糖胺殘基(A單元)和3個(gè)β-D-葡糖胺殘基(D單元)。D單元的氨基可以是質(zhì)子化的，也可以是非質(zhì)子化的，這取決于pH。
圖2a顯示采用酸或脫乙酰殼多糖酶對(duì)脫乙酰殼多糖解聚后得到的化學(xué)結(jié)構(gòu)。酸優(yōu)先解離A單元后的糖苷鍵(A單元在新形成的還原端)。酶可水解上述兩種殘基，特異性據(jù)此各不相同。
圖2B顯示使用硝酸對(duì)脫乙酰殼多糖解聚，硝酸僅僅攻擊D殘基，它重排形成2，5-脫水-D-甘露糖。
圖3顯示使用折射率檢測(cè)器和多角度激光光散射檢測(cè)器對(duì)重均分子量(MW)為180.000的市售脫乙酰殼多糖進(jìn)行尺寸排阻色譜法分析得到的結(jié)果。柱TSKG6000PWXL、5000PWXL和4000PWXL(串聯(lián))。洗脫液0.2M乙酸銨，pH4.5。RI檢測(cè)器Optomed DSP(Wyatt)。光散射檢測(cè)器DAWN DSP(Wyatt)。處理參數(shù)(Astra軟件第4.70.07版)dn/dc＝0.142ml/g(離線測(cè)定脫乙酰殼多糖乙酸鹽，發(fā)現(xiàn)該值與FA無關(guān))。A25.0×10-3mol.ml.g-2。
3A洗脫圖，即折射率檢測(cè)器信號(hào)，它與脫乙酰殼多糖的濃度成正比，圖中還結(jié)合有作為洗脫體積的函數(shù)的計(jì)算分子量(表示為成乙酸鹽形式的脫乙酰殼多糖)的圖。
3B由3A提供的數(shù)據(jù)計(jì)算得到的累積分子量分布。
圖4顯示已被亞硝酸解聚而獲得范圍在41.500-13.400內(nèi)的重均分子量的脫乙酰殼多糖的SEC-MALLS色譜圖(4A)、微分分子量分布(4B)和累積分子量分布(4C)。實(shí)驗(yàn)條件與圖3的相同。
圖5對(duì)應(yīng)于解聚成100、50、20和10個(gè)殘基(DPn)的脫乙酰殼多糖的Kuhn分布的計(jì)算的累積分子量分布(A)和微分分子量分布(B)。
圖6已a(bǔ))被亞硝酸解聚和被NaBH4(N1-N4)還原或b)被脫乙酰殼多糖酶(E1-E4)解聚的全長去-N-乙?；撘阴ざ嗵?FA＜0.01)的尺寸排阻色譜圖(Superdex 30；兩根串聯(lián)的2.5×100厘米柱，洗脫液0.15M乙酸銨，pH4.5，流速0.8毫升/分鐘)。DP＝6表明全長去-N-乙?；撘阴ざ嗵橇垠w的洗脫圖。
圖7經(jīng)亞硝酸解聚并經(jīng)NaBH4還原(未分離的樣品)的全長去-N-乙酰基脫乙酰殼多糖(FA＜0.01)和從圖6所述獲得的級(jí)分N1-N4的SEC-MALLS色譜圖(7A)。實(shí)驗(yàn)條件與圖3所述的相同，但使用單柱(TSK G3000 PWXL)。圖7B顯示由圖7A數(shù)據(jù)算得的累積分子量分布。
圖8已經(jīng)脫乙酰殼多糖酶解聚的脫乙酰殼多糖(未分離樣品)和從圖6所述獲得的級(jí)分E1-E4的SEC-MALLS色譜圖(8A)。實(shí)驗(yàn)條件和圖3的相同，但使用單個(gè)柱(TSK G3000 PWXL)。圖8B顯示由圖7A給出的數(shù)據(jù)計(jì)算得到的累積分子量分布。
圖9顯示氣管內(nèi)給予小鼠25微克pLuc三天后體內(nèi)肺熒光素酶表達(dá)(皮克/毫克)(每組4只動(dòng)物)。以60∶1(+/-)的胺/磷酸鹽電荷比制備脫乙酰殼多糖寡聚物與pLuc的復(fù)合物。使用pLuc與數(shù)均聚合度為18(如13C NMR光譜所測(cè)定的)的脫乙酰殼多糖寡聚物N0的復(fù)合物產(chǎn)生了顯著地最高的熒光素酶表達(dá)。用ANOVA研究平均值之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。組平均值差異P＜0.05認(rèn)為是顯著的。
圖10顯示氣管內(nèi)給予小鼠25微克pLuc三天后體內(nèi)肺熒光素酶表達(dá)(皮克/毫克)(每組4只動(dòng)物)。數(shù)均聚合度為18的該脫乙酰殼多糖寡聚物N0被分離成4份不同的樣品，每份樣品具有確定的窄聚合度分布。以60∶1(+/-)的胺/磷酸鹽電荷比制備脫乙酰殼多糖寡聚物與pLuc的復(fù)合物。與基于數(shù)均聚合度為18的未分離的樣品N0的復(fù)合物相比，基于含有鏈長15-21個(gè)單體單元的寡聚物的級(jí)分(N3)的復(fù)合物顯示了明顯高的(P＜0.05)基因表達(dá)。用ANOVA研究平均值之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。組平均值差異P＜0.05認(rèn)為是顯著的。
圖11顯示瓊脂糖凝膠滯留實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。以60∶1(+/-)的胺/磷酸鹽電荷比制備脫乙酰殼多糖寡聚物與pLuc的復(fù)合物。隨著脫乙酰殼多糖寡聚物的分子量(聚合度)的增加，觀察復(fù)合物的穩(wěn)定性升高。因而，與15-21個(gè)單體單元的級(jí)分(N3)形成的復(fù)合物相比，用36-50個(gè)單體單元的級(jí)分(N1)形成的復(fù)合物檢測(cè)到完全的pLuc滯留。
圖12顯示分別用兩批次(隔開9個(gè)月制備)的分離的低分子量陽離子脫乙酰殼多糖寡聚物(N1和E1)和兩次購入(時(shí)隔3年)的脫乙酰殼多糖(Protasan UPG210)(隔開3年訂購)培育293細(xì)胞后體外的熒光素酶基因表達(dá)。在2批ProtasanUPG210與pLuc以2.4∶1(+/-)的胺/磷酸鹽電荷比復(fù)合的情況下，基因表達(dá)相差了10倍，但兩批分離的低分子量陽離子脫乙酰殼多糖寡聚物(N1和E1)與pLuc以10∶1(+/-)的胺/磷酸鹽電荷比復(fù)合的情況下沒有顯著的差別。用ANOVA研究平均值之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。組平均值差異P＜0.05認(rèn)為是顯著的。
圖13顯示將含有與pLuc復(fù)合的陽離子的組合物氣溶膠化后的液滴大小(集群中值直徑，mass median diameter，MMD)。含有12-21單體單元(N3)和36-50單體單元(N1)的脫乙酰殼多糖寡聚物的級(jí)分和超純脫乙酰殼多糖Protasan PUG210(UPC)與pLuc分別按60∶1(+/-)和3∶1(+/-)的胺/磷酸鹽電荷比復(fù)合。MMD明顯取決于組成。裸pLuc和含有與pLuc復(fù)合的15-21個(gè)單體單元(N3)的組合物形成了最小的液滴大小。用ANOVA研究平均值之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。組平均值差異P＜0.05認(rèn)為是顯著的。
使用報(bào)道蛋白熒光素酶的表達(dá)作為體內(nèi)肺模型中治療性蛋白的模型，發(fā)現(xiàn)含有質(zhì)粒DNA和具有確定的鏈長、鏈長分布以及化學(xué)組成的脫乙酰殼多糖寡聚物組合物的制劑有利于將核酸送遞到選定的組織的細(xì)胞，并獲得由所述核酸編碼的所需分子的體內(nèi)表達(dá)。
發(fā)現(xiàn)由脫乙酰殼多糖制得的、數(shù)均聚合度為18(DPn＝18，由13C-NMR光譜測(cè)定)、與Kuhn分布相比顯示出相對(duì)窄的大小分布且具有超過99％的D單元(FA＜0.01)的脫乙酰殼多糖寡聚物級(jí)分與pLuc以60∶1(+/-)的胺/磷酸鹽電荷比形成了穩(wěn)定的復(fù)合物(如瓊脂糖凝膠電泳所揭示的)。與具有6、10和12個(gè)單體單元的單分散性脫乙酰殼多糖寡聚物相比，多分散性DPn＝18樣品獲得了明顯較高的體內(nèi)肺熒光素酶基因表達(dá)，前者與pLuc在60∶1(+/-)的胺/磷酸鹽電荷比時(shí)形成了不穩(wěn)定的復(fù)合物。穩(wěn)定的復(fù)合物比不穩(wěn)定的復(fù)合物產(chǎn)生較高的基因表達(dá)的事實(shí)與現(xiàn)有技術(shù)相符(Fisher等，1999；Gebhart和Kabanov，2001；Koping-Hoggard等，2001)。但是，用平均分子大小高于DPn18樣品的脫乙酰殼多糖寡聚物形成的穩(wěn)定復(fù)合物的熒光素酶表達(dá)下降。進(jìn)一步將級(jí)分DPn18分級(jí)分離，獲得更窄分布的級(jí)分，即10-14個(gè)單體單元(N4)、15-21個(gè)單體單元(N3)、22-35個(gè)單體單元(N2)和36-50個(gè)單體單元(N1)。具有15-21個(gè)單體單體的級(jí)分與pLuc形成的復(fù)合物產(chǎn)生意想不到的最高的體內(nèi)肺基因表達(dá)，雖然在胺/磷酸鹽電荷比為60∶1(+/-)時(shí)形成了不穩(wěn)定的復(fù)合物。10-14個(gè)單體單元的級(jí)分也與pLuc形成了不穩(wěn)定的復(fù)合物，結(jié)果僅僅產(chǎn)生中等的熒光素酶表達(dá)。
此外，具有15-21個(gè)單體單元的級(jí)分與pLuc形成的復(fù)合物的氣溶膠化所得的液滴大小與裸pLuc氣溶膠化溶液的液滴大小相當(dāng)。相反，具有36-50個(gè)單體單元級(jí)分與pLuc形成的復(fù)合物以及UPC(大約1000單體)與pLuc形成的復(fù)合物的氣溶膠化分別形成了大2倍和3倍的液滴大小。液滴大小的這一制劑依賴性影響可解釋為，隨著陽離子分子量的增加，溶液的粘度增加，從而產(chǎn)生較大的液滴。
實(shí)施例實(shí)施例1低分子量脫乙酰殼多糖的制備從Pronova Biomedical AS(奧斯陸，挪威)獲得脫乙酰殼多糖Protasan UP G210(FA＝0.17，重均分子量為162000)。如Tommeraas等(2001)所述，使用NaNO2對(duì)脫乙酰殼多糖進(jìn)行化學(xué)解聚，然后使用NaBH4進(jìn)行還原，從而獲得N-葡糖胺的低分子量寡聚物，其中，通過NaNO2相對(duì)脫乙酰殼多糖的相當(dāng)量控制分子量。如先前所述(Varum等，1991)，通過非均一去乙?；刂埔阴；瘑卧姆?jǐn)?shù)，獲得少于0.001的FA(如采用質(zhì)子NMR光譜所測(cè)定的)。通常，將1.0克脫乙酰殼多糖溶解在100毫升2.5％的乙酸水溶液中，將氮?dú)鉀_入該溶液5分子，除去溶解氧，加入5毫升以蒸餾水配制的新鮮的NaNO2溶液(10毫克/毫升)。使反應(yīng)在黑暗中進(jìn)行4小時(shí)，之后加入3克NaBH4對(duì)解聚的脫乙酰殼多糖進(jìn)行常規(guī)的還原，放置在黑暗中過夜。使用乙酸將pH調(diào)到4.5。用0.2M的NaCl透析所得溶液3次(Medicell透析管，MWCO 12000-14000)，用蒸餾水透析六次，凍干，獲得成鹽酸鹽形式的低分子量寡聚物。或者，使用從灰色鏈霉菌(Streptomyceus griseus)獲得的脫乙酰殼多糖酶(Sigma C 9830或Sigma C0794)通過酶解聚獲得低分子量寡聚物，其中，分子量由酶相對(duì)于脫乙酰殼多糖的量和培育時(shí)間控制。將0.5克的脫乙酰殼多糖以20毫克/毫升的濃度溶解在0.1M乙酸鈉/乙酸緩沖液(pH5.5)中，加入0.65單位的脫乙酰殼多糖酶(SigmaC 0794)，在37℃培育18小時(shí)。將pH降到2以終止酶反應(yīng)，然后沸騰5分鐘。如上述透析解聚的脫乙酰殼多糖，并凍干，獲得成鹽酸鹽形式的低分子量酶降解脫乙酰殼多糖。
實(shí)施例2分離樣品的制備和表征如先前公開的內(nèi)容所述(Tommeraas等，2001)，在兩根串聯(lián)的2.5×100厘米的柱上進(jìn)行尺寸排阻色譜，對(duì)實(shí)施例獲得的低分子量脫乙酰殼多糖進(jìn)行分級(jí)分離。根據(jù)圖6的色譜圖(a和b)，收集級(jí)分，每份4毫升，分別合并，獲得4種具有指定的不同分子量的級(jí)分N1(亞硝酸降解)或E1(脫乙酰殼多糖酶降解)N2(亞硝酸降解)或E2(脫乙酰殼多糖酶降解)N3(亞硝酸降解)或E3(脫乙酰殼多糖酶降解)N4(亞硝酸降解)或E4(脫乙酰殼多糖酶降解)。
表1采用SEC-MALLS分析各樣品，得到下述鏈長分布(3次的平均值)

其中，DPW＝重均DP，DPn＝數(shù)均DP。
實(shí)施例3制劑和體內(nèi)肺基因表達(dá)根據(jù)實(shí)施例1和2所述的方法由脫乙酰殼多糖制備具有聚合度(DP)為6-50(對(duì)非還原端進(jìn)行的13C-NMR光譜所測(cè)得的數(shù)均DP為18，N0)的多分散性陽離子脫乙酰殼多糖寡聚物級(jí)分和DP為6、10、12、10-14(N4)、15-21(N3)、22-35(N2)、36-50(N1)的各種特定的陽離子寡聚物。從Aldevron(Fargo，ND，美國)購得螢火蟲熒光素酶質(zhì)粒DNA(pLuc)。以無菌去離子水中配制陽離子脫乙酰殼多糖寡聚物的原液(2毫克/毫升)，pH6.2±0.1，接著無菌過濾。在渦流攪拌器(Heidolph REAX 2000，KEBO實(shí)驗(yàn)室，Spanga，瑞典)劇烈攪拌的同時(shí)，將陽離子寡聚物加入無菌水中，然后加入pLuc，以60∶1(+/-)的電荷比配制陽離子脫乙酰殼多糖寡聚物與pLuc的復(fù)合物。15分鐘后，在SpeedVac Plus離心機(jī)(Savant Instruments，Holbrook，NY)中在真空下進(jìn)行溫和蒸發(fā)約90分鐘，獲得約250微克/毫升左右的pLuc濃度(Koping-Hoggard等，2001)。此外，在之前所述的優(yōu)化條件下，將pLuc與25 kDa的PEI(Aldrich Sweden，Srockholm，瑞典)和超純的脫乙酰殼多糖Protasan UPG 210(Pronova Biopolymer，奧斯陸，挪威)分別以5∶1(+/-)和3∶1(+/-)的電荷比配制復(fù)合物(Bragonzi等，2000；Koping-Hoggard等，2001)。
用氯胺酮/賽拉嗪(5/20體積％，0.1毫升/10克體重)麻醉小鼠(雄性Balb/c，6-8周齡，每組4只，Charles River，Uppsala，瑞典)，切開頸部0.5厘米長的皮膚，將氣管暴露出來。將100微升上述復(fù)合物緩慢滴加到氣管中，然后將傷口縫合。給藥72小時(shí)后，用一氧化碳?xì)⑺绖?dòng)物，取出肺，在PBS中洗滌，加入0.3毫升冰凍的熒光素酶裂解緩沖液(Promega，Madison，WI)和蛋白酶抑制劑混合物(Complete，Boehringer Mannheim Scandinavia AB，Bromma，瑞典)。在液氮中將該組織樣品迅速冷凍，在-80℃保存至分析。
在冷的房間里，在珠攪拌器(Biospec Products，Inc.，OK)中將組織樣品勻漿，接著在4℃以15000rpm離心10分鐘(5403型離心機(jī)，Eppendorf-Nethelar-Hinze GmbH，Hamburg，德國)。將從各測(cè)試管得到的50微升澄清的上清液與50微升的熒光素酶試劑(Promega)混合，用照明計(jì)(Mediators PhL，Vienna，澳大利亞)分析，積分時(shí)間為8秒。為了定量熒光素酶表達(dá)，將規(guī)定量的熒光素酶標(biāo)準(zhǔn)品加到從未處理的對(duì)照動(dòng)物獲得的勻漿組織的上清液中，從而獲得熒光素酶(Sigma，St.Louis，MO)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用BCA實(shí)驗(yàn)(Pierce，Rockford，IL)分析各樣品中的總蛋白含量，并采用BSA(牛血清清蛋白)作為參比蛋白進(jìn)行定量。在微平板讀數(shù)器(Multiscan MCC/340，Labsystems Oy，Helsinki，F(xiàn)inland)上讀取540納米的吸光度。
圖9顯示了給予pLuc與不同聚合度(分子量)的陽離子脫乙酰殼多糖寡聚物形成的復(fù)合物72小時(shí)后小鼠肺中的基因轉(zhuǎn)染效率。令人驚訝的是，pLuc與數(shù)均聚合度為18為脫乙酰殼多糖寡聚物N0形成的復(fù)合物產(chǎn)生了明顯最高的熒光素酶表達(dá)。
圖10顯示了給予pLuc與不同聚合度(分子量)的陽離子脫乙酰殼多糖寡聚物形成的復(fù)合物72小時(shí)后小鼠肺中的基因轉(zhuǎn)染效率。數(shù)均聚合度為18的脫乙酰殼多糖寡聚物N0被分離(如實(shí)施例2所述)成4份具有確定的窄的聚合度分布的樣品。令人驚訝的是，含有鏈長為15-21個(gè)單體單元的脫乙酰殼多糖寡聚物的級(jí)分(N3)的基因表達(dá)高于PEI，且顯著高于數(shù)均聚合度為18的非分離樣品N0。
圖11顯示了瓊脂糖凝膠滯留試驗(yàn)的結(jié)果。隨著脫乙酰殼多糖寡聚物的分子量(聚合度)的增加，所形成的復(fù)合物的穩(wěn)定性升高。因此，與10-14(N4)個(gè)和15-21(N3)個(gè)單體單元形成的復(fù)合物相比，22-35個(gè)(N2)和36-50個(gè)(N1)單體單元的級(jí)分形成的復(fù)合物中檢測(cè)到pLuc近乎全滯留。數(shù)均聚合度為18的未分離樣品N0也與pDNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物。與DPn18(N0)形成的穩(wěn)定復(fù)合物相比，較不穩(wěn)定的15-21(N3)復(fù)合物令人驚訝地產(chǎn)生更高的體內(nèi)基因表達(dá)(圖10)。
實(shí)施例4體外基因表達(dá)分別以60∶1(+/-)和2.4∶1(+/-)的電荷比，將兩批如實(shí)施例2所述時(shí)隔9個(gè)月制得的分離的低分子量陽離子脫乙酰殼多糖寡聚物N1和E1和時(shí)隔3年訂購的市售脫乙酰殼多糖(Protasan UPG 210，批次1表觀粘度為70mPas，批次2表觀粘度為146mPas)與pLuc復(fù)合，如實(shí)施例2所述。使用穩(wěn)定的pDNA復(fù)合物。
轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，以70％的鋪滿度將人胚胎腎上皮細(xì)胞系293(ATCC，Rockville，MD，美國)接種到96孔組織培育平板(Costar，Cambridge，UK)上。在轉(zhuǎn)染前，洗滌孔，然后將50微升(相對(duì)于0.33微克pLuc)的polyplex制劑加到各孔中。培育5小時(shí)后，除去該制劑，加入0.2毫升新鮮培養(yǎng)基。如果試驗(yàn)時(shí)間超過2天，每2天更換一次培養(yǎng)基。在第96小時(shí)和第144小時(shí)，用PBS(pH7.4)洗滌細(xì)胞，裂解(Promega)，用照明計(jì)(Mediators PhL)測(cè)量熒光素酶基因表達(dá)。根據(jù)用螢火蟲熒光素酶(Sigma)制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定表達(dá)的熒光素酶的量，使用bichinchoninic acid測(cè)試(Pierce)測(cè)定總蛋白質(zhì)。
圖12顯示分別使用兩批分離的低分子量陽離子脫乙酰殼多糖寡聚物N1和E1以及兩批市售脫乙酰殼多糖Protasan UPG 210培育293細(xì)胞后熒光素酶基因體外表達(dá)的結(jié)果。對(duì)于Protasan UPG 210，兩批的基因表達(dá)相差10倍以上，但分離的低分子量陽離子脫乙酰殼多糖寡聚物N1和E1之間并沒有明顯的不同。
實(shí)施例5氣溶膠化后的液滴大小如實(shí)施例3所述制備陽離子脫乙酰殼多糖寡聚物與pLuc的復(fù)合物，獲得500微克/毫升的pLuc濃度。作為對(duì)照，使用超純的脫乙酰殼多糖(UPC聚合度在1000左右)與pLuc以最優(yōu)的條件和3∶1(+/-)的電荷比制備的復(fù)合物(Koping-Hoggard等，2001)。使用包括液體通道和氣體(空氣)通道的霧化導(dǎo)管(Trudell Medical International，London Ontario，加拿大)制備含有陽離子脫乙酰殼多糖寡聚物與pLuc形成的復(fù)合物的氣溶膠。首先，將100微升的復(fù)合物溶液加到與霧化導(dǎo)管相連的液體容器(液體入口)中。然后，為了獲得氣溶膠，短時(shí)間內(nèi)將加壓空氣(3.5巴)脈沖施加給該液體容器(20毫秒)和該霧化導(dǎo)管的氣體通道(50毫秒)。使用Mastersizer X(Malvem instruments Ltd.，Malvern，UK)測(cè)量所產(chǎn)生的氣溶膠的液滴大小。
圖13顯示了含有陽離子與pLuc所成復(fù)合物的組合物氣溶膠化后的液體液滴大小(集群中值直徑)。很明顯，MMD取決于組成。裸pLuc和含有15-21個(gè)單體單元(N3)與pLuc形成的復(fù)合物的組合物產(chǎn)生的液滴最小。
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權(quán)利要求
1.一種組合物，含有以下組分的復(fù)合物(a)從陽離子多糖脫乙酰殼多糖衍生得到的陽離子脫乙酰殼多糖寡聚物，其中，除了重量分?jǐn)?shù)少于20％的聚合度(DP)＞50的寡聚物外，所述陽離子寡聚物還含有重量分?jǐn)?shù)小于20％的DP＜10的寡聚物；和(b)核酸。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述陽離子殼多糖寡聚物是采用化學(xué)或酶學(xué)方法從脫乙酰殼多糖獲得的。
3.如權(quán)利要求1和2所述的方法，其特征在于，所述陽離子寡聚物較佳除重量分?jǐn)?shù)少于20％的DP＞40的寡聚物外還含有重量分?jǐn)?shù)少于20％的DP＜12的寡聚物、最佳除重量分?jǐn)?shù)少于20％的DP＞30的寡聚物外還含有重量分?jǐn)?shù)少于20％的DP＜15的寡聚物。
4.如權(quán)利要求1-3所述的組合物，其特征在于，所述脫乙酰殼多糖寡聚物的N-乙?；瘑卧?jǐn)?shù)(FA)少于0.60、較佳少于0.35、更佳少于0.1，最佳少于0.01。
5.如權(quán)利要求1-4所述的組合物，其特征在于，所述組合物基本上呈凈正電荷比。
6.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述脫乙酰殼多糖寡聚物以靶向配體和穩(wěn)定劑衍生化。
7.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述復(fù)合物含有編碼序列，當(dāng)所述核酸被導(dǎo)入宿主細(xì)胞中時(shí)，所述編碼序列表達(dá)其功能。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，所述核酸選自DNA和RNA分子。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于，所述組合物的pH為3.5-8。
10.如權(quán)利要求9所述的組合物，其特征在于，所述組合物氣溶膠化后的液滴大小基本上與僅由相同濃度的核酸組成的組合物的液滴大小相當(dāng)。
11.一種制備權(quán)利要求1-10所述的組合物的方法，其特征在于，所述方法包括(a)將所述陽離子脫乙酰殼多糖寡聚物暴露于水性溶劑中；(b)將步驟(a)所得的水性溶液與水性溶劑中的核酸混合；和(c)減少步驟(b)所得的產(chǎn)品溶液的體積，獲得所述組合物的所需濃度。
12.一種給予哺乳動(dòng)物核酸的方法，包括使用權(quán)利要求1-10所述的組合物，并將該組合物導(dǎo)入哺乳動(dòng)物。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，通過肺部、鼻、口腔、頰、舌下、直腸和陰道途徑向粘膜組織給藥從而向哺乳動(dòng)物導(dǎo)入所述組合物。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，通過腸胃外途徑，即靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下或心臟內(nèi)給藥向粘膜下組織，或者通過內(nèi)部器官、血管或手術(shù)中暴露的其他機(jī)體表面或腔室給予哺乳動(dòng)物所述組合物。
15.如權(quán)利要求12所述的方法，權(quán)利要求1-10所述的組合物使得所述核酸能在所述哺乳動(dòng)物中發(fā)揮其功能。
16.權(quán)利要求1-10所述的組合物在制備哺乳動(dòng)物的預(yù)防用或治療用藥劑或者在制備用于體內(nèi)或體外診斷方法的診斷劑中的用途。
17.權(quán)利要求16所述的組合物在制備藥劑中的用途，其特征在于，所述藥劑是惡性腫瘤、自身免疫疾病、遺傳病、致病性感染以及其他病理性疾病的基因治療、反義治療或遺傳接種的預(yù)防用或治療用的藥劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有陽離子脫乙酰殼多糖寡聚物和核酸的組合物，其中，該陽離子脫乙酰殼多糖寡聚物從陽離子多糖脫乙酰殼多糖衍生得到，除了重量分?jǐn)?shù)少于20％的聚合度(DP)＞50的寡聚物外，它還含有重量分?jǐn)?shù)小于20％的DP＜10的寡聚物。這些含有特定鏈長分布的陽離子脫乙酰殼多糖寡聚物和核酸的組合物有利于向選定組織的細(xì)胞送遞核酸，并實(shí)現(xiàn)由所述核酸編碼的所需分子的體內(nèi)表達(dá)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1655825SQ03812345
公開日2005年8月17日 申請(qǐng)日期2003年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月3日
發(fā)明者P·阿爾圖松, B·E·克里斯頓森, M·科平-霍格德, K·M·瓦姆 申請(qǐng)人:Fmc生物聚合物聯(lián)合股份有限公司