專利名稱：一種血管緊張素Ⅱ相關(guān)基因及其編碼蛋白與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域中血管緊張素II的相關(guān)基因及其編碼蛋白與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血管緊張素II(Angiotensin II，AngII)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system，RAS)的主要效應(yīng)因子，可以影響腎小管的水、鈉重吸收，刺激腎上腺釋放醛固酮，同時也是引起心肌肥厚、血管壁增厚、動脈粥樣硬化和人類腎小球硬化的生物活性物質(zhì)。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(Angiotensin-converting enzyme inhibitor，ACEI)和AngII1型受體(AngiotensinII type I receptor，AT1R)拮抗劑能夠阻斷AngII的作用，減輕腎臟組織病理學(xué)改變，延緩腎小球疾病的進(jìn)展，提示AngII與慢性腎小球疾病的進(jìn)行性發(fā)展密切相關(guān)。腎小球系膜細(xì)胞(Mesangial cell，MsC)是重要的腎小球固有細(xì)胞，在腎小球炎癥與硬化過程中起關(guān)鍵作用。AngII可刺激培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞肥大，上調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)成分及TGF-β、PAI-I等基因的mRNA和蛋白表達(dá)，提示AngII在腎小球增生和硬化過程中的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種血管緊張素II相關(guān)基因及其編碼的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明所提供的血管緊張素II相關(guān)基因名稱為AngRem104，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中的序列1由1690個核苷酸組成，SEQ ID №1的編碼框?yàn)樽?’端第90位堿基到第1130位堿基，編碼序列表中序列2的蛋白質(zhì)，序列1來源于人腎小球系膜細(xì)胞。
AngRem104基因編碼的蛋白質(zhì)，是序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
序列2的蛋白質(zhì)由347個氨基酸殘基組成。蛋白的分子量為37.2kDa，為核蛋白，蛋白N端無信號肽，無跨膜區(qū)，C-端無核定位信號。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種擴(kuò)增血管緊張素II相關(guān)基因AngRem104的引物。
一種擴(kuò)增血管緊張素II相關(guān)基因AngRem104的引物上游引物5’-ATG TCA GAT TAT AAT CCT GAT G-3’下游引物5’-ACT GTA GAG GAG TCC TAG G-3’。
含有AngRem104基因的表達(dá)載體及細(xì)胞系均屬本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。
本發(fā)明提供了血管緊張素II相關(guān)基因AngRem104(angiotensin II related genesin mesangial cells)。AngRem104基因是血管緊張素II(AngII)刺激系膜細(xì)胞后上調(diào)表達(dá)的基因。AngRem104蛋白質(zhì)是在正常人組織內(nèi)廣泛表達(dá)的核蛋白，可調(diào)控AngII誘導(dǎo)的纖粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)的上調(diào)表達(dá)，而纖粘連蛋白是系膜細(xì)胞分泌的早期主要細(xì)胞外基質(zhì)成分之一。提示本發(fā)明的血管緊張素II相關(guān)基因AngRem104在腎小球疾病的治療及患病機(jī)理研究中將會起到重要作用。
本發(fā)明為研究腎小球增生硬化可能的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為揭示AngII參與腎小球疾病進(jìn)展的可能分子機(jī)制提供了新的線索。


圖1為顯示AngII上調(diào)人MsC FN mRNA表達(dá)的電泳圖譜。
圖2為顯示AngRem104在正常人不同組織表達(dá)分布的Northern雜交圖譜。
圖3為顯示MC在AngII作用下AngRem104 mRNA表達(dá)的時間關(guān)系及AngII阻斷實(shí)驗(yàn)的Northern雜交圖譜。
圖4為鑒定AngRem104 mRNA表達(dá)的RT-PCR電泳圖譜。
圖5為鑒定AngRem104重組融合蛋白表達(dá)的Western Blot圖譜(轉(zhuǎn)染48h)。
圖6為檢測FN mRNA表達(dá)的RT-PCR圖譜。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明中所用的材料及實(shí)驗(yàn)方法1、主要材料和試劑人AngII購自Sigma公司；EcoR I、T4DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、pGEM-TeasyVector、PolyATtractmRNA Isolation system、各種限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒購自Promega公司；d(A，T，C，G)TP、RPMI 1640和胎牛血清、Trizol Reagent、SuperScript II逆轉(zhuǎn)錄酶、脂質(zhì)體(LipofectAMINETM)購自GibcoBRL公司；PCR-Select cDNA Subtraction Kit、SMART RACE cDNAAmplification Kit、Advantage Polymerase Mix、Multiple Tissue Northern Blot尼龍膜、CHROMA SPIN-100 DNA純化柱、Advantage2 PCR試劑盒、CHROMA SPIN-100柱和正常人多組織mRNA尼龍膜購自Clontech公司。DNA純化試劑盒購自QIAGEN公司。質(zhì)粒pcDNA3.1/V5-His-TOPO和小鼠抗人V5單克隆抗體購自美國Invitrogen公司。大腸桿菌DH5α由本室保存。引物的合成及DNA序列測定均由上海博雅公司完成。
2、實(shí)驗(yàn)方法2.1細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞總RNA、mRNA的提取人腎小球系膜細(xì)胞按常規(guī)傳代培養(yǎng)至亞融合狀態(tài)。無血清培養(yǎng)24小時后，實(shí)驗(yàn)組給予AngII(10-6mol/L)刺激，對照組除不給予AngII外，其余條件同實(shí)驗(yàn)組。采用Gibco BRL公司的Trizol試劑，按說明書操作方法進(jìn)行總RNA提?。徊捎肞romega公司的小規(guī)模磁珠法提取mRNA。
2.2抑制性消減雜交(Suppression subtractive hybridization，SSH)采用CLONTECH公司的PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit提供的試劑和酶，分別以對照組(Driver)和AngII刺激組(Tester)人MsC mRNA為模板進(jìn)行SSH。按照說明進(jìn)行SSH得到差異表達(dá)的cDNA片段。回收片段克隆到pGEM-Teasy Vector中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α菌，挑選白色克隆進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增、提取、純化和酶切鑒定。
2.3測序、序列拼接和同源性比較SSH片段和RACE產(chǎn)物由上海博雅生物工程公司應(yīng)用ABI Prism377型自動測序儀完成測序。測序結(jié)果以GENETYX for Windows V4.0軟件包進(jìn)行拼接，所得到的序列通過http//www.ncbi.nlm.nih.gov進(jìn)行序列同源性比較。
2.4差異表達(dá)產(chǎn)物的篩選采用反向Northern雜交法。取上述質(zhì)粒酶切產(chǎn)物1μg，1％瓊脂糖凝膠電泳、變性、轉(zhuǎn)膜。分別取tester和driver cDNA 50ng采用隨機(jī)引物試劑盒(購自Promega公司)以[α-32P]dCTP進(jìn)行探針標(biāo)記。并經(jīng)CHROMA SPIN-100柱(購自CLONTECH公司)方法純化，在42℃甲酰胺雜交體系中雜交。
2.5基因的序列分析采用GENETYX for Windows V4.0軟件包進(jìn)行新基因的序列分析，包括尋找開放閱讀框、加尾信號、Kozak序列和所翻譯的氨基酸序列分析。
3、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果經(jīng)灰度掃描后，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件包“SPSS for Windows 8.0”進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析，以P＜0.05認(rèn)為有顯著性。
實(shí)施例1、本發(fā)明AngRem104基因的發(fā)現(xiàn)本發(fā)明AngRem104基因的發(fā)現(xiàn)始于對纖粘連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)和AngII關(guān)系的研究。首先進(jìn)行纖粘連蛋白mRNA和其編碼蛋白的表達(dá)檢測，具體步驟是分別于AngII刺激后6、12、18和24h提取細(xì)胞總RNA，收集培養(yǎng)上清，測FN的蛋白濃度(ELISA法)，并以培養(yǎng)細(xì)胞總蛋白進(jìn)行校正。利用Promega公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。隨后以GAPDH作為內(nèi)參照進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列分別為FN(sense)5′-TGG AAC TTC TAC CAG TGC GAC-3′，(antisense)5′-TGT CTTCCC ATC ATC GTA ACA C-3′，片段大小為451bp；GAPDH(sense)5′-CGT CTT CAC CACCAT GGA GA-3′，(antisense)5′-CGG CCA TCA CGC CAC AGT TT-3′，片段大小為300bp。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性1min，94℃變性30sec，59℃退火30sec，72℃延伸1min，共28個循環(huán)。
結(jié)果表明，人MsC經(jīng)AngII(10-6mol/L)刺激后，F(xiàn)N mRNA和蛋白呈時間依賴性表達(dá)上調(diào)，其RNA在刺激后12h即明顯升高，F(xiàn)N蛋白在刺激后24h達(dá)高峰。結(jié)果如圖1所示，圖中d對照組t實(shí)驗(yàn)組。
取20μg實(shí)驗(yàn)組(T)及對照組(D)的總RNA經(jīng)變性后，在1.2％甲醛變性瓊脂糖凝膠上電泳。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)膜，固定。采用隨機(jī)引物法標(biāo)記經(jīng)反向Northern篩選出的表達(dá)有上調(diào)的cDNA片段，并按上述方法純化探針。在42℃甲酰胺雜交體系中雜交24小時。雜交結(jié)束后嚴(yán)格洗膜后放射自顯影。結(jié)果顯示培養(yǎng)的人MsC經(jīng)AngII刺激24h后，被檢測的18個基因mRNA的表達(dá)分別有1-3倍上調(diào)。
以FN為硬化指標(biāo)參照物，選擇AngII刺激24h后的MsC進(jìn)行抑制性消減雜交(Suppression subtractive hybridization，SSH)。SSH產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)smear狀，但較未雜交標(biāo)本分布趨于集中(大約0.5-1.2Kb)，為實(shí)驗(yàn)組中(Tester)特異表達(dá)或高表達(dá)的cDNA片段。SSH產(chǎn)物經(jīng)分離、純化、克隆后，隨機(jī)挑選120個陽性克隆，經(jīng)反向Northern雜交篩選差異表達(dá)cDNA片段，有55個克隆在AngII刺激后表達(dá)明顯上調(diào)。在上調(diào)表達(dá)的克隆中，挑選20個進(jìn)行序列測定。將測序所得到的序列通過http//www.ncbi.nlm.nih.gov進(jìn)行序列同源性比較(2001/3/10)。結(jié)果顯示20個克隆代表18個獨(dú)立的基因片段序列(有兩個序列為雙拷貝)?？寺?04與已知序列沒有明顯同源性，確認(rèn)為新基因。
實(shí)施例2、新基因的全長cDNA的分離、克隆及鑒定1〕、快速cDNA末端擴(kuò)增(rapid amplication of cDNA ends，RACE)采用CLONTECH公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit提供的試劑和GibcoBRL公司的SuperScript II逆轉(zhuǎn)錄酶，以AngII刺激24h的人MsC細(xì)胞mRNA 2μg為模板，分別反轉(zhuǎn)錄合成5’-和3’-RACE-Ready cDNA。按照試劑盒提供的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物采用NucleoTrap Gel Extraction kit(購自CLONTECH公司)方法純化。純化產(chǎn)物采用Promega公司的pGEM-Teasy Vector System進(jìn)行T/A克隆。然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，IPTG/X-Gal和氨芐青霉素篩選，挑取陽性克隆擴(kuò)增并測序。
2〕、全長cDNA擴(kuò)增根據(jù)RACE產(chǎn)物序列測定和拼接結(jié)果設(shè)計(jì)5’和3’端引物，以5’-RACE-ReadycDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物純化、克隆、測序。序列結(jié)果通過http//www.ncbi.nlm.nih.gov進(jìn)行同源性比較。
采用5’-和3’-RACE及長距離PCR的方法分別獲得了新基因的全長cDNA，命名為AngRem104(Angiotensin II related gene in mesangial cells)。
AngRem104 cDNA全長為1690bp，3’-端含有polyA及ACTAAA加尾信號，5’-端從90位堿基開始為編碼347個氨基酸的完整開放讀碼框，ATG起始的周邊序列符合Kozak規(guī)律(CTGATGT)。同源性比較發(fā)現(xiàn)與已知基因序列無明顯同源性，為新基因，見序列表中的序列1。
實(shí)施例3、Northern blot分析AngRem104在人正常組織中的表達(dá)分布取30ng AngRem104 cDNA以[α-32P]dCTP進(jìn)行隨機(jī)引物法標(biāo)記成探針，并經(jīng)CHROMASPIN-100柱純化后，以42℃在甲酰胺雜交體系(5×SSC，0.05M Na2HPO4，1×Denhart’sSolution，100μg/ml ss鮭精DNA，50％去離子甲酰胺)與正常人多組織mRNA尼龍膜(Clontech)雜交24小時。雜交結(jié)束嚴(yán)格洗膜，然后放射自顯影。
如圖2所示，Northern blot結(jié)果顯示AngRem104 mRNA在正常人心臟、胎盤、肝臟、骨骼肌、腎臟和胰腺組織廣泛表達(dá)，但在腦和肺組織沒有表達(dá)，轉(zhuǎn)錄體為1.7Kb，與得到的全長序列相符。
實(shí)施例4、MsC在AngII作用下AngRem104 mRNA表達(dá)的時間曲線及AngII的阻斷實(shí)驗(yàn)系膜細(xì)胞常規(guī)傳代培養(yǎng)至亞融合狀態(tài)后給予AngII(10-6mol/L，Sigma)刺激。分別在AngII刺激6h、12h、24h和48h提取細(xì)胞的總RNA，以Northern blot的方法觀察AngRem104的mRNA表達(dá)。當(dāng)AngII刺激6h后，以AngIII型受體拮抗劑Losartan(10-6～10-4mol/L，Merck & Co Inc)作用于人系膜細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，提取細(xì)胞總RNA，Northern blot觀察Losartan對AngII刺激的AngRem104 mRNA表達(dá)的影響。
如圖3所示，Northern blot的結(jié)果表明，在AngII刺激人系膜細(xì)胞后6h，AngRem104表達(dá)明顯上調(diào)，并可持續(xù)至48h；但是AngRem104 mRNA的上調(diào)表達(dá)可以劑量依賴地被Losartan阻斷，提示AngII可以特異性調(diào)節(jié)新基因AngRem104的表達(dá)。此調(diào)節(jié)作用是通過AngIII型受體(angiotensin II type I receptor，AT1R)，提示AngRem104是AngII下游特異的靶基因之一。
實(shí)施例5、帶有AngRem104融合表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)AngRem104 cDNA的全長序列設(shè)計(jì)AngRem104開放閱讀框(AngRem104 ORF)的引物。上游引物5’-ATG TCA GAT TAT AAT CCT GAT G-3’，下游引物5’-ACT GTAGAG GAG TCC TAG G-3’，以含有AngRem104 cDNA全長的質(zhì)粒pGEM-T-AngRem104為模板，采用Advantage 2 PCR試劑盒進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件是94℃預(yù)變性1min，94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸3min，共28個循環(huán)，最后72℃ 10min，然后行1％瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。將PCR產(chǎn)物純化后定向克隆到pcDNA3.1/V5-His-TOPO載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α菌，以氨芐青霉素篩選白色克隆進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增、提取和酶切鑒定。重組的陽性克隆進(jìn)行序列測定，并得到正義和反義融合表達(dá)載體AngRem104-pcDNA3.1/V5-His-TOPO。
實(shí)施例6、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前24h傳代，細(xì)胞密度為1×105/35mm培養(yǎng)皿，共分4組，分別是AngRem104-pcDNA3.1/V5-His-TOPO重組正義質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、重組反義質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空載體pcDNA3.1/V5-His-TOPO組和空白對照組。系膜細(xì)胞在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前用無血清培養(yǎng)基洗2-3次。各組質(zhì)粒均經(jīng)大量制備并純化后每組取2μg分別與10μl脂質(zhì)體混合，室溫靜止30min，分別加入相應(yīng)的培養(yǎng)皿中，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)15h后換含10％血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
實(shí)施例7、RT-PCR和Western blot檢測AngRem104 mRNA及重組融合蛋白的表達(dá)系膜細(xì)胞被轉(zhuǎn)染24h和48h后分別提取細(xì)胞總RNA。總RNA的提取采用Gibco BRL公司的Trizol試劑，按說明書操作方法進(jìn)行，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA無降解，紫外分光光度計(jì)定量后用于反轉(zhuǎn)錄。利用Promega公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。隨后以GAPDH作為內(nèi)參照進(jìn)行AngRem104 PCR擴(kuò)增(引物序列同前)。GAPDH的上游引物為5’-ACC ACA GTC CAT CAT GCC ATC AC-3’，下游引物為5’-TCCACC ACC CTG TTG CTG TA-3’，片段大小為500bp。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共28個循環(huán)，最后72℃ 10min，然后行1％瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染24h后，重組正義AngRem104轉(zhuǎn)染組中AngRem104 mRNA的表達(dá)量明顯高于空載體轉(zhuǎn)染組和空白對照組，重組反義AngRem104質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中AngRem104 mRNA的表達(dá)量與空載體組和空白對照組相比無差別。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h后上述結(jié)果更加明顯。結(jié)果如圖4所示，圖中MMarker；1、5陰性對照；2、6AngRem104 sense轉(zhuǎn)染組；3、7AngRem104 antisense轉(zhuǎn)染組；4、8空載體轉(zhuǎn)染組。
采用Western blot的方法，利用抗V5單克隆抗體(抗載體上的V5蛋白)檢測正義和反義AngRem104重組融合蛋白的表達(dá)。實(shí)施例5中得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系膜細(xì)胞48h后，提取AngRem104-pcDNA3.1/V5-His-TOPO重組正義質(zhì)粒組、重組反義質(zhì)粒組、空載體pcDNA3.1/V5-His-TOPO組和空白對照組細(xì)胞的總蛋白。培養(yǎng)細(xì)胞用冰預(yù)冷的PBS洗2次后加入裂解液，冰浴5min，將裂解物12000r/min離心10min后收集上清。在10％SDS-PAGE上進(jìn)行分離后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。經(jīng)5％脫脂奶粉封閉后，與小鼠抗人V5單克隆抗體室溫孵育1h，再經(jīng)洗膜、發(fā)光反應(yīng)曝光于X光片上。結(jié)果如圖5所示，顯示，在系膜細(xì)胞中可表達(dá)正義AngRem104重組融合蛋白，融合蛋白在42kDa處顯帶，陽性對照的空載體pcDNA3.1/V5-His-TOPO蛋白于5kD.a處顯帶，AngRem104反義轉(zhuǎn)染組和空白對照組無特異條帶。圖中1陰性對照；2AngRem104 sense轉(zhuǎn)染組；3AngRem104 antisense轉(zhuǎn)染組；4空載體轉(zhuǎn)染組。
RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果證明AngRem104-pcDNA3.1/V5-His-TOPO正義質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中AngRem104基因過量表達(dá)，而在反義質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中AngRem104基因的表達(dá)被成功阻斷。
實(shí)施例8、AngRem104過表達(dá)時纖粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)mRNA的表達(dá)實(shí)驗(yàn)共分6組，分別是AngRem104-pcDNA3.1/V5-His-TOPO重組正義質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、重組反義質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空載體pcDNA3.1/V5-His-TOPO轉(zhuǎn)染組、重組反義質(zhì)粒轉(zhuǎn)染加AngII(10-6mol/L)刺激組、單純AngII(10-5mol/L)刺激組和空白對照組。采用GibcoBRL公司的Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，利用Promega公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。隨后以GAPDH作為內(nèi)參照進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列分別為FN(sense)5’-TGG AAC TTC TAC CAG TGC GAC-3’，(antisense)5’-TGTCTT CCC ATC ATC GTA ACA C-3’，片段大小為500bp；GAPDH(sense)5’-CGT CTTCAC CAC CAT GGA GA-3’，(antisense)5’-CGG CCA TCA CGC CAC AGT TT-3’，片段大小為300bp。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性1min，94℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，共28個循環(huán)。
如圖6的RT-PCR結(jié)果顯示在正義AngRem104轉(zhuǎn)染組中FN mRNA的表達(dá)量明顯高于空載體轉(zhuǎn)染組和空白對照組，而反義AngRem104轉(zhuǎn)染組中FN mRNA的表達(dá)量與空載體組和空白對照組相比無差別。單純用AngII(10-6mol/L)刺激時FN的表達(dá)明顯上調(diào)；而反義AngRem104轉(zhuǎn)染后加AngII(10-6mol/L)刺激組中FN的表達(dá)并不增加，表明AngII誘導(dǎo)的FN的表達(dá)升高是通過AngRem104基因來調(diào)控的。圖中MMarker；1陰性對照；2AngRem104 sense轉(zhuǎn)染組；3AngRem104 antisense轉(zhuǎn)染組；4AngRem104antisense+AngII；5AngII；6空載體轉(zhuǎn)染組。
序列表<160>2<210>1<211>1690<212>DNA<213>人屬人(Homosapiens)<400>1acgcggggag gaacaaggtt ccttcaagtt gggtctattt tcttctaagt ttatcactgc60tccatagcag ttataattag attaccctga tgtcagatta taatcctgat gtcctccagc120agcttgtcaa ggatggaatc aagactatcg agcttttaca gcagagtccg gaagactttc180agaagacgta cggcagaagt gccatccagg agccgtcgac aagagccaga atccaaagtt240gggagtcccg caatcccgat catgattaca ccggtaataa aaatcagaga agcgagggag300ctaaagagag agcaaacaag agcgagagcg cgggaactgc ttcagctgat ggaggacatg360gagataaacc ctcaaataac gggggtgact cccaaaacga gtaccaaggg tcagatcaac420aggtatggga tgctgcgtat aatgatggga atagtggcgg agcttgggga ggtcccacag480gtggacttcc cacggctgga gaaagagggt atcctatcac aacaggaaat caagaatttg540agggatacca tcccgacggt ccagttgatg ctcgagagta taatcagata agctccatgg600atcatgagat gtctgctgca gaaactttgg gctcgtctac tcagctaact actatgagaa660acgcaacaac tgatgatttt gcgaaaattt ttgaggaggg gacacctaaa gtgcaccgac720ggctgagggg gataactgct gttgtgccgg ctcaaaagca accaggggca gtcggtggac780ctgttaaaaa aggcaccgac gggagtactg catcgacact tttgggggac gtaccattat840ccgggagtgg tgcaatcccc aatgtgcacc cctcactgtt acaccaaccc aaaaagaatg900ctcatgcgga gaatgcccaa ggcagtgtgc aagatgtatc gacgaccggg gctattggcc960aaagtgacga ggctgcacac tttgatcagg agattgaagg aaaactcaat cttgtgctta1020aggaattaga tctgatcagt aagaagctag actatctacc ggagatcaaa gaggagatca1080ggaatattaa taagaaaata accaatctta gcctaggact cctctacagt tgaaaactta1140tatcaaatcc atgatgatca ttatccctag ctcaggaaag cctgatgtga atgacacggc1200tgaggtgaat ccagatctga aggcagtaat tgggagagat aaaactaggg ggttgaagga1260agttacaaca cacaggagtg atctagaaag tttagacctc ctaagcccag caacatcaga1320aatagaccct aaatacctga ctcaagacct ggatttcact aagtctaatg ccgccaattt1380tgtcccaggc aatgatgcca gctcatttta taccattgtg gctatgatca agggtgaagt1440aactgatgtc aaacgtcagc aagagttgat caagtgggtg tctgactcca tgaacaaaca1500ccccatggga cagatctacc gtgtcgtgag ggaggctctg gatgctgaaa gtgacagctc1560ctcaagctca gatagtgatt agatgctaag gcaaccagct tacacattat acaattattg1620ttgttattgt aacactggct ttgaattaat ctactaaatt gcccaaaaaa aaaaaaaaaa1680aaaaaaaaaa 1690<210>2
<211>347<212>PRT<213>人屬人(Homosapiens)<400>2Met Ser Asp Tyr Asn Pro Asp Val Leu Gln Gln Leu Val Lys Asp15 10 15Gly Ile Lys Thr Ile Glu Leu Leu Gln Gln Ser Pro Glu Asp Phe20 25 30Gln Lys Thr Tyr Gly Arg Ser Ala Ile Gln Glu Pro Ser Thr Arg35 40 45Ala Arg Ile Gln Ser Trp Glu Ser Arg Asn Pro Asp His Asp Tyr50 55 60Thr Gly Asn Lys Asn Gln Arg Ser Glu Gly Ala Lys Glu Arg Ala65 70 75Asn Lys Ser Glu Ser Ala Gly Thr Ala Ser Ala Asp Gly Gly His80 85 90Gly Asp Lys Pro Ser Asn Asn Gly Gly Asp Ser Gln Asn Glu Tyr95 100 105Gln Gly Ser Asp Gln Gln Val Trp Asp Ala Ala Tyr Asn Asp Gly110 115 120Asn Ser Gly Gly Ala Trp Gly Gly Pro Thr Gly Gly Leu Pro Thr125 130 135Ala Gly Glu Arg Gly Tyr Pro Ile Thr Thr Gly Asn Gln Glu Phe140 145 150Glu Gly Tyr His Pro Asp Gly Pro Val Asp Ala Arg Glu Tyr Asn155 160 165Gln Ile Ser Ser Met Asp His Glu Met Ser Ala Ala Glu Thr Leu170 175 180Gly Ser Ser Thr Gln Leu Thr Thr Met Arg Asn Ala Thr Thr Asp185 190 195Asp Phe Ala Lys Ile Phe Glu Glu Gly Thr Pro Lys Val His Arg200 205 210Arg Leu Arg Gly Ile Thr Ala Val Val Pro Ala Gln Lys Gln Pro215 220 225
Gly Ala Val Gly Gly Pro Val Lys Lys Gly Thr Asp Gly Ser Thr230 235 240Ala Ser Thr Leu Leu Gly Asp Val Pro Leu Ser Gly Ser Gly Ala245 250 255Ile Pro Asn Val His Pro Ser Leu Leu His Gln Pro Lys Lys Asn260 265 270Ala His Ala Glu Asn Ala Gln Gly Ser Val Gln Asp Val Ser Thr275 280 285Thr Gly Ala Ile Gly Gln Ser Asp Glu Ala Ala His Phe Asp Gln290 295 300Glu Ile Glu Gly Lys Leu Asn Leu Val Leu Lys Glu Leu Asp Leu305 310 315Ile Ser Lys Lys Leu Asp Tyr Leu Pro Glu Ile Lys Glu Glu Ile320 325 330Arg Asn Ile Asn Lys Lys Ile Thr Asn Leu Ser Leu Gly Leu Leu335 340 345Tyr Ser34權(quán)利要求
1.一種血管緊張素II相關(guān)基因AngRem104，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述血管緊張素II相關(guān)基因，其特征在于所述血管緊張素II相關(guān)基因?yàn)镾EQ ID №1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述血管緊張素II相關(guān)基因，其特征在于所述SEQ ID №1的編碼框?yàn)樽?’端第90位堿基到第1130位堿基。
4.血管緊張素II相關(guān)的蛋白質(zhì)AngRem104，它是序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述蛋白是序列表中SEQ ID №2。
6.含有權(quán)利要求1所述血管緊張素II相關(guān)基因的表達(dá)載體。
7.含有權(quán)利要求1所述血管緊張素II相關(guān)基因的細(xì)胞系。
8.一種擴(kuò)增血管緊張素II相關(guān)基因AngRem104的引物上游引物5’-ATG TCA GAT TAT AAT CCT GAT G-3’下游引物5’-ACT GTA GAG GAG TCC TAG G-3’。
9.血管緊張素II相關(guān)基因AngRem104及其編碼蛋白在制備治療腎小球疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種血管緊張素II的相關(guān)基因及其編碼蛋白質(zhì)與應(yīng)用。本發(fā)明的血管緊張素II的相關(guān)基因是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。本發(fā)明血管緊張素II相關(guān)基因編碼的蛋白質(zhì)，是序列表中SEQ ID №2的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2相同活性的由SEQID №2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明為揭示AngII參與腎小球疾病進(jìn)展的可能分子機(jī)制提供了新的線索。
文檔編號C12N15/12GK1524958SQ03105028
公開日2004年9月1日 申請日期2003年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月27日
發(fā)明者王海燕, 張宏, 梁秀彬, 周安寧 申請人:北京大學(xué)第一醫(yī)院