專利名稱：數(shù)字化分析的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于檢測樣品中靶物質的方法和組合物。
背景經常在包含一種或多種靶序列的樣品中檢測是否存在一種或多種靶序列。例如，癌癥以及多種傳染性疾病諸如AIDS和肝炎的檢測，通常包括篩選生物樣品中是否存在診斷性核酸序列。檢測是否存在核酸序列也經常用于法醫(yī)學、親子鑒定、遺傳咨詢和器官移植。
發(fā)明概述在某些實施方案中，提供了定量靶物質的方法。在某些實施方案中，該方法包含形成反應混合物，其中包含可能包含靶物質的樣品；可編碼的(codeable)標記；一種或多種靶特異性探針，其中每種靶特異性探針在選擇性結合條件下特異性結合靶物質；以及分離成分。在某些實施方案中，該方法另外包含在反應條件下處理反應混合物，以便在存在靶物質時產生可檢測的復合物，缺少靶物質時則不產生，其中該可檢測復合物包含可編碼標記、靶特異性探針和分離成分。在某些實施方案中，該方法另外包含將可檢測復合物與不包括于其中的可編碼標記分離，并通過計數(shù)可編碼標記來定量靶物質。
在某些實施方案中，提供了定量至少兩種不同的特定靶物質的方法。在某些實施方案中，該方法包含形成反應混合物，其中包含可能包含兩種或多種不同特定靶物質的樣品；特異性針對每種不同特定靶物質的不同的可編碼的標記；一種或多種特異性針對每種不同特定靶物質的不同靶特異性探針，其可在選擇性結合條件下特異性結合靶物質；以及分離成分。在某些實施方案中，該方法另外包含在反應條件下處理反應混合物，以便在存在特定靶物質時產生可檢測的復合物，其中包含特定靶物質特異性的可編碼標記、特定靶物質特異性的靶特異性探針和分離成分；并且在缺少特定靶物質時，不產生可檢測的復合物。在某些實施方案中，該方法另外包含將產生的任何可檢測復合物與不包括在其中的可編碼標記分離，并通過計數(shù)每種不同特定靶物質的特異性可編碼標記來定量每種不同特定靶物質。
在某些實施方案中，提供了定量樣品中至少兩種不同靶核酸序列的方法。在某些實施方案中，該方法包含將樣品與特異性針對至少兩種不同靶核酸序列中每一種的不同探針組合相混合，形成連接反應混合物。在某些實施方案中，每種探針組合包含(a)至少一種包含磁性顆粒及第一種靶特異性探針的分離小珠，以及(b)至少一種包含可編碼標記及第二種靶特異性探針的檢測小珠；其中在互補靶序列上彼此相鄰雜交時，每一組合中的靶特異性探針適合于連在一起。在某些實施方案中，該方法另外包含將連接反應混合物進行連接反應，其中相鄰雜交的互補靶特異性探針彼此連接，形成包含分離小珠及檢測小珠的連接產物。在某些實施方案中，該方法另外包含將任何連接產物與未連接的檢測及分離小珠分離。在某些實施方案中，該方法另外包含通過計數(shù)可編碼標記，定量至少兩種不同靶核酸序列中的每一種。
在某些實施方案中，提供了檢測樣品中靶核酸序列的試劑盒。在某些實施方案中，該試劑盒包含每種靶核酸序列特異性的不同小珠組合。在某些實施方案中，每種不同小珠組合包含(a)至少一種分離小珠，其包含磁性顆粒、包含兩種或多種標記的第一種可編碼標記以及第一種靶特異性探針，其中第一種可編碼標記特異性針對第一種靶特異性探針，以及(b)至少一種檢測小珠，其包含含有一組兩種或多種標記的第二種可編碼標記以及第二種靶特異性探針，其中第二種可編碼標記特異性針對第二種靶特異性探針；并且其中第一種可編碼標記在檢測上不同于第二種可編碼標記。在某些實施方案中，在互補靶序列上彼此相鄰雜交時，每一組合中的靶特異性探針適合于連在一起。
附圖簡述

圖1顯示本發(fā)明某些實施方案的探針組合。
圖2顯示使用本發(fā)明某些實施方案區(qū)分靶位點處兩種可能的等位基因的方法。
圖2(A)顯示(i)兩種不同探針組合，具有不同的第一種靶特異性探針A和B，其中央(pivotal)互補物不同(A探針為T，B探針為C)，并具有相同的第二種靶特異性探針Z，以及(ii)包含中央核苷酸A的靶序列。
圖2(B)顯示與靶物質退火的三種靶特異性探針。探針A的序列特異性部分與包含中央核苷酸的3′靶區(qū)完全互補。探針B的中央互補物不與3′靶區(qū)互補。探針B的序列特異性部分因而在3′端包含一個堿基對的錯配。探針Z的序列特異性部分與5′靶區(qū)完全互補。
圖2(C)顯示連接靶特異性探針A和Z，形成連接產物A-Z。由于探針B上錯配的中央互補物，探針B和Z未彼此相連形成連接產物。
圖2(D)顯示使雙鏈分子變性，釋放A-Z連接產物以及未連接的探針B和Z。
圖3顯示某些實施方案使用兩種顏色標記的某些可能的二元和三元編碼。
圖4顯示某些實施方案的探針組合使用兩種顏色二元編碼時的某些標記組合(編碼)的組合。圖4還描述了使用兩種三元色、10種二元色或6種三元色時，某些實施方案可能的探針組合編碼的數(shù)目。
圖5描述了典型的可變剪接(alternative splicing)。
圖6描述了檢測剪接變體的某些實施方案。
圖7說明某些典型的實施方案，其中第一種靶特異性探針和第二種靶特異性探針在與樣品中靶分子雜交之后相連。
圖8說明某些典型的實施方案，其中將分離成分與可編碼標記及可檢測復合物分離。
圖9說明某些檢測從樣品中分離的可檢測復合物的實施方案。
圖10說明某些典型的實施方案，其中將分離成分與可編碼標記及可檢測復合物分離。
圖11說明某些典型的實施方案，其中將連接的可檢測復合物與未連接的可編碼標記分離。
圖12說明某些典型的實施方案，其中在與樣品和連接反應相同的容器內檢測連接的可檢測復合物。
圖13說明某些典型的實施方案，其中在檢測容器內表面包含凹槽，幫助排列連接的可檢測復合物，以供檢測。
圖14(a)說明本發(fā)明某些實施方案的探針組合。
圖14(b)說明本發(fā)明某些實施方案的兩種探針組合、探針組合的連接及其檢測。
圖14(c)說明本發(fā)明某些實施方案的探針組合。
圖15描述了包含小珠的連接的可檢測復合物以及不包含小珠的連接產物的TaqmanTM分析結果。
圖16顯示連接反應后獲得的可檢測復合物的圖片。
圖17描述了在不同濃度靶分子中產生的連接的可檢測復合物的Taqman分析結果。
圖18說明某些典型的實施方案，通過連續(xù)流動將未配對的非磁性小珠與磁性小珠和可檢測復合物分離，然后利用流式細胞術計數(shù)可檢測復合物。
圖19說明某些典型的實施方案，通過連續(xù)流動將未配對的非磁性小珠與磁性小珠和可檢測復合物分離，利用可檢測復合物與未配對磁性小珠的阻尼(drag)差異去除未配對的磁性小珠，然后利用流式細胞術計數(shù)可檢測復合物。
圖20說明某些典型的實施方案，通過連續(xù)流動將未配對的非磁性小珠與磁性小珠和可檢測復合物分離，通過大小過濾分離未配對的磁性小珠，然后利用流式細胞術計數(shù)可檢測復合物。
圖21說明某些典型的實施方案，其分離方法利用磁性小珠及生物素包被的小珠。
圖22說明某些典型的實施方案，其連接反應利用包含可尋址(addressable)部分的探針。
圖23說明某些典型的實施方案，其中連接產物利用發(fā)夾結構連接于小珠。
圖24說明某些典型的實施方案，其中連接產物利用連接寡核苷酸連接于小珠。
圖25說明利用生物素分子的寡核苷酸連接(OLA)分析的某些典型的實施方案。
圖26說明某些典型的實施方案，其可編碼標記連接到與連接產物雜交的寡核苷酸。
圖27說明某些典型的實施方案，將可檢測復合物與不在其中的可編碼標記分離。
圖28說明某些典型的實施方案，使用管中管(a tube within a tube)將可檢測復合物與不在其中的可編碼標記分離。
圖29說明某些典型的實施方案，其可編碼標記連接到與連接產物雜交并連接的發(fā)夾結構。
典型實施方案詳述應當理解，上文概述及下文詳述均僅為代表性及說明性，而不限制所申請的發(fā)明。在本申請中，除非另外特別注明，使用單數(shù)包括復數(shù)。在本申請中，除非另外注明，使用″或″是指″和/或″。另外，使用術語″包括″并非限制。同樣，使用術語″部分″可能包括組成部分的一部分或全部。
此處使用的分節(jié)標題僅為組織目的，而不應認為限制所述主題。本申請引用的所有文件或其部分，包括但不限于專利、專利申請、文章、書籍以及論文，在此特別全文引入以供任何目的之參考。
定義及術語此處所用術語″核苷酸堿基″是指一個或多個取代或未被取代的芳香環(huán)。在某些實施方案中，一個或多個芳香環(huán)包含至少一個氮原子。在某些實施方案中，核苷酸堿基能夠與適當互補的核苷酸堿基形成Watson-Crick和/或Hoogsteen氫鍵。典型核苷酸堿基及其類似物包括但不限于，天然存在的核苷酸堿基腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶以及天然存在核苷酸堿基的類似物，例如7-脫氮腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、7-脫氮-8-氮雜鳥嘌呤、7-脫氮-8-氮雜腺嘌呤、N6-A2-異戊烯腺嘌呤(6iA)、N6-A2-異戊烯-2-甲硫基腺嘌呤(2ms6iA)、N2-二甲基鳥嘌呤(dmG)、7-甲基鳥嘌呤(7mG)、肌苷、水粉蕈素、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、次黃嘌呤、假尿嘧啶、假胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-丙烯胞嘧啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、2-硫代嘧啶、6-硫代鳥嘌呤、4-硫代胸腺嘧啶、4-硫代尿嘧啶、06-甲基鳥嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、甲基胸腺嘧啶、5，6-二氫胸腺嘧啶、5，6-二氫尿嘧啶、吡唑啉酮[3，4-D]嘧啶(參見例如美國專利6,143,877和6,127,121以及PCT公開申請WO 01/38584)、亞乙烯基腺嘌呤(ethenoadenine)、吲哚例如硝基吲哚和4-甲基吲哚、以及吡咯例如硝基吡咯。例如可以在Fasman，1989，Practical Handbook ofBiochemistry and Molecular Biology，385-394頁，CRC Press，BocaRaton，F(xiàn)la.，以及此處引用參考文獻中找到某些典型的核苷酸堿基。
此處所用術語″核苷酸″是指包含與糖例如核糖、阿拉伯糖、木糖和吡喃糖及其糖類似物的C-1′碳相連的核苷酸堿基的化合物。術語核苷酸也包括核苷酸類似物。糖可能是取代或未被取代。取代的核糖包括但不限于這樣的核糖，其中一個或多個碳原子例如2′-碳原子被一個或多個相同或不同的Cl、F、-R、-OR、-NR2或鹵素基團取代，其中每個R分別是H、C1-C6烷基或C5-C14芳基。典型核糖包括但不限于2′-(C1-C6)烷氧基核糖、2′-(C5-C14)芳氧基核糖、2′，3′-雙脫氫核糖、2′-脫氧-3′-鹵代核糖、2′-脫氧-3′-氟代核糖、2′-脫氧-3′-氯代核糖、2′-脫氧-3′-氨基核糖、2′-脫氧-3′-(C1-C6)烷基核糖、2′-脫氧-3′-(C1-C6)烷氧基核糖及2′-脫氧-3′-(C5-C14)芳氧基核糖、核糖、2′-脫氧核糖、2′，3′-雙脫氧核糖、2′-鹵代核糖、2′-氟代核糖、2′-氯代核糖以及2′-烷基核糖例如2′-O-甲基、4′-α-端基異構性核苷酸、1′-α-端基異構性核苷酸、2′-4′-和3′-4′-連接的及其它″鎖定的(locked)″或″LNA″、雙環(huán)糖修飾物(參見例如PCT公開申請WO 98/22489、WO 98/39352和WO99/14226)。多核苷酸中的典型LNA糖類似物包括但不限于以下結構 其中B為任何核苷酸堿基。
核糖2′-或3′-位點的修飾包括但不限于氫、羥基、甲氧基、乙氧基、烯丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、甲氧乙基、烷氧基、苯氧基、疊氮基、氨基、烷基氨基、氟代、氯代和溴代。核苷酸包括但不限于天然D旋光異構體以及L旋光異構體形式(參見例如Garbesi(1993)Nucl.Acids Res.214159-65；Fujimori(1990)J.Amer.Chem.Soc.1127435；Urata，(1993)Nucleic Acids Symposium Ser.No.2969-70)。核苷酸堿基是嘌呤例如A或G時，核糖連在核苷酸堿基的N9-位。核苷酸堿基是嘧啶例如C、T或U時，戊糖連在核苷酸堿基的N1-位置，假尿嘧啶除外，其戊糖連在尿嘧啶核苷酸堿基的C5位(參見例如Kornberg and Baker，(1992)DNA Replication，2ndEd.，F(xiàn)reeman，San Francisco，CA)。
核苷酸的一個或多個戊糖碳可由下式磷酸酯取代 其中α是0-4的整數(shù)。在某些實施方案中，α是2，膦酸酯連在戊糖的3′-或5′-碳上。在某些實施方案中，核苷酸中的核苷酸堿基為嘌呤、7-脫氮嘌呤、嘧啶或其類似物。″核苷酸5′-三磷酸″是指5′位帶有三磷酸酯基團的核苷酸，有時為特別指出核糖的結構特征而表示為″NTP″或″dNTP″和″ddNTP″。三磷酸酯基團可能包括硫取代各種氧，例如α-硫-核苷酸5′-三磷酸。核苷酸化學的綜述參見Shabarova，Z.和Bogdanov，A.Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids，VCH，New York，1994。
此處所用術語″核苷酸類似物″是指核苷酸的戊糖和/或核苷酸堿基和/或一個或多個磷酸酯由其各自的類似物取代的實施方案。在某些實施方案中，典型的戊糖類似物如上所述。在某些實施方案中，核苷酸類似物具有上述的核苷酸堿基類似物。在某些實施方案中，典型的磷酸酯類似物包括但不限于磷酸烷基酯、磷酸甲基酯、氨基磷酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯(phosphorothioates)、二硫代磷酸酯、phosphoroselenoates，phosphorodiselenoates，phosphoroanilothioates，phosphoroanilidates，phosphoroamidates，boronophosphates等，并可能包括相關的平衡離子。
″核苷酸類似物″的定義還包括可以聚合成多核苷酸類似物的核苷酸類似物單體，其中DNA/RNA磷酸酯和/或糖磷酸酯主鏈由不同類型的核苷酸間連接所取代。典型多核苷酸類似物包括但不限于肽核酸，其中多核苷酸的糖磷酸主鏈由肽主鏈取代。
此處所用術語″多核苷酸″、″寡核苷酸″和″核酸″可交互使用，是指核苷酸單體的單鏈和雙鏈聚合物，包括通過核苷酸間磷酸二酯鍵相連的2′-脫氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)、或核苷酸間類似物以及相關的平衡離子例如H+、NH4、三烷基銨、Mg2+、Na+等。核酸可能由全部脫氧核糖核酸、全部核糖核酸或其嵌合混合物組成。核苷酸單體單位可能包含此處所述任何核苷酸，包括但不限于天然存在的核苷酸和核苷酸類似物。核酸一般大小為幾個單體單位例如5-40個(在本領域提到寡核苷酸時)，至幾千個單體核苷酸單位。除非另有所指，每當給出核酸序列時，應當理解核苷酸從左至右為5′-3′順序，″A″表示脫氧腺苷或其類似物，″C″表示脫氧胞苷或其類似物，″G″表示脫氧鳥苷或其類似物，″T″表示胸苷或其類似物，除非另外注明。
核酸包括但不限于基因組DNA、cDNA、hnRNA、mRNA、rRNA、tRNA、片段化的核酸、從亞細胞器例如線粒體或葉綠體中獲得的核酸以及從可能存在于生物樣品中的微生物、或DNA或RNA病毒中獲得的核酸。
核酸可能由單一類型的糖成分組成，例如RNA和DNA，或由不同糖成分的混合物組成，例如RNA/DNA嵌合體。在某些實施方案中，核酸是下列結構式所示核糖多核苷酸及2′-脫氧核糖多核苷酸。
其中每個B獨立地是核苷酸的堿基部分，例如嘌呤、7-脫氮嘌呤、嘧啶或核苷酸類似物；每個m確定各個核酸的長度，為0至數(shù)千、數(shù)萬或更多；每個R獨立選自氫、鹵素、--R″、--OR″、和--NR″R″，其中每個R″獨立為(C1-C6)烷基或(C5-C14)芳基，或兩個相鄰的R共同成鍵，而使核糖為2′，3′-雙脫氫核糖；每個R′獨立為羥基或 其中α為0、1或2。
在上述核糖多核苷酸及2′-脫氧核糖多核苷酸的某些實施方案中，核苷酸堿基B如前所述共價附于糖成分的Cl′碳。
術語″核酸″、″多核苷酸″及″寡核苷酸″也可能包括核酸類似物、多核苷酸類似物及寡核苷酸類似物。術語″核酸類似物″、″多核苷酸類似物″及″寡核苷酸類似物″交互使用，如此處所用，是指包含至少一個核苷酸類似物、和/或至少一個磷酸酯類似物、和/或至少一個戊糖類似物的核酸。核酸類似物的定義還包括其中磷酸酯和/或糖磷酸酯連接由其它類型連接所取代的核酸，例如N-(2-氨乙基)-甘氨酸酰胺及其它酰胺(參見例如Nielsen等人，1991，Science 2541497-1500；WO92/20702；美國專利5,719,262；美國專利5,698,685；)；嗎啉代(參見例如美國專利5,698,685；美國專利5,378,841；美國專利5,185,144)；氨基甲酸酯(參見例如Stirchak&Summerton，1987，J.Org.Chem.524202)；亞甲基(甲基亞氨基)(參見例如Vasseur等人，1992，J.Am.Chem.Soc.1144006)；3′-thioformacetals(參見例如Jones等人，1993，J.Org.Chem.582983)；氨基磺酸酯(參見例如美國專利5,470,967)；2-氨乙基甘氨酸，常稱作PNA(參見例如Buchardt，WO 92/20702；Nielsen(1991)Science 2541497-1500)；及其它(參見例如美國專利5,817,781；Frier&Altman，1997，Nucl.Acids Res.254429以及此處引用的參考文獻)。磷酸酯類似物包括氮不限于(i)C1-C4烷基磷酸酯，例如磷酸甲基酯；(ii)氨基磷酸酯；(iii)C1-C6烷基磷酸三酯；(iv)硫代磷酸酯以及(v)二硫代磷酸酯。
術語″退火″和″雜交″交互使用，是指一個核酸與另一核酸的堿基配對相互作用，從而形成雙鏈、三鏈或其它高級結構。在某些實施方案中，主要是根據(jù)Watson/Crick和Hoogsteen型氫鍵的堿基特異性相互作用，例如A/T和G/C。在某些實施方案中，堿基堆積和疏水性相互作用也可能有助于雙鏈穩(wěn)定性。
此處所用術語″變體″是指蛋白質的任何改變，包括但不限于氨基酸序列的改變、一個或多個氨基酸的置換、一個或多個氨基酸的添加、一個或多個氨基酸的缺失以及氨基酸自身的改變。在某些實施方案中，這些改變包括保守性氨基酸置換。保守性氨基酸置換可能包括將一個氨基酸替換為例如具有相似疏水性、親水性、電荷或芳香性的另一氨基酸。在某些實施方案中，可能根據(jù)相似的親水性指數(shù)(hydrophthicindices)進行保守性氨基酸置換。親水性指數(shù)考慮氨基酸的疏水性及電荷特征，在某些實施方案中，可能用來指導選擇保守性氨基酸置換。例如Kyte等人，J.Mol.Biol.，157105-131(1982)討論了親水性指數(shù)。本領域應當理解，可能根據(jù)任何上述特征進行保守性氨基酸置換。
氨基酸的改變可能包括但不限于糖基化、甲基化、磷酸化、生物素化以及不引起氨基酸序列改變的任何共價和非共價的蛋白質加成。此處所用″氨基酸″是指可能通過酶促或合成摻入多肽或蛋白質中的任何天然或非天然氨基酸。
此處所用″親和組合″是彼此特異性結合的一組分子。親和組合包括但不限于生物素和親和素、生物素和鏈親和素、受體和配基、抗體和配基、抗體和抗原以及多核苷酸序列及其互補物。在某些實施方案中，結合的親和組合可能解開。例如，雜交的多核苷酸序列可能變性，結合鏈親和素的生物素可能經加熱而解開。
″靶物質″是指可以利用探針而區(qū)分的任何物質。靶物質可能包括天然存在或合成的分子。
在某些實施方案中，靶物質可能包括核酸序列。在某些實施方案中，靶核酸序列可能包括RNA和DNA。典型的RNA靶序列包括但不限于mRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA以及RNA變體。例如剪接變體。典型DNA靶序列包括但不限于基因組DNA、質粒DNA、噬菌體DNA、核仁DNA、線粒體DNA和葉綠體DNA。
在某些實施方案中，核酸序列包括但不限于cDNA、酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)、其它染色體外DNA以及核酸類似物。典型核酸類似物包括但不限于LNA、PNA、PPG及其它下述核酸類似物。
可利用多種方法獲得用于本發(fā)明組合物及方法的靶核酸序列。通過從生物學基質中分離而獲得靶核酸時，某些分離技術包括(1)有機提取后乙醇沉淀，例如使用酚/氯仿有機試劑(例如Ausubel等人編著，Current Protocols in Molecular Biology卷1，第二章，I節(jié)，John Wiley&Sons，New York(1993))，優(yōu)選使用自動化DNA提取儀，例如PEApplied Biosystems(Foster City，CA)的Model 341 DNA提取儀；(2)靜相吸附方法(例如Boom等人，美國專利5,234,809；Walsh等人，Biotechniques 10(4)506-513(1991))；以及(3)鹽致DNA沉淀方法(例如Miller等人，Nucleic Acids Research，16(3)9-10(1988))，該沉淀方法一般稱作″鹽析″方法。在某些實施方案中，可在上述分離方法之前進行酶消化步驟，例如蛋白酶K或其它蛋白酶消化，以幫助從樣品中去除不需要的蛋白質。
在某些實施方案中，靶核酸序列包括但不限于擴增產物、連接產物、轉錄產物、反轉錄產物、引物延伸產物、甲基化DNA以及斷裂產物。在某些實施方案中，靶核酸序列可能通過全基因組擴增而制備。在某些實施方案中，靶核酸序列可能通過等溫擴增和/或連接而制備。
在某些實施方案中，樣品中核酸序列可能經過斷裂程序，例如InvaderTM分析中的斷裂程序(例如美國專利5,846,717；5,985,557；5,994,069；6,001,567；和6,090,543所例證)。當樣品中存在目的核酸時，該程序產生斷裂產物。在某些實施方案中，靶物質可能是這種斷裂產物。簡言之，斷裂程序可能利用兩種核酸寡核苷酸，它們被設計為與樣品中核酸互補。第一種寡核苷酸包含不與樣品中核酸互補的5′部分，相鄰為與樣品中核酸互補的3′部分。第二種寡核苷酸在與第一種寡核苷酸互補的樣品中核苷酸的3′區(qū)與樣品中核酸互補，并包括與第一種寡核苷酸互補區(qū)略微重疊的互補或非互補部分。兩種寡核苷酸與樣品中核酸雜交，通常在酶的存在下導致第一種寡核苷酸的一部分斷裂。斷裂產物一般是第一種寡核苷酸不與樣品中核酸互補的5′部分，互補區(qū)部分則與第二種寡核苷酸重疊。該斷裂產物包含已知的核酸序列。在某些實施方案中，該斷裂產物可能是靶物質。
不同的靶核酸序列可能是單個鄰近核酸的不同部分，或可能位于不同核酸中。單個鄰近核酸的不同部分可能重疊。
在某些實施方案中，靶核酸序列包含上游或5′區(qū)、下游或3′區(qū)以及位于上游區(qū)和下游區(qū)之間的″中央核苷酸″(參見例如圖1)。中央核苷酸是由探針組合檢測的核苷酸，例如而非限制，可能代表多等位靶基因座的單個多態(tài)性核苷酸。
一般技術人員應當理解，靶核酸序列一般描述為單鏈分子，雙鏈分子的另一鏈包含互補序列，也可能用作靶序列。
其它靶物質包括但不限于肽序列。肽序列包括但不限于蛋白質、蛋白質片段及其它氨基酸片段。在某些實施方案中，肽靶序列包括但不限于不同的肽等位體(peptide alleles)(具有不同氨基酸的類似肽)以及不同的肽構型(具有不同二級和三級結構的類似蛋白質)。其它天然存在的靶物質包括但不限于激素和其它信號分子，例如激素和其它類固醇型分子。
在某些實施方案中，靶物質包括但不限于合成肽、藥物及其它有機小分子。
探針術語″探針″或″靶特異性探針″是包含可特異性結合靶物質部分的任何成分。探針可能包括但不限于核酸、肽及其它可特異性結合樣品中靶物質的分子。這種特異性結合包括但不限于核酸分子間雜交、抗體-抗原相互作用、配基與受體間相互作用以及適體(aptomer)與蛋白質間相互作用。
在某些實施方案中，探針包含核酸序列特異性部分，設計以序列特異性方式與所選靶核酸序列的互補區(qū)雜交。在某些實施方案中，探針的序列特異性部分可能特異性針對特定序列，或者可能是簡并的，例如特異性針對一組序列。針對靶肽的探針可能包含抗體，這是非限制性實例。
在某些實施方案中，探針包含適體，這是特異性結合某些肽序列的核酸。在某些實施方案中，探針包含肽。這種肽包括但不限于抗體和受體分子。在某些實施方案中，探針包含針對特異性靶肽抗原的抗體。
在某些實施方案中，探針可能包括其它的獨特結合對子的成員，例如鏈親和素/生物素結合對，以及得自ProlinxTM(Bothell，WA)的親和結合化學劑，例如美國專利5,831,046；5,852,178；5,859,210；5,872,224；5,877,297；6,008,406；6,013,783；6,031,17和6,075,126所例示。
本發(fā)明的″探針組合″是一組按設計檢測至少一種靶物質的兩種或多種探針。作為非限制性實例，探針組合可能包含按設計與靶物質雜交的兩種核酸探針，這兩種探針彼此相鄰的與靶物質雜交時，它們適于相互連接。
在本發(fā)明范圍內使用時，″適于連接″是指至少一個第一種靶特異性探針與至少一個第二種靶特異性探針各自包含合適的反應性基團。典型的反應性基團包括但不限于第一種探針3′端的游離羥基以及第二種探針5′端的游離磷酸基、硫代磷酸酯和甲苯磺酸鹽或碘化物、酯和酰肼、RC(O)S-、鹵代烷基、RCH2S和α-鹵?；?、硫代磷酰和溴代乙酰氨基以及S-pivaloyloxymethyl-4-硫代胸苷。另外，在某些實施方案中，第一種和第二種靶特異性探針與靶序列雜交，以致第一種靶特異性探針的3′端和第二種靶特異性探針的5′端緊密相鄰而可以連接。
可編碼標記(codeable label)術語″標記″是指能夠提供可檢測信號、或與另一種分子或該組分子中的其它成員相互作用、從而提供可檢測信號(由第一種分子或第二種分子提供)例如FRET(熒光共振能量轉移)的任何分子或分子組合。利用已知的標記、連接、連接基團、試劑、反應條件以及分析和純化方法，使用大量已知技術中的任何一種，可以實現(xiàn)使用標記。標記包括但不限于產生或淬滅可檢測熒光、化學發(fā)光或生物熒光信號的發(fā)光或吸光化合物(參見例如Kricka，L.in Nonisotopic DNA ProbeTechniques(1992)，Academic Press，San Diego，3-28頁)。可用作標記的熒光報告染料包括但不限于熒光素(參見例如美國專利5,188,934；6,008,379和6,020,481)、羅丹明(參見例如美國專利5,366,860；5,847,162；5,936,087；6,051,719和6,191,278)、苯吩噁嗪(參見例如美國專利6,140,500)、能量轉移熒光染料，包含供體和受體對(參見例如美國專利5,863,727；5,800,996和5,945,526)和花菁(參見例如Kubista，WO 97/45539)以及任何能夠產生可檢測信號的其它熒光成分。熒光素染料的例子包括但不限于6-羧基熒光素、2′，4′，1，4，-四氯熒光素以及2′，4′，5′，7′，1，4-六氯熒光素。
其它典型的標記包括但不限于發(fā)光的發(fā)光分子以及與發(fā)光反應有關的分子，例如非限制性實例是螢光素螢光素酶反應。標記還包括但不限于化學發(fā)光和電發(fā)光的分子及反應。一個非限制性實例是，化學發(fā)光標記可能對膠片曝光。膠片顯色表明樣品中是否存在靶物質、或樣品中靶物質的數(shù)量。
其它典型標記包括但不限于供體-受體相互作用，其中供體分子放出能量，可由受體分子檢測到。然后受體分子發(fā)出可檢測信號。
其它典型標記包括但不限于涉及紅外光子釋放的分子。
標記還包括但不限于量子點?！辶孔狱c″是指能夠因接觸初級能量而響應發(fā)出次級能量的半導體納晶化合物。一般而言，單個量子點發(fā)出的能量通常具有相同的可預測波長。典型的半導體納晶化合物包括但不限于CdSe、CdS和ZnS晶體。美國專利5,990,479和6,207,392 B1以及″Quantum-dottagged microbeads for multiplexed optical codingof biomolecules，″Han等人，Nature Biotechnology，19631-635(2001)描述了某些實施方案的合適量子點。
本發(fā)明的標記還包括磷光體(phosphors)和放射性同位素。放射性同位素可能直接檢測，或可能激發(fā)熒光團，發(fā)出某一波長的光，然后檢測。磷光體顆?？赡苡杉t外光(約980nm左右)激發(fā)，但發(fā)出位于可見光譜的信號，因而顯著降低或消除背景光。
某些典型標記的其它實例包括帶有編碼信息、例如條碼(barcode)的顆粒，還包括美國專利4,053,433所述微粒標簽。某些其它非放射性標記方法、技術和試劑綜述于Non-Radioactive Labelling，A PracticalIntroduction，Garman，A.J.(1997)Academic Press，San Diego。
一類標記通過特異性或非特異性捕獲而有效分離或固化一種分子，例如生物素、地高辛配基和其它半抗原(參見例如Andrus，A.″Chemical methods for 5′non-isotopic labeling of PCR probes andprimers″(1995)in PCR 2A Practical Approach，Oxford UniversityPress，Oxford，39-54頁)。
″可編碼標記″是指特定成分特異性的一種或多種標記。在某些實施方案中，該成分是靶物質和/或探針。在可編碼標記包含一種以上標記的實施方案中，該標記可能相同或不同。檢測到指定的可編碼標記表明存在該可編碼標記特異性的成分。缺少指定的可編碼標記表明不存在該可編碼標記特異性的成分。
可編碼標記可能被稱作″檢測差異(detectably different)″，是指可利用至少一種檢測方法彼此區(qū)分。不同的可編碼標記包括但不限于發(fā)出不同波長光的一種或多種標記、發(fā)出不同強度光的一種或多種標記、發(fā)出不同數(shù)目和/或不同形式信號的一種或多種標記、具有不同熒光衰變壽命的一種或多種標記、具有不同光譜特征的一種或多種標記、具有不同放射性衰變性質的一種或多種標記、不同電荷的一種或多種標記以及不同大小的一種或多種標記。
在某些實施方案中，計數(shù)可編碼標記的數(shù)目是指實際計數(shù)各個可編碼標記。計數(shù)可編碼標記的數(shù)目不同于類似物信號檢測，后者檢測多個標記的總和信號水平。類似物信號檢測一般使用相同類型多個標記的信號集成，以確定樣品中存在的該標記數(shù)目。例如，類似物檢測一般通過比較測試樣品與含有已知量指定標記的對照樣品的信號亮度或強度水平，提供指定類型標記的估計數(shù)目。
相反，計數(shù)是數(shù)字檢測系統(tǒng)，它實際計數(shù)各個可編碼標記的數(shù)目。因此，在某些實施方案中，如果樣品中存在200個相同的可編碼標記，則實際計數(shù)其中每個標記。在某些實施方案中，所計數(shù)的標記數(shù)目可能在樣品中實際數(shù)目的20％之內。在某些實施方案中，所計數(shù)的標記數(shù)目可能在樣品中實際數(shù)目的10％之內。在某些實施方案中，所計數(shù)的標記數(shù)目可能在樣品中實際數(shù)目的50％之內。在某些實施方案中，計數(shù)樣品中存在的代表性標記部分，根據(jù)代表性部分計數(shù)的標記數(shù)目確定樣品中標記總數(shù)。相比之下，為利用類似物檢測確定樣品中標記數(shù)，測定200個標記的總和信號，并與已知標記數(shù)量的總和信號相比較。
在某些實施方案中，反應中的可編碼標記和探針充分超過所存在的靶物質，計數(shù)的可編碼標記數(shù)目代表存在的靶物質數(shù)目。在這類實施方案中，一般只有一個靶物質結合到每一可編碼標記。
在某些實施方案中，由于包括實際計數(shù)可編碼標記，數(shù)字化檢測受背景″噪聲″、或偶發(fā)光的影響可能較小，可以解釋為類似物檢測中的部分總和信號。
在某些實施方案中，通過計數(shù)可編碼標記，可以精確區(qū)分不同樣品中可編碼標記的不同數(shù)目。相反，在某些情況下，類似物檢測中多個標記的總和信號可能受不同樣品中不定量的背景信號影響，可能遮蔽不同樣品中標記數(shù)目的微小差別。
在檢測樣品中兩種或多種可不同檢測的可編碼標記的某些實施方案中，由于可不同檢測的可編碼標記的信號重疊而致的可能錯誤，可能通過計數(shù)各個可不同檢測的可編碼標記而減至最小。在某些類似物檢測方法中，來自一個標記的信號部分可能被檢測為另一不同標記的信號，從而可能引起錯誤解讀。如果不同標記的信號的發(fā)射范圍重疊，則可能尤其如此。在某些實施方案中，通過計數(shù)各個可編碼標記，可使測定不同標記總和信號強度的類似物檢測中不時產生的錯誤減至最小。
在某些實施方案中，″可編碼標記″是特異性針對不同靶特異性探針(不同靶序列特異性的不同探針)的不同量子點組合，不同量子點組合彼此可不同檢測。
可編碼標記可能直接連接于探針，或間接連接于另一分子，然后再連接于探針。在某些實施方案中，可編碼標記可能在加入樣品中之前連接于探針，或可能在形成可檢測復合物的反應過程中連接于探針。在某些實施方案中，可編碼標記可能直接連接于探針，或通過連接分子例如化學連接基團、或連接對例如鏈親和素-生物素對。
在某些實施方案中，將標記摻入小珠中，然后連接于探針?！逍≈椤迨侵柑结樋梢赃B接其上的任何物質。小珠可能是任何形狀，包括但不限于球狀、桿狀、管狀和棒狀。小珠可能由任何物質組成，包括但不限于硅玻璃和聚合物。小珠可能是任意大小。小珠的某些非限制性實例包括以下所述，例如美國專利4,499,052(Fulwyler)；4,717,655(Fulwyler)；3,957,741(Rembaum，CalTech)；4,035,316(Rembaum，CalTech)；4,105,598(Rembaum，CalTech)；4,224,198(Rembaum，CalTech)；4,326,008(Rembaum，CalTech)；3,853,987(Dreyer，CalTech)；4,108,972(Dreyer，CalTech)；5,093,234(Flow CytometryStandards)；6,268,222(Luminex)；5,326,692(Molecular Probes)；5,573,909(Molecular Probes)；5,723,218(Molecular Probes)；5,786,219(Molecular Probes)；5,028,545(Soini)和5,132,242(SauCheung)；以及國際申請公開WO 01/13119(Luminex)；WO 01/14589(Luminex)；WO 97/14028(Luminex)；WO 99/19515(Luminex)；WO99/37814(Luminex)；WO 99/52708(Luminex)；WO 00/55363(Amersham)；WO 01/01141(Amersham)；WO 99/64867(Amersham)和WO 94/11735(Soini)。
在某些實施方案中，小珠包含包被或未包被的顆粒，該顆粒包含至少一種磁性物質、順磁物質、硅玻璃、聚丙烯酰胺、多糖、塑料、乳膠、聚苯乙烯及其它聚合物質。
小珠可能包含可編碼標記，例如某些實施方案的量子點組合。本領域技術人員了解獲得具有量子點小珠的合適方法。參見例如Han等人，Nature Biotechnology，19631-635(2001)以及美國專利6,207,392(Shuming Nie)；6,114,038(Biocrystal)；6,261,779(Biocrystal)；6,207,229(Bawendi)；6,251,303(Bawendi)；6,274,323(Quantum Dot)；5,990,479(Alivisatos)；6,207,392(Alivisatos)；國際申請公開WO00/29617(Shuming Nie)；WO 00/27365(Biocrystal)；WO 00/28089(Biocrystal)；WO 01/89585(Biocrystal)；WO 00/17642(Bawendi)；WO00/17656(Bawendd)；WO 99/26299(Bawendi)；WO 00/68692(Quantum Dot)；WO 00/55631(Alivisatos)；以及歐洲申請0 990 903Al(Bawendi)。小珠中可能包埋量子點或其它標記。
在某些實施方案中，一個非限制性實例是，可能將量子點摻入交聯(lián)的聚合物小珠中。在某些實施方案中，可能于70℃使用苯乙烯(98％v/v)、二乙烯苯(1％v/v)和丙烯酸(1％v/v)乳劑合成聚苯乙烯小珠。在某些實施方案中，然后在包含5％(v/v)氯仿和95％(v/v)丙醇或丁醇的溶劑混合物中溶脹小珠。在某些實施方案中，在混合物中加入控制量的ZnS-包封(capped)的CdSe量子點。室溫溫育后完成包埋過程。在某些實施方案中，小珠的大小可由合成中所用穩(wěn)定劑(例如聚乙烯吡咯酮)的數(shù)量來控制。在某些實施方案中，包含直徑2-4nm量子點的直徑2μm的球狀小珠可能包含數(shù)萬量子點。
制備上述小珠的方法可能產生數(shù)目不定的量子點的小珠。另外，如果使用一種以上顏色的量子點，則可能獲得數(shù)目不定的不同顏色的小珠。在某些實施方案中，這樣制備小珠之后，將所得小珠按照指定小珠中每種顏色量子點的相對數(shù)目進行分選，獲得各組具有不同可編碼標記的相同標記小珠。在某些實施方案中，可以通過儀器自動分選，例如熒光聯(lián)合細胞分析儀(FAGS)或可以區(qū)分不同可編碼標記的其它流式細胞儀類型檢測方法。
技術人員應當理解，很多方法可以獲得包含探針的小珠。這類方法包括但不限于，使用共價鍵、UV交聯(lián)以及通過親和組合連接，將探針連接于小珠。一個非限制性實例是，鏈親和素分子可能共價連接于小珠表面的羧酸基團。寡核苷酸探針可能生物素化，然后通過親和素分子連接小珠。
在某些實施方案中，小珠包含內參標記。在某些實施方案中，內參標記與可編碼標記可檢測的不同。在某些實施方案中，可能使用內參標記確證帶有可編碼標記的小珠數(shù)目。例如，在某些實施方案中，帶有不同可編碼標記的小珠將各自包括相同的內參標記，可用于鑒定單一小珠的存在。在某些實施方案中，為將帶有可編碼標記的單一第一種小珠從帶有可編碼標記的兩種小珠中區(qū)分開(其聯(lián)合強度類似于第一種小珠的可編碼標記強度)，每一小珠可能包括單一的內參標記。在某些實施方案中，檢測到兩種內參標記應該表示存在兩種小珠，而檢測到單一內參標記應該表示存在單一小珠。因此，在某些實施方案中，內參比較有助于準確測定實際存在的小珠數(shù)目，只檢測可編碼標記則可能提供不明確結果。
例如，在小珠包含含有熒光團、染料或納晶的編碼元素的某些實施方案中，每一小珠中的內參標記可能是單一量子點。存在單一量子點可能用于表示存在單一小珠。存在兩種量子點應該表示存在兩種小珠，依此類推。
在某些實施方案中，另一非限制性實例是，內參標記可能提供可檢測的不同于可編碼標記信號的顏色信號。在某些實施方案中，每一小珠內參標記的信號強度可以用于鑒定單一小珠的存在。例如，在某些實施方案中，每一小珠的內參信號將提供強度約1個單位的紅色信號。在某些這類實施方案中，可能利用兩種不同小珠上的兩種不同可編碼標記來檢測兩種不同靶物質。例如，在某些實施方案中，針對第一種靶物質的第一種可編碼標記提供強度為1個單位的綠色信號，針對第二種靶物質的第二種可編碼標記提供強度為2個單位的綠色信號。若無內參標記，在某些實施方案中，可能難以確定強度為2個單位的綠色信號是表示存在針對第一種靶物質的兩個小珠，還是存在針對第二種靶物質的一個小珠。在利用紅色內參標記的某些實施方案中，檢測到強度為1個單位的紅色信號應表示存在針對第二種靶物質的一個小珠，而檢測到強度為2個單位的紅色信號應表示存在針對第一種靶物質的兩個小珠。
利用不同大小的小珠時，摻入該小珠中的標記，例如以熒光染料為非限制性實例，其數(shù)量可能因小珠大小而變化。在某些實施方案中，在小珠中包含內參標記，可能用于標準化由小珠大小的變化所致可編碼標記信號的變化。
在未利用內參標記的某些實施方案中，嘗試使用大小相當一致的小珠，以試圖避免因小珠大小差異所致相同可編碼標記的信號差異。在某些實施方案中，小珠上的內參標記可能允許人們使用不同大小的小珠。在某些這類實施方案中，可能利用兩種不同小珠上的兩種不同可編碼標記來檢測兩種不同靶物質。例如，如果小珠直徑為X，針對第一種靶物質的第一種可編碼標記提供強度為1個單位的綠色信號，針對第二種靶物質的第二種可編碼標記提供強度為2個單位的綠色信號。若無內參標記，在利用不同大小小珠的某些實施方案中，可能難以確定提供強度為2個單位綠色信號的小珠是表示存在直徑大于X的針對第一種靶物質的小珠，還是存在直徑為X的第二種靶物質的小珠。
在某些實施方案中，可能利用包括內參標記的小珠，該內參標記可檢測地不同于可編碼標記。在某些實施方案中，可能利用如果小珠直徑為X則提供強度為1個單位紅色信號的內參標記。因此，如果小珠大小不同于直徑X，該內參標記將提供不同于1個單位的強度。在某些這類實施方案中，檢測到2個單位綠色信號的小珠，若紅色信號為1個單位，則表示存在第二種靶物質，若紅色信號為2個單位，則表示存在第一種靶物質。
在某些實施方案中，使用內參標記可能允許產生比不使用內參時可用的小珠更小的小珠。在某些實施方案中，小珠可能直徑小于2μm。在某些實施方案中，使用內參標記也許能區(qū)分小珠大小的極小差別。
在某些實施方案中，通過分級分離(staging)或流式細胞術計數(shù)小珠時，可以使用內參標記。在某些實施方案中，可能在陣列中使用利用內參標記的小珠，其中分析物結合到陣列的特定區(qū)域。在某些實施方案中，可能使帶有內參標記小珠的陣列成像。在某些實施方案中，利用軟件標準化使用內參標記的數(shù)字化圖像中的信號。
在某些實施方案中，可能使用小珠的大小作為編碼元素。一個非限制性實例是，小珠具有利用兩種顏色的100個不同編碼。在某些實施方案中，由于不同大小的小珠提供不同的強度，可能使用不同大小的小珠作為部分編碼。例如，在某些實施方案中，使用兩種顏色的100個編碼可能通過使用4種不同大小的小珠而增加到400個編碼。
可檢測復合物本發(fā)明術語″可檢測復合物″是包含可編碼標記的復合物。在某些實施方案中，可檢測復合物另外包含至少一種探針。
根據(jù)某些實施方案，存在靶物質時產生可檢測復合物，不存在靶物質時則不產生。在某些實施方案中，如果靶物質和探針彼此特異性結合，則形成可檢測復合物。
在某些實施方案中，可檢測復合物在連接反應中產生。連接方法包括但不限于酶學及化學連接。
本發(fā)明的連接反應包含任何酶學或化學過程，其中在相鄰雜交到模板的核酸序列的相對末端之間形成核苷酸間連接。另外，退火核酸序列的相對末端一般適于連接(連接的適合性取決于所用連接方法)。核苷酸間連接可能包括但不限于磷酸二酯鍵形成。該鍵的形成可能包括但不限于由DNA或RNA連接酶酶促產生，例如噬菌體T4 DNA連接酶、T4 RNA連接酶、Thermus thermophilus(Tth)連接酶、嗜熱水生菌(Thermus aquaticus，Taq)連接酶或火球菌(Pyrococcus furiosus，Pfu)連接酶。其它核苷酸間連接包括但不限于合適反應基團間形成共價鍵，例如α-鹵酰基與硫代磷酸基團之間形成硫化磷酰乙酰氨基、硫代磷酸甲苯磺酸或碘化物基團形成5′-磷酸硫酯和焦磷酸酯連接。
化學連接劑包括但不限于活化劑、凝聚劑和還原劑，例如碳二亞胺、溴化氰(BrCN)、N-氰基咪唑、咪唑、1-甲基咪唑/碳二亞胺/胱胺、二硫蘇糖醇(DTT)和紫外線。自連，即缺少連接劑的自發(fā)連接，也在本發(fā)明范圍之內?；瘜W連接方法的詳細方案以及合適反應性基團的說明參見Xu等人，Nucleic Acid Res.，27875-81(1999)；Gryaznov和Letsinger，Nucleic Acid Res.211403-08(1993)；Gryaznov等人，Nucleic Acid Res.222366-69(1994)；Kanaya和Yanagawa，Biochemistry 257423-30(1986)；Luebke和Dervan，Nucleic Acids Res.203005-09(1992)；Sievers和von Kiedrowski，Nature 369221-24(1994)；Liu和Taylor，Nucleic Acids Res.263300-04(1999)；Wang和Kool，Nucleic Acids Res.222326-33(1994)；Purmal等人，NucleicAcids Res.203713-19(1992)；Ashley和Kushlan，Biochemistry302927-33(1991)；Chu和Orgel，Nucleic Acids Res.163671-91(1988)；Sokolova等人，F(xiàn)EBS Letters 232153-55(1988)；Naylor和Gilham，Biochemistry 52722-28(1966)以及美國專利5,476,930。
在某些實施方案中，可能利用至少一個循環(huán)的以下連續(xù)過程適于連接的第一種和第二種靶特異性探針的序列特異性部分與其各自互補的靶區(qū)域雜交；第一種靶特異性探針的3′端與第二種靶特異性探針的5′端連接，形成連接產物；核酸雙鏈變性，將連接產物與靶序列分離。該循環(huán)可能重復或不重復。例如而非限制，通過熱循環(huán)該連接反應來線性增加連接產物量。
連接技術也在本發(fā)明范圍之內，例如間隙填補連接(gap-fillingligation)，包括但不限于間隙填補OLA和LCR、橋接寡核苷酸連接以及校正連接。這些技術的說明特別見美國專利5,185,243、公開的歐洲專利申請EP 320308和EP 439182以及公開的PCT專利申請WO90/01069。
可檢測復合物也可能通過核酸雜交產生，而不經任何連接步驟。在某些實施方案中，與PNA、LNA或其它合成核酸進行雜交，Tm高于自然發(fā)生的核酸雜交。
還可能通過抗體-抗原相互作用、適體-蛋白質相互作用及其它特定結合對的作用(例如鏈親和素-生物素反應)而產生其它可檢測復合物。
通過引物延伸反應也可能產生可檢測復合物。引物延伸反應包括但不限于單堿基延伸(SBE)反應、測序反應(例如Sanger雙脫氧測序反應)以及包括聚合酶的其它反應。
在某些實施方案中，在配基-受體反應中產生可檢測復合物。一個非限制性實例是，可編碼標記和探針可能連接配基分子。受體連接至分離成分，例如磁珠。
在某些實施方案中，當存在靶核酸時，探針與靶核酸序列雜交，結合到單個核苷酸的可編碼標記通過聚合酶反應連上探針。
在某些實施方案中，將包含與核酸靶序列互補核酸的探針連至分離成分，例如磁珠。在某些實施方案中，然后將探針加入包含核酸靶序列的樣品中。在某些實施方案中，將連至核苷酸的可編碼標記加入含有聚合酶的樣品中。在某些實施方案中，如果樣品中存在核酸靶序列，則探針與靶序列雜交，聚合酶將連有可編碼標記的核苷酸加到寡核苷酸探針上，形成可檢測復合物。在某些實施方案中，與樣品核酸變性之后，再使用磁珠將探針與樣品分離。在某些實施方案中，如果計數(shù)到可檢測復合物，則樣品中存在靶序列。
在某些實施方案中，將從樣品中去除的可檢測復合物數(shù)目相比檢測反應開始時存在的可檢測復合物數(shù)目，代表樣品中的靶物質數(shù)目。在某些實施方案中，在樣品中加入大量可檢測復合物。在某些實施方案中，這些可檢測復合物包含連在單鏈核酸探針一端的可編碼標記，以及連在單鏈核酸探針另一端的分離成分。在某些實施方案中，樣品中存在靶物質時，靶物質與單鏈探針雜交，形成雙鏈分子。在某些實施方案中，反應中加入可切割雙鏈核酸的核酸內切酶。在某些實施方案中，剩余的可檢測復合物的數(shù)目等于最初加入反應中的可檢測復合物數(shù)目減去樣品中存在的靶物質數(shù)目。
分離成分和方法術語″分離成分″是指任何成分，若包含在可檢測復合物中，則可能用于將該可檢測復合物與樣品中至少一種其它成分相分離。
在某些實施方案中，在可檢測復合物中不摻入任何特定分離成分而完成分離。在某些實施方案中，不利用特定分離成分的方法包括但不限于根據(jù)密度、大小、電或離子電荷、擴散、加熱、流式細胞術和直接光照而分離。在某些實施方案中，無需可檢測復合物與其它成分經任何分離而檢測可檢測復合物。
在某些實施方案中，該方法包含在定量、或檢測是否存在一種或多種靶物質之前，將可檢測復合物與未處于可檢測復合物中的分離成分相分離。一般技術人員應當理解，可能根據(jù)某些實施方案使用若干方法將可檢測復合物與未處于可檢測復合物中的分離成分相分離。某些實施方案的非限制性實例是，可能利用分離成分的密度或大小差異，將可檢測復合物與未處于可檢測復合物中的分離成分相分離。分離方法包括但不限于使用篩分濾膜、篩分柱、密度梯度、通過重力分離以及通過離心分離。該大小分離成分的實例包括但不限于聚合物小珠。
例如，在某些實施方案中，可能如下將可檢測復合物與未處于可檢測復合物中的分離成分相分離。探針組合可能包括包含第一種探針的分離小珠以及包含第二種探針的檢測小珠。分離小珠另外包含第一種可編碼標記，檢測小珠另外包含第二種可編碼標記。分離小珠比檢測小珠小。連接后，可以根據(jù)可檢測復合物中的檢測小珠與未處于可檢測復合物中的分離小珠的大小差異，將可檢測復合物與分離小珠相分離。例如，可能將物質通過允許分離小珠流過而保留可檢測復合物的篩分濾膜。
在某些實施方案中，也可能如下將可檢測復合物與未處于可檢測復合物中的分離成分相分離。探針組合可能包括包含第一種探針的分離小珠以及包含第二種探針的檢測小珠。分離小珠另外包含第一種可編碼標記，檢測小珠另外包含第二種可編碼標記。分離小珠的密度比檢測小珠高。形成可檢測復合物以后，可以根據(jù)可檢測復合物中的檢測小珠與游離的分離小珠的密度差異，將可檢測復合物與未處于可檢測復合物中的分離小珠相分離。例如，在某些實施方案中，可能將物質置于密度梯度中，將可檢測復合物與游離的分離小珠相分離。在某些實施方案中，也可能利用重力將可檢測復合物與游離的分離小珠相分離。因此，如果分離小珠的密度比檢測小珠高，分離小珠將沉降在可檢測復合物之下。
根據(jù)某些實施方案，可能利用探針組合中探針的不同性質，將可檢測復合物與未處于可檢測復合物中的探針和可編碼標記相分離。例如，在某些實施方案中，可能使用具有特定性質的分離成分，將其吸引到特定位置，而反應混合物中的其它成分缺少這種性質。例如，根據(jù)某些實施方案，該分離成分可能包含磁性顆粒，而反應混合物中的其它成分不包含磁性顆粒。
術語″磁性顆粒″是指可以使用磁力移動的物質。這包括但不限于磁化的顆粒、未磁化但受磁場影響的顆粒(例如膠體鐵、氧化鐵(例如鐵氧體和磁石)、鎳以及鎳-鐵合金)以及可以變成磁化的顆粒(例如鐵氧體、磁石、鐵、鎳及其合金)。
在某些實施方案中，磁性顆粒包含一種或多種鐵氧體、磁石、鎳和鐵，而反應混合物中的其它成分不包含這種物質。在這類實施方案中，可以使用該分離成分的這種獨特性質將包括分離小珠的可檢測復合物與未處于可檢測復合物中的探針和可編碼標記相分離。
將可檢測復合物與其它成分分離的方法包括但不限于利用密度分離、利用電荷分離、利用阻尼系數(shù)(例如電泳遷移率)分離、利用擴散或透析分離、利用加熱或光線分離(例如利用激光去除標記的顆粒)。
在某些實施方案中，可能在定量樣品中一種或多種靶核酸序列之前，從包含可檢測復合物的組合物中去除未處于可檢測復合物中的分離成分、可編碼標記或探針(游離組分)。在某些實施方案中，可能在定量(或檢測是否存在)樣品中一種或多種靶核酸序列之前，從包含游離組分的組合物中去除可檢測復合物。
在某些實施方案中，分離可檢測復合物與游離組分包含從靶核酸序列中分離可檢測復合物，以及從樣品中分離可檢測復合物。
在某些實施方案中，可檢測復合物是連接產物。在某些實施方案中，從靶序列中分離可檢測復合物包含熱變性。
一個非限制性實例是，在某些實施方案中，可能如下檢測樣品例如細胞裂解物中是否存在不同的靶核酸序列。將樣品與特異性針對每種不同靶核酸序列的不同探針組合混合。每一探針組合包含含有摻入小珠中的磁性顆粒的分離小珠以及第一種靶特異性探針，并包含含有小珠以及第二種靶特異性探針的檢測小珠。探針組合中的分離小珠比檢測小珠的密度高。
每一探針組合的分離小珠另外包含特異性針對第一種靶特異性探針的第一種可編碼標記，每一小珠組合的檢測小珠另外包含特異性針對第二種靶特異性探針的第二種可編碼標記。第一種可編碼標記可檢測地不同于第二種可編碼標記。在互補靶序列上彼此相鄰雜交時，每一小珠組合中的靶特異性探針適合于連在一起。
當樣品包含與指定探針組合中第一種和第二種靶特異性探針互補的靶核酸序列時，探針退火并在連接酶(L)存在下相連，形成包含分離小珠和檢測小珠的可檢測復合物(參見例如圖7)。連接以后，靶核酸序列與可檢測復合物熱變性。
在圖8和圖9描述的某些實施方案中，然后使樣品經受密度梯度，使可檢測復合物和檢測小珠在容器中位于分離小珠之上。然后可能利用磁源將可檢測復合物與未連接的檢測小珠分離(參見圖8)。例如，可以使用磁源從包含未連接檢測小珠的樣品中去除可檢測復合物，并將可檢測復合物置于不包含任何未連接小珠的分離容器中(參見圖8和9)。然后可以通過計數(shù)可編碼標記的獨特組合，來檢測是否存在可檢測復合物。
在某些實施方案中，可能使用接近容器底部的第二種磁體，吸引并保留高密度的未連接分離小珠，而不吸引或保留低密度的可檢測復合物和未連接檢測小珠(參見圖8)。然而，這一接近容器底部的第二種磁體并非必需。例如，在某些實施方案中，可以設計小珠的密度，使任何未連接的分離小珠和可檢測復合物之間的分離距離可以將可檢測復合物吸引到磁性裝置，而不可以將未連接分離小珠吸引到該磁性裝置。
在圖10和11所述的某些實施方案中，連接后將樣品加熱，變性雜交的探針和靶核酸序列。未連接的分離小珠因重力而沉降在可檢測復合物和未連接的檢測小珠之下(參見圖10)。然后可能將電磁體(磁體)放在接近容器底部，使其吸引和保留較高密度的未連接的分離小珠，而不吸引或保留較低密度的可檢測復合物和未連接的檢測小珠(參見圖11)。也可能將電磁體(磁體)放在容器頂部，使其吸引和保留可檢測復合物(參見圖11)。
然后提起保留可檢測復合物的電磁體，將可檢測復合物與未連接的檢測小珠分離(參見圖11和12)。然后可以通過計數(shù)獨特組合的可編碼標記來檢測是否存在可檢測復合物，而無需從包括未連接的小珠的樣品中移出(見圖12)。圖12描述了照射可檢測復合物，識別編碼，并利用PMT傳感器計數(shù)連接產物的某些實施方案。
在圖18描述的某些實施方案中，形成可檢測復合物，其包含含有第一種可編碼標記的磁性小珠以及含有第二種可編碼標記的非磁性小珠。在某些實施方案中，將電磁體(磁體)置于包含小珠和可檢測復合物的反應容器之下。開啟電磁體，將可檢測復合物和未處于可檢測復合物中的磁性小珠吸引到容器底部。參見圖18C。
在某些實施方案中，利用包含輸入管和輸出管的連續(xù)流系統(tǒng)，去除未處于可檢測復合物中的非磁性小珠及其它非磁性成分。參見圖18D。在某些實施方案中，然后關閉電磁體，利用流式細胞儀小管取出可檢測復合物和未處于可檢測復合物中的磁性小珠。參見圖18E。
在某些實施方案中，然后將可檢測復合物和未處于可檢測復合物中的磁性小珠送樣到流式細胞儀，只計數(shù)第一種和第二種可編碼標記的組合物。參見圖18F。在這類實施方案中，未處于可檢測復合物中的磁性小珠只包括第一種可編碼標記，將不被計數(shù)。
在某些實施方案中，可能利用不包括可編碼標記的磁性小珠進行上述圖18的方法。分離未處于可檢測復合物中的非磁性小珠以后，將可檢測復合物和未處于可檢測復合物中的磁性小珠送樣流式細胞儀。在這類實施方案中，由于磁性小珠不具有可編碼標記，只計數(shù)可檢測復合物中非磁性小珠的可編碼標記。
在圖19所述某些實施方案中，形成包含磁性小珠、非磁性小珠和可編碼標記的可檢測復合物。在某些實施方案中，將第一種電磁體置于包含小珠和可檢測復合物的反應容器之下。開啟第一種電磁體，將可檢測復合物和未處于可檢測復合物中的磁性小珠吸引到容器底部。參見圖19C。
在某些實施方案中，利用包含輸入管和輸出管的連續(xù)流系統(tǒng)，去除未處于可檢測復合物中的非磁性小珠及其它非磁性成分。參見圖19D。在某些實施方案中，使用可翻轉的容器，這樣在翻轉時不致流出大量液體。在某些實施方案中，這可能通過使用小容器而實現(xiàn)，當容器翻轉時，其表面張力抑制液體流出容器。在利用可翻轉容器的實施方案中，然后將容器和第一種電磁體翻轉，并關閉第一種電磁體。然后開啟位于翻轉容器底部的第二種電磁體，吸引可檢測復合物和未處于可檢測復合物中的磁性小珠。參見圖19F。在某些實施方案中，可檢測復合物比未處于可檢測復合物中的磁性小珠的阻尼大而密度小。因此，在這類實施方案中，未處于可檢測復合物中的磁性小珠向第二種電磁體移動比可檢測復合物更快。當未處于可檢測復合物中的磁性小珠集中到第二種電磁體時(參見圖19E)，在可檢測復合物到達第二種電磁體之前，將容器翻轉回來。
在某些實施方案中，然后利用流式細胞儀小管將可檢測復合物取出(參見圖19F)，送樣流式細胞儀，計數(shù)可檢測復合物的可編碼標記。
在某些實施方案中，可能利用不包括可編碼標記的磁性小珠進行上述圖19的方法。在某些實施方案中，可能利用不包括可編碼標記的非磁性小珠進行上述圖19的方法。
在圖20所述某些實施方案中，形成包含磁性小珠、非磁性小珠和可編碼標記的可檢測復合物。容器內包含濾膜。在某些實施方案中，設計磁性小珠可穿過濾膜，而非磁性小珠不能穿過濾膜。在某些實施方案中，將電磁體置于包含小珠和可檢測復合物的反應容器之下。開啟第一種電磁體，將可檢測復合物和未處于可檢測復合物中的磁性小珠吸引到容器底部。參見圖20C。
未處于可檢測復合物中的磁性小珠朝向磁體穿過濾膜?？蓹z測復合物被吸向磁體，但由于復合物的非磁性小珠而不能穿過濾膜。通過磁體的吸引，將可檢測復合物保留在濾膜上。在某些實施方案中，然后利用包含輸入管和輸出管的連續(xù)流系統(tǒng)，去除未處于可檢測復合物中的非磁性小珠及其它非磁性成分。參見圖20D。在某些實施方案中，然后將濾膜從電磁鐵移開，分離可檢測復合物與未處于可檢測復合物中的磁性小珠。這樣移開濾膜使可檢測復合物離開電磁鐵，離開未處于可檢測復合物中的磁性小珠。
在某些實施方案中，然后利用流式細胞儀小管取出可檢測復合物。參見圖20E。在某些實施方案中，然后將可檢測復合物送樣到流式細胞儀，計數(shù)可檢測復合物的可編碼標記。參見圖20F。
在某些實施方案中，可能利用不包括可編碼標記的磁性小珠進行上述圖20的方法。在某些實施方案中，可能利用不包括可編碼標記的非磁性小珠進行上述圖20的方法。
在某些實施方案中，可能按便于檢測標記組合存在與否的方式，使用容器中的凹槽，幫助排列可檢測復合物。在某些實施方案中，″排列的連接產物″是產物的分離小珠比檢測小珠離容器的指定表面更近的產物。例如，在圖13所述某些實施方案中，分離小珠比檢測小珠更小。設計凹槽，使分離小珠適合凹槽，而分離小珠太大，不適合凹槽(參見圖13)。在某些實施方案中，可能將磁源放在靠近容器的凹槽處，以吸引并保留分離小珠在凹槽中。然后可以計數(shù)可編碼標記的組合，以檢測可檢測復合物存在與否。在圖13所示某些實施方案中，凹槽決定可檢測復合物的位置，以使成角度的激發(fā)光束照射到帶有幾個讀數(shù)的兩種小珠。
在某些實施方案中，也可能使用電泳通過電荷或荷質比分離該分離成分。在某些實施方案中，帶電荷的分離成分也可能通過離子交換例如使用離子交換柱或基于電荷的層析進行分離。
在某些實施方案中，分離成分也可能是親和組合的一員。親和組合是彼此特異性結合的一組分子。典型的親和組合包括但不限于鏈親和素/生物素對，互補核酸、抗體-抗原對以及得自ProlinxTM(Bothell，WA)的親和結合化學劑，例如美國專利5,831,046；5,852,178；5,859,210；5,872,224；5,877,297；6,008,406；6,013,783；6,031,17和6,075,126所例示。
在某些實施方案中，分離成分因其遷移率而分離。在某些實施方案中，因遷移率而分離根據(jù)分離成分的大小進行。在某些實施方案中，可能在電泳中利用遷移率調節(jié)劑。典型的遷移率調節(jié)劑及其使用方法描述于例如美國專利5,470,705；5,580,732；5,624,800；和5,989,871。在某些實施方案中，通過改變可編碼標記的遷移率，可能將與靶物質存在有關的信號以及與靶物質存在無關的標記信號區(qū)分開。
在某些實施方案中，可能使用兩種或多種不同的分離成分或方法。一個非限制性實例是，在某些實施方案中，可檢測復合物可能包含磁性小珠、連接產物以及生物素包被的小珠。參見例如圖21A部分。將鏈親和素包被的電磁體放在樣品中，并開啟。參見例如圖21B部分?？蓹z測復合物和未處于可檢測復合物中的磁性小珠被吸引到電磁體。處于可檢測復合物中的生物素包被的小珠與電磁體上的親和素結合。參見例如圖21C部分。然后關閉電磁體，未處于可檢測復合物中的磁性小珠從電磁體上脫落，而可檢測復合物仍與電磁體結合。在某些實施方案中，然后從含有結合可檢測復合物的電磁體的樣品中取出電磁體，利用照相機或掃描儀檢測處于可檢測復合物中的可編碼標記。參見例如圖21D部分。
在某些實施方案中，靶物質的存在阻礙而非促進可檢測復合物的形成。在某些實施方案中，探針和/或可編碼標記的數(shù)目有限。在某些實施方案中，計數(shù)可檢測復合物提供了與靶物質無關的可編碼標記的數(shù)目。從在完全缺少靶物質的情況下預期的可檢測復合物的總數(shù)中減去所計數(shù)的可檢測復合物數(shù)目，便提供了樣品中存在的靶物質數(shù)目。
管中管分離可檢測復合物在圖28所述某些實施方案中，形成包含含有可編碼標記的小珠以及分離成分例如生物素分子的可檢測復合物。在某些實施方案中，形成可檢測復合物的過程中可能包括連接反應。在某些實施方案中，形成可檢測復合物的過程中可能包括抗體-肽反應。在某些實施方案中，可能利用生物素之外的分離成分。
在圖28所述實施方案中，利用探針組合，其中包括帶有包含可編碼標記的第一種探針以及連接生物素的第二種探針。在圖28A中，如果存在靶物質，則進行連接，形成可檢測復合物。在圖28(B)所示某些實施方案中，加入鏈親和素包被的磁性小珠。鏈親和素包被的磁性小珠結合可檢測復合物中的生物素分子。在某些實施方案中，包含可編碼標記、未連接生物素分子的小珠不結合鏈親和素包被的小珠。在某些實施方案中，圖28所示過程可能通過使用不包括連接的過程而修改，形成可檢測復合物，其中包含含有可編碼標記和生物素的小珠。
如圖28(C)所述的某些實施方案所示，提供第一只管，其放在較大的第二只管中。在某些實施方案中，兩個管部分填滿緩沖液，緩沖液的密度大于包含可編碼標記的小珠。在某些實施方案中，第二只管部分填滿緩沖液，將第二只管放在外管中，使第一只和第二只管中的緩沖液高度達到平衡。
在某些實施方案中，連接反應之后，將至少部分樣品放在第一只管中高密度緩沖液的頂部，使小珠漂浮在緩沖液中。在圖28(D)所述某些實施方案中，然后在第二只管的底部施加磁體，使未結合的包被鏈親和素的磁性小珠和可檢測復合物被吸引到第二只管底部的磁體。包含未處于可檢測復合物中的可編碼標記的小珠仍漂浮于或朝向第一只管中高密度緩沖液的頂部。在圖28(E)所述某些實施方案中，第一只管的頂部充分密封，將第一只管提到第二只管中緩沖液的上方。至此，包含未處于可檢測復合物中的可編碼標記的小珠與包含可檢測復合物的緩沖液相分離。在某些實施方案中，第一只管防止小珠粘附到第二只管的管壁上。
在某些實施方案中，然后可能取出第二只管中的可檢測復合物進行計數(shù)。在某些實施方案中，將可檢測復合物上樣流式細胞儀。在某些實施方案中，取出第二只管底部帶有可檢測復合物的磁體，檢測磁體上的可編碼標記。
檢測方法在某些實施方案中，本發(fā)明提供了可編碼標記的檢測。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了標記的計數(shù)。預見了幾種標記檢測和/或計數(shù)的方法，本領域技術人員應當理解，可以利用多種方法檢測和/或計數(shù)本發(fā)明的可編碼標記。
如上所述，計數(shù)可編碼標記是指實際計數(shù)各個標記。在某些實施方案中，如果在同一過程中利用多種可不同檢測的標記，則檢測和/或計數(shù)另外包括鑒定標記的編碼。
在某些實施方案中，利用一種流式細胞術檢測可編碼標記，例如熒光結合細胞分選儀(FACS)、LuminexTM檢測裝置，或為檢測單個可編碼標記分子而發(fā)展的類似技術。在某些實施方案中，可編碼標記通過電泳分離，并在其電泳遷移期間或之后檢測。電泳包括但不限于毛細管電泳和電場電泳。在某些實施方案中，該方法包括激發(fā)可編碼標記的裝置(例如一個非限制性例子，激光)以及計數(shù)可編碼標記的掃描裝置。在圖9所示某些實施方案中，將可檢測復合物釋放到檢測容器中，由PMT傳感器讀取居于容器底部的可檢測復合物。在某些實施方案中，PMT傳感器是帶有10個500kHz數(shù)字儀的6單元PMT裝置，在10分鐘內掃描10×106小珠。
在某些實施方案中，其它檢測方法包括靜態(tài)檢測方法。在某些實施方案中，該檢測方法包括將可編碼標記或復合物置于平板(非限制性實例)，利用一種或多種激發(fā)源(例如激光或不同波長)激發(fā)可編碼標記，使掃描裝置通過平板，以便計數(shù)可編碼標記。在某些實施方案中，將平板在掃描裝置的檢測場中來回移動。在某些實施方案中，將可編碼標記連接于平板或玻片。在某些實施方案中，照相機可以對整個場成像，將圖像掃描，以便計數(shù)可編碼標記。
根據(jù)某些實施方案，可能在樣品中檢測多種靶物質，并使用不同的可編碼標記進行區(qū)分。在某些實施方案中，可編碼標記可以使用兩種或多種標記編碼(例如在某些實施方案中，使用量子點、熒光團或染料)。在某些實施方案中，可能使用多種波長或顏色的標記，增加了可能的不同可編碼標記的數(shù)目。例如，如果給予指定的可編碼標記一個二元編碼，則可以檢測是否存在特定顏色的標記(″1″或″0″-故為二元編碼)。如果只使用二元色，則有兩個編碼，一個帶有標記，一個沒有標記。如果使用兩種二元色(例如紅色和藍色)，則可能有4個編碼-(1)紅色，(2)藍色，(3)紅色和藍色，(4)無色(參見例如圖3)。每一附加的顏色增加兩個可能的編碼數(shù)目。因此，如果使用10種顏色，則可能有1,024個二元編碼。
在某些實施方案中，將可編碼標記摻入或連接到小珠。在某些實施方案中，可編碼標記可能直接連接到探針，而不摻入小珠中。
也可能使用強度作為區(qū)分可編碼標記的因素。在某些實施方案中，使用包括相同數(shù)目的單波長標記的可編碼標記，但具有不同探針的不同可編碼標記具有不同強度水平的標記，可能實現(xiàn)強度變化。在某些實施方案中，使用包括相同數(shù)目的單發(fā)射光譜標記的可編碼標記，但具有不同探針的不同可編碼標記具有不同強度水平的標記，可能實現(xiàn)強度變化。在某些實施方案中，通過改變連接不同探針的不同可編碼標記中相同波長標記的數(shù)目，可能實現(xiàn)強度變化。在某些實施方案中，通過改變連接不同探針的不同可編碼標記中相同發(fā)射光譜標記的數(shù)目，可能實現(xiàn)強度變化。例如，在某些實施方案中，可以在不同可編碼標記中使用相同波長的標記，并在每一不同組合中使用不同標記數(shù)目區(qū)分可編碼標記。例如，如果給予可編碼標記三元編碼(每一標記顏色3個強度水平)，則一個顏色標記提供3個可能的編碼-(1)無標記，(2)一個標記，(3)兩個標記。如果使用兩種顏色，則可能有9個三元編碼(參見圖3中非限制性實例)。6種顏色將提供729個三元編碼。
另外，將可編碼標記連接到探針組合的兩種探針時(例如通過摻入小珠中)，可能的編碼數(shù)目進一步增加(參見圖4中非限制性實例)。例如，在二元編碼中使用兩種顏色，可能有16種不同的探針組合(4×4)。在三元編碼中使用兩種顏色，可能有81種不同的探針組合(9×9)。在二元編碼中使用10種顏色，可能有1百萬種不同的探針組合(1,024×1,024)。在三元編碼中使用6種顏色，可能有500,000種以上不同的探針組合(729×729)。
此外，在某些實施方案中，標記例如量子點傳遞信號特別有效，因而可以檢測可編碼標記。在某些這類實施方案中，可能使用可編碼標記檢測樣品中極少量的分子，而無需靶序列擴增。
在某些實施方案中，探針組合包含含有分離成分、第一種探針和第一種可編碼標記的分離小珠，并包含含有第二種探針和第二種可編碼標記的檢測小珠。在某些這類實施方案中，第一種可編碼標記具有第一種探針特異性的強度水平。在某些這類實施方案中，第二種可編碼標記具有第二種探針特異性的強度水平。在某些實施方案中，探針組合的小珠包含相同波長的標記，但第一種可編碼標記具有第一種探針特異性的強度水平，第二種可編碼標記具有第二種探針特異性的強度水平。
在某些實施方案中，可編碼標記包含至少1,000個標記，其中該標記具有預定的波長組合，使每一可編碼標記可與其它可編碼標記相區(qū)分。
在某些實施方案中，可編碼標記可能包含2-1,000以上任何數(shù)目的標記。在某些實施方案中，使用可以檢測可檢測復合物中是否存在特定靶特異性探針的可編碼標記。在某些實施方案中，使用可編碼標記，以便檢測到存在特定標記組合，證實存在某一特定可檢測復合物。而且，檢測到缺少這一特定標記組合，證實缺少某一特定可檢測復合物。
在某些實施方案中，標記選自量子點、磷光體和熒光染料。
在利用第一種小珠和第二種小珠的某些實施方案中，探針組合的分離小珠和檢測小珠都包含磁性顆粒。在某些這類實施方案中，將小珠拉長，一端包含磁性顆粒，另一端包含靶特異性探針。小珠另外包含沿小珠長度按特定順序放置的標記(參見例如圖14(a))。參見例如美國專利4,053,433，其中描述了帶有特定順序標記的拉長的聚合物。
在某些實施方案中，設計小珠中磁性顆粒的極性和定位，以便于排列可檢測復合物。例如，在某些實施方案中，包含可檢測復合物的容器在接近磁源的表面上包括凹槽(參見例如圖14(b))。設計小珠，以便小珠中磁性顆粒的極性或定位使可檢測復合物排列于凹槽中，每一可檢測復合物的第一種小珠比該可檢測復合物的第二種小珠更接近于凹槽的一端(參見例如圖14(b))。然后可以通過定量可編碼標記組合的特定順序來定量可檢測復合物。
在這類實施方案中，由于在排列的可檢測復合物中，第一種小珠和第二種小珠上的相同可編碼標記的順序不同(見圖14(c))，可以使用具有包含相同可編碼標記的第一種小珠和第二種小珠的探針組合。
本發(fā)明典型實施方案在其中靶物質是核酸序列的某些實施方案中，探針的序列特異性部分足夠長，以便允許與靶序列中互補序列特異性退火。在某些實施方案中，序列特異性部分的長度為12-35個核苷酸。提供序列特異性退火的探針設計的詳述特別參見Diffenbach和Dveksler，PCR Primer，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，1995以及Kwok等人(Nucl.Acid Res.18999-1005，1990)。
在某些實施方案中，本發(fā)明的探針組合包含與同一靶序列相鄰雜交的第一種靶特異性探針和第二種靶特異性探針。每一探針組合中第一種靶特異性探針的序列特異性部分被設計為按序列特異性方式與靶序列下游區(qū)雜交(參見例如圖1中探針A)。該探針組合中第二種靶特異性探針的序列特異性部分被設計為按序列特異性方式與靶序列上游區(qū)雜交(參見例如圖1中探針Z)。探針的序列特異性部分足夠長，以便合適時允許與靶序列中互補序列特異性退火。在合適條件下，只要包含合適的反應基團，例如而非限制，游離的3′-羥基或5′-磷酸基，相鄰雜交的探針便可能連在一起，形成連接產物。
在某些實施方案中，可能使用兩種不同的探針組合來定量兩種相差一個或多個核苷酸的不同靶序列(參見例如圖2)。根據(jù)本發(fā)明某些實施方案，設計探針組合，以便第一種靶特異性探針的序列特異性部分與下游靶區(qū)域雜交(參見例如圖1中探針A以及圖2中探針A和B)，并且第二種靶特異性探針的序列特異性部分與上游靶區(qū)域雜交(參見例如圖1和圖2中探針Z)。在某些實施方案中，與中央核苷酸互補的核苷酸堿基，″中央互補物″，存在于探針組合的第一種靶特異性探針或第二種靶特異性探針的近端(參見例如圖1中探針A的3′端以及圖2中探針A和B的3′端)。
探針組合的第一種和第二種靶特異性探針與合適的上游和下游靶區(qū)域雜交，中央互補物與靶序列中中央核苷酸堿基配對，雜交的第一種和第二種靶特異性探針可能連在一起，形成連接產物(參見例如圖2(b)-(c))。然而，即使兩個探針均與其各自靶區(qū)域完全雜交，中央核苷酸的錯配堿基也干擾連接(參見例如圖2(b)-(c))。因此，在某些實施方案中，可以區(qū)分相差僅僅單個核苷酸的高度相關序列。
例如，根據(jù)某些實施方案，使用下述兩種不同的探針組合，可以區(qū)分雙等位基因座的兩個潛在的等位基因。每一探針組合中第一種靶特異性探針的中央互補物彼此不同，與兩種不同的第一種靶特異性探針結合的可編碼標記可檢測地不同(參見例如圖2(a)中探針A和B的可編碼標記)。每一探針組合也可以包含相同的第二種靶特異性探針，與兩種相同的第二種靶特異性探針結合的可編碼標記相同(參見例如圖2(a)中探針Z的可編碼標記)。
可以將樣品與兩種不同的探針組合相組合。在某些實施方案中，每一探針組合中的探針之一可以另外包含分離成分。所有三個靶特異性探針均在合適條件下與靶序列雜交(參見例如圖2(b))。然而，只有帶有雜交的中央互補物的第一種靶特異性探針與雜交的第二種靶特異性探針連接(參見例如圖2(c))。因此，如果樣品中只存在一個等位基因，則只產生該靶物質的一個連接產物(參見例如圖2(d)中的連接產物A-Z)。雜合個體的樣品應形成兩種連接產物(A-Z和B-Z)。
另外，在某些實施方案中，探針組合的第一種和第二種靶特異性探針的末端不包含中央互補物。相反，待檢測的靶核苷酸位于第一種靶特異性探針或第二種靶特異性探針的序列特異性部分之中。帶有與其對應靶區(qū)域完全互補的序列特異性部分的探針將在高嚴謹性條件下雜交。相反，序列特異性部分帶有一個或多個錯配堿基的探針將不與其對應靶區(qū)域雜交。第一種靶特異性探針和第二種靶特異性探針必須均與靶序列雜交，才能產生連接產物。待檢測的核苷酸可能在中央或內部。
在某些實施方案中，探針組合中的第一種靶特異性探針和第二種靶特異性探針被設計為具有相似的解鏈溫度(Tm)。
在某些實施方案中，當探針包括中央互補物時，包含靶中央核苷酸目標的中央互補物的探針的Tm比探針組合中不包含中央互補物的其它探針低約4-6℃。包含中央互補物的探針的Tm優(yōu)選設計為接近連接溫度。因此，在這類實施方案中，帶有錯配核苷酸的探針在連接溫度下更容易與靶序列解離。在這類實施方案中，連接溫度因而提供了區(qū)別例如靶物質中潛在多個等位基因的另一方法。
檢測靶物質的某些典型實施方案本發(fā)明涉及定量樣品中靶物質的方法、試劑和試劑盒。在某些實施方案中，使用連接檢測是否存在靶核酸序列。
在某些實施方案中，對于每一待檢靶核酸序列，將包含至少一個第一種靶特異性探針和至少一個第二種靶特異性探針的探針組合與樣品及可選連接劑混合，形成連接反應混合物。該至少一個第一種探針另外包含第一種可編碼標記，其含有至少兩個標記，并特異性針對第一種靶特異性探針。該至少一個第二種探針另外包含第二種可編碼標記，含有至少兩個標記，并特異性針對第二種靶特異性探針。第一種可編碼標記可檢測地不同于第二種可編碼標記。
在某些實施方案中，每一探針組合中的第一種和第二種靶特異性探針被設計為與緊鄰靶序列中央核苷酸的序列互補(參見例如圖2(a)中探針A、B和Z)。探針組合的第一種靶特異性探針或第二種靶特異性探針任一而非全部包含中央互補物(參見例如圖2(a)中探針A)。樣品中存在靶序列時，第一種和第二種靶特異性探針將在合適條件下與靶物質鄰近區(qū)域雜交(參見例如圖2(b))。中央互補物在合適連接劑存在下堿基配對時，兩個相鄰雜交的探針可能連在一起，形成連接產物(參見例如圖Fig2(c))。
通過檢測是否存在該連接產物，可以檢測是否存在靶核酸序列。
在包括但不限于檢測多個等位基因的某些實施方案中，連接反應混合物可能包含針對多等位基因靶基因座中每一潛在等位基因的不同探針組合。在某些實施方案中，例如而非限制，可能使用簡單篩選分析，利用6種探針組合來檢測個體中三個雙等位基因座(例如L1、L2和L3)的存在。參見例如下表1。
表1
在這類實施方案中，使用兩種不同的探針組合檢測每個基因座是否存在每個等位基因。針對每個基因座的兩種不同探針組合的兩個第一種靶特異性探針，例如基因座L1的探針A和B，包含相同的上游序列特異性部分，但中央互補物不同。兩種不同的探針A和B也包含不同的可編碼標記。針對每個基因座的兩種不同探針組合的兩個第二種靶特異性探針，例如基因座L1的探針Z，包含相同的下游序列特異性部分。探針Z也包含相同的可編碼標記。(在某些實施方案中，每個探針組合的探針之一可能另外包含分離成分，每個探針組合的另一探針可能不包含分離成分)。
因此，在表1所述實施方案中，使用3個探針A、B和C形成兩種可能的L1連接產物，其中AZ是第一種L1等位基因的連接產物，BZ是第二種L1等位基因的連接產物。同樣，使用探針C、D和Y形成兩種可能的L2連接產物。同樣，使用探針E、F和X形成兩種可能的L3連接產物。
在連接相鄰雜交的第一種和第二種靶特異性探針之后，可以通過檢測是否存在針對每個等位基因的可編碼標記的獨特組合，來檢測是否存在針對每個基因座的每個等位基因的連接產物。例如，可能檢測下列可編碼標記組合(1)2紅/2籃；(2)4橙/4籃；(3)2黃/2綠；(4)4黃/2綠。這一個體應確定為L1基因座等位基因1的純合子、L2基因座等位基因2的純合子以及L3基因座等位基因1和2的雜合子。
一般技術人員應當理解，在某些實施方案中，使用這些方法也可以區(qū)分位于多等位基因座的3個或多個等位基因。在某些實施方案中，還可以分析一個以上的基因座。
熟練技術人員應當理解，在某些實施方案中，探針可以被設計為在第一種靶特異性探針或第二種靶特異性探針的任何位置帶有中央互補物。另外，在某些實施方案中，包含多個中央互補物的靶特異性探針屬于本發(fā)明范圍之內。
檢測剪接變體根據(jù)某些實施方案，本發(fā)明可能用于鑒定靶核酸序列的剪接變體。例如基因，即編碼蛋白質的DNA，可能包含一系列稱為外顯子的編碼區(qū)，由稱為內含子的非編碼區(qū)分散開。在剪接過程中，去除內含子，并列外顯子，以致最終RNA分子，一般是信使RNA(mRNA)，包含連續(xù)編碼序列。某些基因編碼單個蛋白質或多肽，其它基因因可變剪接而編碼多個蛋白質或多肽。
例如，基因可能包含5個外顯子，各自由至少一個內含子分開，參見圖5。如圖5上部所示編碼初級轉錄物的假定基因編碼3種不同蛋白質，各由三種成熟mRNA之一編碼，如圖5下部所示。因可變剪接(alternate splicing)，外顯子1可能與(a)外顯子2a-外顯子3、(b)外顯子2b-外顯子3或(c)外顯子2c-外顯子3并列，三種剪接選項如圖5所述，產生三種不同形式的成熟mRNA。
大鼠肌肉蛋白質肌鈣蛋白T只是可變剪接的一個例子。編碼肌鈣蛋白T的基因包含5個外顯子(W、X、α、R和Z)，各自編碼最終蛋白質的一個結構域。這5各外顯子由內含子分開。通過肌鈣蛋白T基因的可變剪接產生兩種不同蛋白質，α型和β型。α型由包含外顯子W、X、α和Z的mRNA翻譯。β型由包含外顯子W、X、β和Z的mRNA翻譯。
在某些實施方案中，提供了使用針對每一不同剪接變體的不同探針組合，檢測樣品中至少一個靶核酸序列是否存在不同剪接變體的方法。
圖6說明了鑒定剪接變體的某些非限制性實施方案。這類實施方案可以鑒定兩種不同的剪接變體。一種剪接變體包括外顯子1、外顯子2和外顯子4(剪接變體E1 E2E4)。另一剪接變體包括外顯子1、外顯子3和外顯子4(剪接變體E1 E3E4)。
特異性針對剪接變體E1 E2E4的探針組合包含至少一個第一種靶特異性探針Q，其中包含與至少一部分外顯子1雜交的序列特異性部分，例如可以與鄰近外顯子2或外顯子3的外顯子1末端雜交。至少一個第一種靶特異性探針另外包含第一種可編碼標記。特異性針對剪接變體E1 E2E4的探針組合另外包含至少一個第二種靶特異性探針R，其中包含與至少一部分外顯子2雜交的序列特異性部分，例如可以與鄰近外顯子1的外顯子2末端雜交。特異性針對剪接變體E1 E2E4的探針組合，其至少一個第二種靶特異性探針另外包含可檢測地與第一種可編碼標記不同的第二種可編碼標記。
特異性針對剪接變體E1 E3E4的探針組合包含至少一個第一種探針，其與特異性針對剪接變體E1 E2E4的探針組合的至少一個第一種探針相同。特異性針對剪接變體E1 E3E4的探針組合另外包含至少一個第二種特異性探針S，其中包含與至少一部分外顯子3雜交的序列特異性部分，例如可以與鄰近外顯子1的外顯子3末端雜交。特異性針對剪接變體E1 E3E4的探針組合的至少一個第二種探針另外包含第二種可編碼標記，可檢測地不同于第一種可檢測標記，并在可檢測地不同于特異性針對剪接變體E1 E2E4的探針組合的至少一個第二種探針第二種可檢測標記。
在連接相鄰雜交的第一種和第二種靶特異性探針之后，可以通過檢測是否存在每個剪接變體的可編碼標記的獨特組合，來檢測是否存在每個剪接變體的連接產物。例如，在圖6所述某些方法中，如果檢測到存在帶有2個點和4個點組合的連接產物，則檢測到樣品中存在剪接變體E1 E2E4。如果不存在可編碼標記的組合，則檢測到樣品中不存在剪接變體E1 E2E4。同樣，在圖6所述某些方法中，如果檢測到存在帶有2個點和6個點組合的連接產物，則檢測到樣品中存在剪接變體E1 E3E4。如果不存在可編碼標記的組合，則檢測到樣品中不存在剪接變體E1E3E4。
在某些實施方案中，至少一種靶核酸序列包含至少一種由RNA產生的互補DNA(cDNA)。在某些實施方案中，至少一種cDNA由至少一種信使RNA(mRNA)產生。在某些實施方案中，至少一種靶核酸序列包含存在于樣品中的至少一種RNA靶序列。
利用可尋址(addressable)部分的方法在某些實施方案中，利用獨特的可特異性尋址的寡核苷酸或″可尋址部分″?？蓪ぶ凡糠质窃O計為與可尋址部分的互補物雜交的寡核苷酸序列。對于一對彼此互補的可尋址部分，其一稱作可尋址部分，另一則稱作互補的可尋址部分。
在某些實施方案中，該方法包括形成包含第一種探針、第二種探針、連接劑和樣品的連接混合物，第一種探針包含第一種可尋址部分和第一種靶特異性部分，第二種探針包含第二種可尋址部分和第二種靶特異性部分，其中第一種和第二種靶特異性部分在靶序列上彼此相鄰雜交時適于連在一起。如果樣品中存在靶物質，則第一種和第二種探針的第一種和第二種靶特異性部分連在一起，形成連接產物。
圖22說明了包括連接反應混合物的典型實施方案，該連接反應混合物包含第一種探針12，其中包含第一種靶特異性部分14和第一種可尋址部分18；以及第二種探針20，其中包含第二種靶特異性部分22和第二種可尋址部分24。該探針的靶特異性部分與靶序列16雜交。將連接反應混合物進行連接反應，第一種和第二種探針的第一種和第二種靶特異性部分連在一起，形成連接產物。
在某些實施方案中，在形成包含第一種可尋址部分和第二種可尋址部分的任何連接產物之后，向連接混合物中加入小珠對。在某些實施方案中，小珠對包含第一種小珠和第二種小珠，第一種小珠包含第一種互補可尋址部分，其中第一種互補可尋址部分與第一種可尋址部分互補；第二種小珠包含第二種互補可尋址部分，其中第二種互補部分與第二種可尋址部分互補。連接產物的第一種可尋址部分與第一種小珠的第一種互補可尋址部分雜交，連接產物的第二種可尋址部分與第二種小珠的第二種互補可尋址部分雜交，形成包含第一種小珠、連接產物和第二種小珠的可檢測復合物。在某些實施方案中，第一種小珠或第二種小珠或兩種小珠可能是分離成分。在某些實施方案中，第一種小珠或第二種小珠或兩種小珠可能包含可編碼標記。
在某些實施方案中，與小珠結合的互補可尋址部分包括在發(fā)夾結構中。在某些實施方案中，發(fā)夾結構包含互補可尋址部分和錨定部分。在某些實施方案中，錨定部分在互補可尋址部分上游，錨定部分包含彼此互補的第一部分和第二部分。在某些實施方案中，發(fā)夾結構的錨定部分連接小珠。圖23描述了發(fā)夾結構52和54的某些典型實施方案。
在某些實施方案中，發(fā)夾結構錨定部分的第一和第二部分彼此雜交，使錨定部分包括與互補可尋址部分相鄰的一端以及折回到與互補可尋址部分相鄰一端相對的游離端。參見例如圖23。在某些實施方案中，連接產物的第一種可尋址部分和第二種可尋址部分分別與第一種互補可尋址部分和第二種互補可尋址部分雜交，包括在兩個不同的發(fā)夾結構中，連接兩個不同的小珠，形成可檢測復合物。參見例如圖23。在某些實施方案中，設計發(fā)夾結構，使錨定部分的游離端適合連接與發(fā)夾結構雜交的連接產物的相鄰可尋址部分。參見例如圖23。在某些實施方案中，將連接產物和發(fā)夾結構進行連接反應。在這類實施方案中，可檢測復合物包含小珠以及與連接小珠的發(fā)夾結構相連的連接產物。
在某些實施方案中，在形成包含第一種可尋址部分和第二種可尋址部分的任何連接產物之后，向連接混合物中加入連接寡核苷酸對和小珠對。某些這類典型實施方案如圖24所示。在某些實施方案中，小珠對包含含有第三種可尋址部分的第一種小珠以及含有第四種可尋址部分的第二種小珠。在這類實施方案中，連接的寡核苷酸對包含第一種連接寡核苷酸和第二種連接寡核苷酸。第一種連接寡核苷酸包含與連接產物第一種可尋址部分互補的第一種互補可尋址部分、以及與第一種小珠的第三種可尋址部分互補的第三種互補可尋址部分。第二種連接寡核苷酸包含與連接產物第二種可尋址部分互補的第二種互補可尋址部分、以及與第二種小珠的第四種可尋址部分互補的第四種互補可尋址部分。第一種、第二種、第三種和第四種特異性可尋址部分分別與第一種、第二種、第三種和第四種特異性可尋址部分雜交，形成包含連接產物和小珠的連接產物。在某些實施方案中，第一種小珠或第二種小珠或兩個小珠可能是分離成分。在某些實施方案中，第一種小珠或第二種小珠或兩個小珠可能包含可編碼標記。
在某些實施方案中，設計連接寡核苷酸，以至于在第一種、第二種、第三種和第四種特異性可尋址部分分別與第一種、第二種、第三種和第四種特異性可尋址部分雜交之后，第一種和第三種可尋址部分的鄰近末端適合連在一起，第二種和第四種可尋址部分的鄰近末端適合連在一起。在某些實施方案中，將雜交的連接產物、連接寡核苷酸以及小珠的可尋址部分進行連接反應。在這類實施方案中，可檢測復合物包含小珠以及與小珠的可尋址部分相連的連接產物。
在某些實施方案中，在形成包含第一種可尋址部分和第二種可尋址部分的任何連接產物之后，將連接產物與未雜交靶物質的過量探針相分離。在某些該類實施方案中，可能利用濾膜，設計為捕獲靶物質而使未雜交的探針通過。由于連接產物與靶物質雜交，該連接產物也將被濾膜捕獲。在某些實施方案中，去除未雜交靶物質的探針，連接產物繼續(xù)進行。
在某些實施方案中，可以通過使連接產物與靶物質變性，將連接產物與靶物質分離。在某些實施方案中，然后可以破壞靶物質。例如，在靶物質是mRNA的某些實施方案中，可以加入RNA酶分解mRNA，而不破壞連接產物。
單一小珠分析在某些實施方案中，可能使用兩種分離成分和一種可編碼標記進行靶物質檢測。在某些實施方案中，該檢測利用包含第一種寡核苷酸探針的探針組合，該探針包含第一種可尋址部分(Z1)和第一種靶特異性部分(TSO1)，如圖25所示。在某些實施方案中，該探針組合另外包含第二種寡核苷酸探針，該探針包含第二種靶特異性部分(TSO2)、非特異性間隔部分(S)以及第一種分離成分，例如生物素分子，如圖25所示。在某些實施方案中，在靶物質存在下，第一種靶特異性部分和第二種靶特異性部分與靶物質雜交，以便這兩種靶特異性部分適合相連。因此，在某些實施方案中，如果存在靶分子，則兩個相鄰雜交的第一種和第二種連接探針可能連在一起，形成包含第一種和第二種靶特異性部分、第一種可尋址部分、間隔部分以及生物素分子的連接產物，如圖25所示。
在某些實施方案中，該方法利用包含可編碼標記的小珠，該可編碼標記連接包含第二種可尋址部分(Z2)的一種或多種寡核苷酸。參見例如圖26。在某些實施方案中，第二種可尋址部分Z2與第一種可尋址部分Z1互補，以致如果形成連接產物，則該探針組合形成可檢測復合物，其中包含含有可編碼標記的小珠、與第一種可尋址部分Z1雜交的第二種可尋址部分Z2、第一種和第二種靶特異性部分(TSO1和TSO2)、間隔部分(S)和生物素分子的，如圖26所示。
在某些實施方案中，包含第二種可尋址部分Z2寡核苷酸共價連接包含可編碼標記的小珠。在某些實施方案中，第二種可尋址部分Z2可能包含DNA、LNA、PNA、2′-O-甲基核酸或任何其它探針物質。在某些實施方案中，將第一種和第二種可尋址部分(Z1和Z2)的序列優(yōu)化為特定解鏈溫度或雜交結合強度。
在某些實施方案中，第二種可尋址部分Z2是與包含可編碼標記的小珠相連的發(fā)夾結構的一部分。參見例如圖29。在圖29所述某些實施方案中，該發(fā)夾結構是，如果第一種可尋址部分Z1與第二種可尋址部分Z2雜交，則第一種可尋址部分適于連接發(fā)夾結構的3′-端。在某些實施方案中，該連接產物連接發(fā)夾結構的3′-端，形成可檢測復合物。
在某些實施方案中，包含可編碼標記的小珠是用磁性物質例如鐵氧體包埋的聚苯乙烯小珠，使這種小珠具有磁性，并比某些緩沖液密度大。在某些實施方案中，可編碼標記可能是包埋于或連接小珠的發(fā)射光子的顆粒。在某些實施方案中，發(fā)射光子的顆?？赡墚a生獨特波長的信號，而且每種小珠的顆粒數(shù)目可能不同，使不同的信號強度和波長增加獨特小珠的數(shù)目。
在某些實施方案中，連接反應之后，將混合物加入包含可編碼標記的容器中，如圖27(A)所示。在某些實施方案中，在將混合物加入包含可編碼標記的容器之前、連接反應之后，可能利用從3′磷酸末端開始分解探針的化學方法，充分去除未處于連接產物中的第一種寡核苷酸探針。在這類實施方案中，連接產物因生物素位于3′-端而不被分解。在某些實施方案中，可以利用酶例如非限制性例子RNase進行消化，充分去除靶物質。在某些實施方案中，可能使用濾膜去除RNA或DNA靶物質。
在圖27(B)所示某些實施方案中，將可檢測復合物暴露于包被鏈親和素的磁體，小珠被吸引到磁體。在圖27(C)所示某些實施方案中，將磁體關閉，帶有生物素分子的可檢測復合物仍連接鏈親和素包被的磁體，而未處于可檢測復合物中的包含可編碼標記的小珠則從鏈親和素包被的磁體上脫落。在某些實施方案中，可能將第二個磁體放在容器底部，以便第二個磁體從鏈親和素包被的磁體上去除未結合的小珠，而不去除通過生物素分子結合到鏈親和素包被的磁體上的處于可檢測復合物中的小珠。在圖27(D)和27(E)所示某些實施方案中，重復該過程，開啟磁體，使可檢測復合物附著到鏈親和素表面，關閉磁體，使未處于可檢測復合物中的包含可編碼標記的小珠脫落。在圖27(F)所示某些實施方案中，然后移開鏈親和素包被的磁體連同結合的可檢測復合物。在某些實施方案中，可能使用照相機評估可編碼標記，以計數(shù)和鑒定連在磁體上的可檢測復合物。然后利用可檢測復合物的數(shù)目定量樣品中的靶分子。
在某些實施方案中，可能使用多個微孔，每個微孔包含指定數(shù)目的帶有不同可編碼標記和不同可尋址部分的不同小珠的相同組合。在某些實施方案中，每個微孔包括一組第一種寡核苷酸探針，其具有與不同小珠的可尋址部分互補的不同可尋址部分。在分開的微孔中，第一種寡核苷酸探針可能具有與不同靶物質互補的不同靶特異性部分。在某些這類實施方案中，可能在利用不同小珠的相同組合的微孔中進行不同的多重分析。在某些實施方案中，如果每孔多重分析的數(shù)目是1,000，則1,000種不同的小珠能夠在384孔板中進行384,000種不同的分析。
定量靶物質在本發(fā)明某些實施方案中，可以定量樣品中一種或多種靶物質，例如靶核酸序列的量。定量可以應用于上述有關檢測是否存在靶物質的任何方法中。例如而非限制，可以定量樣品中不同的特定核酸序列的數(shù)目，包括但不限于位于一個或多個基因座的各種等位基因的數(shù)目、特定單核苷酸多態(tài)性的數(shù)目以及特定剪接變體的數(shù)目。
在某些實施方案中，為定量樣品中特定靶核酸序列的數(shù)量，通過確定連接產物可編碼標記的特定組合的數(shù)量來確定樣品中特定連接產物的數(shù)量。在某些這類實施方案中，可能確定生物樣品中特定靶序列的數(shù)量，而無需對生物樣品進行擴增反應例如聚合酶鏈式反應。
同樣，在利用量子點作為標記的某些實施方案中，測定的量子點組合混合物的數(shù)目與樣品中連接產物的實際數(shù)目直接相關。因此，在這類實施方案中，為評價樣品中連接產物的數(shù)目，無需將熒光信號的強度水平與對照信號作比較。
定量核酸序列可能具有許多有益的應用。生物的遺傳組成由該生物基因組中包含的基因決定?；蛴删幋a制備蛋白質所需信息的長鏈或脫氧核糖核酸(DNA)聚合物組成。生物的性質、能力和特征通常與該生物產生或未產生的蛋白質的類型和數(shù)量有關。
蛋白質可如下由基因產生。首先，通過已知″轉錄″的過程將編碼蛋白質例如蛋白質″X″的基因的DNA轉換為核糖核酸(RNA)。在轉錄過程中，產生基因的單鏈互補RNA拷貝。其次，該RNA拷貝，稱為蛋白質X信使RNA(mRNA)，由細胞的生化機器用來生成蛋白質X，此過程稱為″翻譯″。基本上，細胞的蛋白質生產機器結合mRNA、″閱讀″RNA密碼、將其″翻譯″為蛋白質X的氨基酸序列。總之，DNA轉錄產生mRNA，后者翻譯產生蛋白質。
細胞生成的蛋白質X的數(shù)量通常主要依賴于細胞內存在的蛋白質X mRNA的數(shù)量。細胞內蛋白質X mRNA的數(shù)量至少部分取決于基因X表達的程度。特定基因是否表達，如果表達，其水平如何，可能對生物具有顯著影響。
例如，蛋白質胰島素特別調節(jié)血糖水平。個體產生胰島素的數(shù)量可以決定該個體健康與否。胰島素缺陷導致一種可能致命的疾病，糖尿病。糖尿病個體一般胰島素mRNA水平低，因而生成低水平的胰島素，而健康個體一般胰島素mRNA水平較高，生成正常水平的胰島素。
典型因基因異常低表達而致的另一人類疾病是Tay-Sachs病。Tay-Sachs病患兒缺少或缺陷鞘脂分解所需蛋白質。這些兒童因而具有異常高水平的鞘脂，引起神經系統(tǒng)病癥，可能導致死亡。
鑒定和檢測由基因過表達或低表達所致其它遺傳疾病/病癥很有用處。另外，癌癥及某些其它已知疾病或病癥可通過某些基因的過表達或低表達進行檢測，或與某些基因的過表達或低表達有關。例如，前列腺癌男性一般產生異常高水平的前列腺特異性抗原(PSA)；據(jù)信來自腫瘤抑制基因的蛋白質在多種類型癌癥的發(fā)展中具有重要作用。
在某些實施方案中，利用核酸技術，微量的生物樣品一般可以提供足量物質，來同時檢測多種類型疾病、病癥和易病性(predisposition)。另外，許多其它情況將會需要定量細胞或生物體中特定靶核酸，例如mRNA，該過程有時被稱作″基因表達模式″。已知例如特定細胞類型、或組織、或個體中特定靶核酸的數(shù)量時，可能在某些病例中開始匯集該細胞類型、組織或個體的基因表達模式。將個體的基因表達模式與已知的表達模式相比較，可能允許診斷某些病例中的某些疾病或病癥。通過評價某些病例的基因表達模式，也可能鑒定未來發(fā)展某些疾病或病癥的易病性或易感性。基因表達模式分析也可能特別用于某些病例的遺傳咨詢和法醫(yī)鑒定。在某些實施方案中，可能使用根據(jù)此處公開的本發(fā)明方法獲得的定量信息，來匯集一種或多種靶核酸序列的基因表達模式。
在某些實施方案中，已知某一樣品中若干靶核酸序列的基因表達水平時，可以匯集該樣品的基因表達模式，并與其它樣品相比較。例如而非限制，樣品可能得自相同細胞群體的兩等份細胞，其中一等份在化學化合物或藥物存在下生長，另一等份則不然。通過比較在或不在藥物存在下生長的細胞的基因表達模式，可能確定該藥物對特定靶基因表達的作用。
蛋白質檢測在本發(fā)明某些實施方案中，提供了檢測樣品中是否存在至少兩種靶蛋白質的方法。在某些實施方案中，該方法包括混合樣品和特異性針對至少兩種靶蛋白質中每一種的不同探針組合，每一探針組合包含(a)至少一種分離小珠，其包含磁性顆粒、含有至少兩種標記的第一種可編碼標記以及第一種靶特異性探針，其中第一種可編碼標記特異性針對第一種靶特異性探針，以及(b)至少一種檢測小珠，其包含含有至少兩種標記的第二種可編碼標記以及第二種靶特異性探針，其中第二種可編碼標記特異性針對第二種靶特異性探針。在某些實施方案中，第一種和第二種靶特異性探針結合相同靶蛋白質的不同部分。在某些實施方案中，如果樣品中存在靶蛋白質，則形成可檢測復合物。在某些實施方案中，該方法另外包括通過計數(shù)至少兩種靶蛋白質各自的可檢測復合物，來檢測樣品中是否存在至少兩種不同蛋白質。
在某些實施方案中，靶特異性探針是抗體或抗體片段。
例如，在某些實施方案中，第一種靶特異性探針是可以特異性結合特定靶蛋白質第一部分的第一種抗體，第二種靶特異性探針是可以特異性結合特定靶蛋白質不同的第二部分的第二種抗體。某些這類實施方案制備抗體的一個非限制性實例是，利用靶蛋白質的一個片段產生第一種抗體，利用該靶蛋白質的不同片段產生第二種抗體。第一種抗體連接磁性分離成分。第二種抗體連接可編碼標記。
在某些實施方案中，在靶蛋白質存在下，第一種抗體和第二種抗體特異性結合靶蛋白質的不同部分，以便第一種抗體或第二種抗體與蛋白質的結合不抑制另一抗體結合該蛋白質。如果存在靶蛋白質，則形成可檢測復合物。在某些實施方案中，可能使用上述分離技術將可檢測復合物與未結合抗體分離。通過計數(shù)可編碼標記的獨特組合，檢測是否存在特定可檢測復合物，來表明樣品中是否存在靶蛋白質。在某些實施方案中，可能通過測定可檢測復合物的數(shù)量，來測定樣品中靶蛋白質的數(shù)量。
試劑盒的某些實施方案在某些實施方案中，提供了檢測樣品中靶核酸序列的試劑盒。在某些實施方案中，該試劑盒包含每種靶核酸序列特異性的不同小珠組合。在某些實施方案中，每種不同小珠組合包含(a)至少一種分離小珠，其包含磁性顆粒、包含兩種或多種標記的第一種可編碼標記以及第一種靶特異性探針，其中第一種可編碼標記特異性針對第一種靶特異性探針，以及(b)至少一種檢測小珠，其包含含有一組兩種或多種標記的第二種可編碼標記以及第二種靶特異性探針，其中第二種可編碼標記特異性針對第二種靶特異性探針；并且其中第一種可編碼標記在檢測上不同于第二種可編碼標記。在某些實施方案中，在互補靶序列上彼此相鄰雜交時，每一組合中的靶特異性探針適合于連在一起。
在某些實施方案中，該試劑盒包含連接劑。在某些實施方案中，該連接劑是連接酶。在某些實施方案中，該連接劑是熱穩(wěn)定性連接酶。在某些實施方案中，該熱穩(wěn)定性連接酶選自Tth連接酶、Taq連接酶和Pfu連接酶中的至少一種。
實施例以下實施例說明本發(fā)明的某些實施方案，無論如何不限制本發(fā)明的范圍。
實施例1以下實驗顯示，在寡核苷酸連接分析(OLA)中，連接小珠的探針與靶核酸序列雜交并連接。連接小珠的探針所產生的連接產物數(shù)量與未連接小珠的相同探針所產生的連接產物數(shù)量相比較。
將磁性小珠連接到寡核苷酸探針。包被鏈親和素的磁性小珠得自Seradyne(Sera-Mag.，Lot No.113564)。如下將生物素連接到寡核苷酸探針(靶特異性寡核苷酸(TSO探針))。生物素標記的寡核苷酸探針(靶特異性寡核苷酸(TSO探針))由Applied Biosystems，Inc.(Foster City，CA)合成。設計TSO探針與靶核酸序列雜交。下表2給出了TSO探針的序列。將約100μl鏈親和素包被的磁性小珠(1mg/ml)加入0.2ml管的100μl生物素-TSO探針(10μM)中。將混合物在4℃溫育60分鐘，使生物素結合鏈親和素。
表2
然后清洗磁性小珠，如下從小珠中去除未結合的TSO探針。將40μl PBS緩沖液加入每個0.2ml管的20μl混合物中。PBS緩沖液包含KPO4(二代的) 1.82g/lNaPO4(單代的)0.22g/lNaCl 8.76g/l調節(jié)到pH7.4。
將樣品短暫渦旋，然后置于磁體頂部4分鐘。4分鐘以后，從每個0.2ml管中取出40μl，而0.2ml管仍留在磁體上。將每管的40μl上清保存在1ml管中，供以后分析。磁性分離及清洗再重復3次，總計4次。
第二種寡核苷酸探針(pTSO探針)被設計為與鄰近TSO探針序列互補區(qū)的靶核酸序列雜交。TSO和pTSO探針與靶核酸序列雜交時，pTSO探針與TSO探針相鄰。TSO和pTSO探針均雜交到靶核酸序列時，它們可以在連接反應中連在一起。生物素標記的pTSO探針由Applied Biosystems，Inc.(Foster City，CA)合成。表2給出了pTSO探針的序列。
包被鏈親和素的熒光小珠得自Bangs Laboratories(Fisher，IN)。
進行了連接反應(OLA)。將連接TSO探針的磁性小珠、熒光標記的鏈親和素包被小珠、連接生物素的pTSO探針、連接酶以及每一反應中不同濃度的合成靶核酸混合，制備11種不同反應。表2給出了合成靶物質序列。在11種反應的每一反應中，合成靶核酸序列的濃度由10nM低至10aM，按數(shù)量級下降(實際濃度參見圖15)。有一個不含合成靶核酸序列的對照。
反應配方如下2μl 10x Taq連接酶緩沖液2μl生物素標記的pTSO探針(100nM)2μl熒光小珠(100μg/ml)16μl連接TSO的磁性小珠(1mg/ml)0.5μl連接酶(40U/μl)2μl合成的靶物質(10nM-10aM)在ABI 9700熱循環(huán)儀上，將連接反應溫育95℃、15秒然后冷卻到50℃、20分鐘的10個循環(huán)。Taq連接酶和連接酶緩沖液得自NewEngland Biolabs(Catalog No.M0208)。
連接反應之后，清洗磁性小珠，去除任何未連接的熒光小珠。將40μl PBS緩沖液加入每個0.2ml管的20μl混合物中。將樣品短暫渦旋，然后置于磁體頂部4分鐘。4分鐘以后，從每個0.2ml管中取出40μl，而0.2ml管仍留在磁體上。將每管中40μl上清保存在1ml管中，供以后分析。磁性分離及清洗再重復3次，總計4次。
除了包括小珠的11種OLA反應之外，使用不含小珠的相同TSO和pTSO探針、相同連接酶、相同連接酶緩沖液以及相同濃度靶核酸序列，進行不含小珠的另外11種OLA反應。這些反應的配方如下2μl 10x連接酶緩沖液11.5μl水2μl生物素標記的TSO探針(100nM)2μl生物素標記的pTSO探針(100nM)0.5μl連接酶(40U/μl)2μl合成的靶物質(10nM-10aM)然后利用磁體從反應中取出每一不同濃度反應的磁性小珠。如上所述清洗小珠，并轉移到每一不同反應分開的檢測容器中。檢測容器是Petroff-Hausser計數(shù)管(VWR，catalog No.15170-048)。然后利用ABI 7700(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)檢測連接產物的熒光小珠。
圖16顯示從5個反應中觀察到的小珠對(包含熒光小珠)的5張圖片，以及1張只利用可見光學顯微鏡觀察的磁性小珠圖片。每張圖的″視野″代表平均體積約0.5μl的連接產物。圖16表明，熒光小珠已經成功與磁性小珠配對、清洗并轉移。
將含有連接探針的小珠的OLA反應與不含連接探針小珠的每個對應靶濃度的OLA反應作比較。利用TaqmanTM分析來測量連接產物。
399-Taqman探針由Applied Biosystems(Foster City，California)提供。表2給出了探針序列。TaqmanTM探針及其使用方法描述于例如美國專利5,538,848。TaqmanTM探針通過DNA聚合酶的5′核酸酶活性起作用。如果存在靶物質，則TaqmanTM探針與靶核酸序列雜交。Taqman探針的一端具有熒光分子，另一端具有淬滅分子。該探針連接的熒光分子和淬滅分子完整時，沒有熒光信號。
加入也與靶核酸序列雜交的引物。然后在引物處啟動向引物末端添加核苷酸的聚合反應。靶核酸序列上的TaqmanTM探針由于在DNA聚合過程中發(fā)生鏈的替換而在聚合反應期間斷裂。斷裂使熒光分子脫離了探針上淬滅分子的存在，導致熒光分子發(fā)出熒光。因此，檢測到熒光表明存在與聚合酶反應有關的特定靶核酸序列。
此外，熒光水平與樣品中靶核酸序列的數(shù)量相關(熒光水平越高，靶核酸序列的數(shù)量越大)。可以計算指定樣品熒光水平的Ct值。Ct值與熒光水平負相關。換言之，Ct值越低，熒光水平越高。
對22種不同OLA反應中每個產物的TaqmanTM分析，配方如下1μl 399-TaqmanTM探針(5μM)2.5μl 116/115引物(10μM)6.5μl水12.5μl 2x Master Mix來自先前OLA反應的2.5μl樣品TaqmanTM反應在95℃溫育10分鐘，然后進入循環(huán)，包括第一步95℃、15秒和第二步60℃、1分鐘。在一定數(shù)目的循環(huán)之后，出現(xiàn)信號。記錄信號出現(xiàn)前反應經歷的循環(huán)數(shù)目，稱為Ct值。表2給出了TaqmanTM反應的116/115引物序列。Master Mix得自AppliedBiosystems(Cat.No.4318739)。
將存在小珠的每個OLA反應產物的Taqman分析與不含小珠的對應靶核酸序列濃度的OLA反應產物作比較。結果如圖15所示。圖15中Taqman分析顯示了溶液中探針和連接小珠的探針的雜交(少于1小時)和靶敏感性(大于fM)。檢測是在反應時間約1小時進行。
實施例2進行下列實驗，以測定在使用不同數(shù)量的合成靶分子時檢測到的小珠對數(shù)目。
聚苯乙烯小珠得自Bangs(No.PA05N/2057)。小珠直徑約3.1μM，表面帶有105位點/μM2密度的-NH2基(根據(jù)廠商數(shù)據(jù))，密度為1.073g/cm3。
如實施例1所述，TSO探針被設計為與靶核酸序列雜交。表2給出了TSO探針的序列。按照下列程序，將TSO探針的5′端連接Bangs小珠胺基，產生TSO-小珠。
如前所述，在10.0ml PBS中將小珠(1.0ml，100mg/ml)清洗兩次。第二次清洗之后，將小珠重懸于10.0ml戊二醛溶液(10％戊二醛的PBS)中。讓小珠在室溫下反應2小時，連續(xù)攪拌。然后如前所述在PBS中清洗小珠，重懸于5ml PBS。將偶聯(lián)胺的TSO探針置于5ml PBS中，與包含小珠的5ml溶液混合。讓混合物在室溫下反應2-4小時，連續(xù)攪拌。然后再次清洗小珠，重懸于包含0.1％Tween-20的10mlPBS中。將重懸的小珠溫育30分鐘。然后再次清洗小珠，重懸于包含0.1％Tween-20的10ml PBS儲液中。
如上所述，第二種寡核苷酸探針(pTSO探針)被設計為與鄰近TSO探針序列互補區(qū)的靶核酸序列雜交。TSO和pTSO探針與靶核酸序列雜交時，pTSO探針與TSO探針相鄰。TSO和pTSO探針均雜交到靶核酸序列時，它們可以在連接反應中連在一起。生物素標記的pTSO探針合成并得自Applied Biosystems，Inc.(Foster City，CA)。表2給出了pTSO序列。
進行了寡核苷酸連接分析反應(OLA)。將TSO-小珠與生物素標記的pTSO、連接酶以及不同濃度的合成靶序列混合，制備8種不同反應。反應混合物如下2μl 10x連接酶緩沖液2μl生物素標記的pTSO(100nM)2μl TSO-小珠14μl ddH2O0.25μl連接酶(40U/μl)2μl合成靶序列(1nM降至1fM的不同濃度，外加一個不含靶序列的反應)在ABI 9700熱循環(huán)儀上，將連接反應溫育95℃、15秒然后冷卻到50℃、20分鐘的10個循環(huán)。Taq連接酶和連接酶緩沖液得自NewEngland Biolabs(Catalog No.M0208)。
鏈親和素包被的磁性小珠得自Seradyne(Sera-Mag.，Lot No.113564)，由包含40％磁鐵礦(Fe3O4)的聚苯乙烯組成，直徑約1.0μM，密度為1.5g/cm2。鏈親和素以每小珠107位點的密度位于小珠表面。
在各個反應中，將20μl 8種不同OLA反應物之一加入20μl鏈親和素包被的小珠(106小珠/μl)。這些混合物在4℃溫育1小時。
溫育之后，將每一40μlOLA鏈親和素包被小珠混合物短暫渦旋，然后在VWR″Aquasonic″超聲清洗儀功率水平9處超聲10秒。超聲之后，將每種混合物20μl置于各個0.2ml管中，然后進行磁性分離和清洗。
磁性分離和清洗的過程如下。將40μl PBS緩沖液加入每個0.2ml管的20μl混合物中。將樣品短暫渦旋，然后置于磁體頂部4分鐘。4分鐘以后，從每個0.2ml管中取出40μl，而0.2ml管仍留在磁體上。將每管的40μl上清保存在1ml管中，供以后分析。磁性分離及清洗再重復3次，總計4次。
磁性分離及清洗以后，將收集在1ml管中的每個上清離心5分鐘。
在磁性分離及清洗以后，將8種不同OLA反應中每個留在0.2ml管中的剩余部分進行TaqmanTM分析，以確定每一反應中相連小珠對的數(shù)目。此外，對1ml管中每種上清的一部分進行TaqmanTM分析，以確定多少小珠對未通過磁性分離過程從清洗緩沖液中分離。
399-Taqman探針由Applied Biosystems(Foster City，California)提供。表2給出了探針序列。一般而言，TaqmanTM探針及其使用方法描述于例如美國專利5,538,848。TaqmanTM探針通過DNA聚合酶的5′核酸酶活性起作用。如果存在靶物質，則TaqmanTM探針與靶核酸序列雜交。Taqman探針的一端具有熒光分子，另一端具有淬滅分子。該探針連接的熒光分子和淬滅分子完整時，沒有熒光信號。
加入也與靶核酸序列雜交的引物。然后在引物處啟動向引物末端添加核苷酸的聚合反應。靶核酸序列上的TaqmanTM探針由于在DNA聚合過程中發(fā)生鏈的替換而在聚合反應期間斷裂。斷裂使熒光分子脫離了探針上淬滅分子的存在，導致熒光分子發(fā)出熒光。因此，檢測到熒光表明存在與聚合酶反應有關的特定靶核酸序列。
此外，熒光水平與樣品中靶核酸序列的數(shù)量相關(熒光水平越高，靶核酸序列的數(shù)量越大)?？梢杂嬎阒付悠窡晒馑降腃t值。Ct值與熒光水平負相關。換言之，Ct值越低，熒光水平越高。
對8種不同OLA反應以及8種保存上清中每個產物的TaqmanTM分析，配方如下1μl 399-TaqmanTM探針(5μM)2.5μl 116/115引物(10μM)6.5μl水12.5μl 2x Master Mix2.5μl來自先前OLA反應的樣品TaqmanTM反應在95℃溫育10分鐘，然后進入循環(huán)，其包含第一步95℃、15秒和第二步60℃、1分鐘。表2給出了TaqmanTM反應的116/115引物序列。Master Mix得自Applied Biosystems(Cat.No.4318739)。
此外，將來自每個反應和每個收集上清的小珠對部分分別鋪在網格上。目視檢查網格，以便計算每個上清和每個反應中的小珠對的總數(shù)。
TaqmanTM分析和目視檢查的結果如圖17和表3、4和5所示。
目視檢查測定的每個反應中的小珠對和小珠數(shù)目表3
表3顯示在每個反應的網格中計數(shù)的小珠對總數(shù)，以及計算的每個反應中磁性分離的小珠對數(shù)目，以網格中放置的反應物質百分比表示。還顯示計算的樣品中存在的每個靶分子產生的小珠對的百分比，以及未摻入小珠對的小珠數(shù)目。
由Taqman分析測定的成功連接的計算數(shù)表4
表4顯示由Taqman分析測定的連接產物的計算產量。表4顯示磁性分離過程前后存在的連接產物計算濃度和數(shù)目，以及樣品中每個靶物質產生的連接的計算百分比。
通過Taqman分析的分離后連接數(shù)目表5
表5顯示分離過程之后每個反應中存在的連接產物的計算數(shù)。表5還顯示利用磁性分離過程從清洗緩沖液及其它反應物中分離的、每個OLA反應中產生的連接產物的計算百分比。由Taqman分析測定連接產物的數(shù)目。
實施例3直徑約5.6μM的編碼聚苯乙烯小珠購自Luminex(LuminexCorp.，Austin，TX)。所購小珠已被摻入兩種顏色染料，并具有不同的染料強度，產生可由Luminex 100流式細胞儀檢測的獨特光學編碼。利用Luminex手冊中描述的NH2酯化學，將寡核苷酸連到小珠表面。在Luminex小珠的胺基和連接的寡核苷酸5′-端之間包括一個聚乙二醇(PEG)接頭。寡核苷酸包含20個堿基的引物序列和20個堿基長的序列(稱為可尋址部分)，為在特定溫度下具有最小交叉反應性的特異性雜交而設計。引物序列位于PEG接頭和可尋址部分之間。連接寡核苷酸之后，如以上實施例1所述，利用含0.1％Tween-20的pH7.4磷酸緩沖鹽水PBS清洗小珠4次，以便去除未共價結合小珠的寡核苷酸。在50-65℃清洗，持續(xù)20分鐘。將連接兩種不同編碼小珠的、帶有兩種不同可尋址部分的兩種不同寡核苷酸的序列命名為Z1和Z2，如下表6所示。序列Z1和Z2的可尋址部分由黑體顯示。
表6
使用一組第一種Luminex小珠(B1)和一組第二種Luminex小珠(B2)(每組10,000個小珠)。第一種小珠(B1)包含第一種可編碼標記和寡核苷酸Z1。第二種小珠(B2)包含第二種可編碼標記和寡核苷酸Z2。
如下使用連接探針。兩種探針是等位基因特異性寡聚物(oligo)(ASO1和ASO2，如表6所示)，其包含與包含特定單核苷酸多態(tài)性(SNP)的靶序列互補的靶特異性部分。ASO設計帶有與位于探針3′端的SNP互補的堿基。因此，ASO1和ASO2的3′端具有不同堿基。
ASO1在靶特異性部分的5′包含可尋址部分。ASO2在靶特異性部分的5′包含不同的可尋址部分。兩種ASO均為40個堿基長。ASO3′端的20個堿基是靶特異性部分，而5′端是可尋址部分。ASO1和ASO2的可尋址部分在表6中以黑體顯示。
也提供了基因座特異性寡聚物(LSO)。LSO的序列如表6所示。LSO包含與靶序列互補的靶特異性部分，該靶序列鄰近與ASO的靶特異性部分互補的靶序列部分，以致當LSO和ASO1或ASO2與靶序列雜交時，適合連在一起。LSO具有利用PEG接頭連接到3′端的生物素分子。該PEG接頭排在最后的3′核苷酸和生物素分子之間。LSO長度為40個堿基。LSO5′端的20個堿基是靶特異性部分，而LSO3′端的20個堿基與特定Taqman引物互補。
合成模板Z3包含與小珠B1上寡核苷酸Z1的可尋址部分互補的3′端序列，并包含與ASO1的可尋址部分互補的5′端序列，以致在與合成模板Z3雜交時，ASO1和寡核苷酸Z1適合相連。
合成模板Z4包含與小珠B2上寡核苷酸Z2的可尋址部分互補的3′端序列，并包含與ASO2的可尋址部分互補的5′端序列，以致在與合成模板Z4雜交時，ASO2和寡核苷酸Z2適合相連。
靶序列是在100℃加熱30分鐘的基因組DNA。已知靶序列(通過其它方法證實)包含與ASO1互補、但不與ASO2互補的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。
連接反應的體積是6.75μl。反應混合物如下0.5μl 10x連接酶緩沖液0.5μl的100nM ASO1探針(3×1010探針)0.5μl的100nM ASO2探針(3×1010探針)0.5μl的100nM LSO探針(3×1010探針)0.5μl的10nM濃度模板Z3(3×109分子)0.5μl的10nM濃度模板Z4(3×109分子)1μl溶液B1(10,000小珠)1μl溶液B2(10,000小珠)0.25μl連接酶(40U/μl)0.5μl加熱的gDNA(100ng/μl)Taq連接酶和10X連接酶緩沖液購自New England Biolabs(Catalog No.M0208)。在加入反應混合物之前，將小珠超聲10秒。反應混合物進行溫度循環(huán)，從50℃、5分鐘開始，ASO和LSO探針在靶序列上雜交和連接，Z1或Z2寡核苷酸在合成模板上連接ASO探針。然后提高溫度到85℃、15秒，以便將探針與靶序列變性，并將合成模板與探針和寡核苷酸變性。此循環(huán)重復100次。溫度循環(huán)完成后，將小珠在0.1％Tween-20 PBS緩沖液中85℃清洗3次。
連接反應后，將約10×106、1μm直徑的鏈親和素包被的磁性小珠與反應混合物混合。小珠購自Seradyn Inc.，由帶有40％磁鐵礦(Fe3O4)的聚苯乙烯組成，密度為1.5g/cm3，并具有鏈親和素包被(105-106鏈親和素分子/小珠)。使用前利用0.1％Tween-20和0.1％BSA的PBS緩沖液將磁性小珠清洗5次，并超聲15秒。用于使磁性小珠結合生物素分子的結合緩沖液是20μl體積含0.1％Tween-20的PBS(10μl來自連接反應的反應混合物，10μl磁性小珠)。20μl體積的磁性小珠和來自連接反應的反應混合物形成結合混合物，在管中室溫(25℃)溫育2小時，不斷搖動小管。如果磁性小珠上的鏈親和素結合到LSO上的生物素，則形成小珠對。
結合混合物溫育后超聲10秒。將結合混合物吸到位于第二只管中的第一只管，第二只管充滿6X SSC(90mM檸檬酸鈉、0.9M NaCl，pH7.0)和0.1％牛血清白蛋白(New England Biolabs)的高密度溶液(～1.3g/cm3)。第一只管沒有管底，以便部分充滿高密度溶液。結合混合物的較低密度(～1.05g/cm3)結合緩沖液保持在較高密度流體的上部，而不明顯混合。位于管下方的磁體將磁性小珠吸引到第二只管的底部。
未與磁性小珠配對的Luminex小珠仍然朝向第一只管上部，通過將第一只管從第二只管中移出而棄去。將第一只管頂部蓋住，然后從第二只管中提起第一只管而移出。然后從磁體上釋放由磁性小珠帶下來的處于可檢測復合物中的Luminex小珠，渦旋為均一溶液。然后將該均一溶液吸入流式細胞儀。每次一個讀取Luminex小珠，利用小珠(B1或B2)上的獨特編碼確定其身份。幾乎所有Luminex小珠是B1小殊，表明存在對應ASO1的SNP(數(shù)據(jù)略)。
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<223>合成寡核苷酸<400>1tacggatgct cactacgcta ggtttttttt tttttttttt 40<210>2<211>40<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>2tttttttttt tttttttttt atgcctcgtg actgctacca 40<210>3<211>80<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>3aaaaaaaaaa aaaaaaaacc tagcgtagtg agcatccgta tggtagcagt cacgaggcat 60aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 80<210>4<211>80<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>4tttttttttt tttttttttt atgcctcgtg actgctacca tacggatgct cactacgcta 60
ggtttttttt tttttttttt 80<210>5<211>36<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>5gctgatgcta ctggatcgct accgtgaccc ttccga 36<210>6<211>38<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>6gcttgcctgc tcgacttaga aatcggtctc gtccttca 38<210>7<211>38<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>7gcgtaatcgt tgcttcatag cctggcagta aattctag 38<210>8<211>37<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>8acagcagtga gtctttaggc ctggcagtaa attctac 37<210>9<211>36<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>9ctatgaagca acgattacgc tcggaagggt cacggt 36<210>10<211>37<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>10cctaaagact cactgctgtt gaaggacgag accgatt 37<210>11<211>38<212>DNA<213>人工<220>
<223>合成寡核苷酸<400>11ctcaacctta cttgaggctg gtagcagtca cgaggcat 38
權利要求
1.定量靶物質的方法，其包括形成反應混合物，其中包含可能含有靶物質的樣品；可編碼的標記；一種或多種靶特異性探針，其中每種靶特異性探針在選擇性結合條件下特異性結合靶物質；以及分離成分；在反應條件下處理反應混合物，以便在靶物質存在時產生可檢測的復合物，并且其中可檢測的復合物包含可編碼標記、靶特異性探針和分離成分；以及通過計數(shù)可編碼標記，定量靶物質。
2.權利要求1的方法，其還包括在處理反應混合物之后、定量靶物質之前，將可檢測復合物與不包括在可檢測復合物中的可編碼標記分離。
3.定量至少兩種不同的特定靶物質的方法，其包括形成反應混合物，其中包含可能包含兩種或多種不同特定靶物質的樣品；特異性針對每種不同特定靶物質的不同的可編碼的標記；特異性針對每種不同特定靶物質的一種或多種不同靶特異性探針，其在選擇性結合條件下特異性結合靶物質；以及分離成分；在反應條件下處理反應混合物，以便在特定靶物質存在時產生可檢測的復合物，其中包含特定靶物質特異性的可編碼標記、特定靶物質特異性的靶特異性探針和分離成分；以及通過計數(shù)每種不同特定靶物質特異性的可編碼標記，定量每種不同特定靶物質。
4.權利要求3的方法，其還包括在處理反應混合物之后、定量每種不同特定靶物質之前，將所產生的任何可檢測復合物與不包括在可檢測復合物中的可編碼標記分離。
5.定量樣品中至少兩種不同靶核酸序列的方法，其包括將樣品與特異性針對至少兩種不同靶核酸序列中每一種的不同探針組合相混合，形成連接反應混合物，每一探針組合包含(a)至少一種包含磁性顆粒及第一種靶特異性探針的分離小珠，以及(b)至少一種包含可編碼標記及第二種靶特異性探針的檢測小珠；其中在互補靶序列上彼此相鄰雜交時，每一組合中的靶特異性探針適合于連在一起；使連接反應混合物進行連接反應，其中相鄰雜交的互補靶特異性探針彼此連接，形成包含分離小珠及檢測小珠的連接產物；以及通過計數(shù)每種不同靶核酸序列的可編碼標記，定量至少兩種不同靶核酸序列中的每一種。
6.權利要求5的方法，在處理反應混合物之后、定量至少兩種不同靶核酸序列中的每一種之前，將任何連接產物與未連接的分離小珠及檢測小珠分離。
7.權利要求6的方法，其中將連接產物與未連接的檢測及分離小珠分離包括將連接產物與靶核酸序列分離，以及將連接產物與樣品分離。
8.檢測樣品中至少兩種不同靶核酸序列的方法，其包括將樣品與特異性針對至少兩種不同靶核酸序列中每一種的不同小珠組合相混合，形成連接反應混合物，每一小珠組合包含(a)至少一種包含磁性顆粒、包含至少兩種標記的可編碼標記以及第一種靶特異性探針的分離小珠，其中第一種可編碼標記特異性針對第一種靶特異性探針，以及(b)至少一種包含含有至少兩種標記的第二種可編碼標記以及第二種靶特異性探針的檢測小珠，其中第二種可編碼標記特異性針對第二種靶特異性探針；其中第一種可編碼標記與第二種可編碼標記可檢測地不同；其中在互補靶序列上彼此相鄰雜交時，每一組合中的靶特異性探針適合于連在一起；使連接反應混合物進行連接反應，其中相鄰雜交的互補靶特異性探針彼此連接，形成包含分離小珠及檢測小珠的可檢測復合物；以及通過定量該可檢測復合物來定量樣品中的至少兩種不同靶核酸序列。
9.權利要求6-8中任一項的方法，其中分離連接產物與靶核酸序列包括熱變性。
10.權利要求9的方法，還包括在定量靶核酸序列之前去除未處于連接產物中的任何分離小珠。
11.權利要求10的方法，其中去除未處于連接產物中的任何分離小珠包括將任何分離小珠及連接產物置于密度梯度中，其中該分離小珠及連接產物的密度不同；以及去除未處于連接產物中的任何分離小珠。
12.權利要求5-11中任一項的方法，其中可編碼標記具有第二種靶特異性探針特異性的強度水平。
13.權利要求12的方法，其中該分離小珠還包含第二種可編碼標記，并且其中第二種可編碼標記具有第一種靶特異性探針特異性的強度水平。
14.權利要求13的方法，其中靶核酸序列特異性的至少兩種探針組合的每一種均包含具有相同發(fā)射譜的可編碼標記。
15.權利要求1-14中任一項的方法，其中該可編碼標記是一種或多種量子點。
16.權利要求5-14中任一項的方法，其中該可編碼標記是一種或多種量子點，并且其中每一探針組合的檢測小珠包含至少1,000量子點，其中量子點具有使該檢測小珠可與不同的檢測小珠相區(qū)分的預定波長。
17.權利要求16的方法，其中該分離小珠還包含至少1,000量子點，其中量子點具有使該分離小珠可與不同的分離小珠相區(qū)分的預定波長。
18.權利要求5-14、16和17中任一項的方法，其中在檢測容器中定量樣品中至少兩種靶核酸序列，該檢測容器接近磁源的一個表面上包含凹槽，其中分離小珠適合凹槽中，而檢測小珠不適合凹槽中，并排列被吸引到磁源的連接產物。
19.權利要求5-14和16-18中任一項的方法，其中該連接反應混合物還包含連接劑。
20.權利要求19的方法，其中該連接劑是連接酶。
21.權利要求19的方法，其中該連接劑是熱穩(wěn)定性連接酶。
22.權利要求21的方法，其中該熱穩(wěn)定性連接酶選自Tth連接酶、Taq連接酶和Pfu連接酶中的至少一種。
23.權利要求5-14和16-22中任一項的方法，其中每種分離小珠與每種檢測小珠的密度不同，以致任何未處于連接產物中的分離小珠與連接產物之間的距離可使連接產物被吸引到磁性裝置，而不使未處于連接產物中的分離小珠被吸引到磁性裝置。
24.權利要求23的方法，其中在樣品存在下進行連接產物的定量。
25.權利要求1-24中任一項的方法，其中該可編碼標記包含至少兩種磷光體。
26.權利要求1-24中任一項的方法，其中該可編碼標記包含至少兩種熒光分子。
27.權利要求8的方法，其還包括在連接反應之后、定量至少兩種不同靶核酸序列之前，將可檢測復合物與未連接的檢測和分離小珠分離。
28.權利要求27的方法，其中分離可檢測復合物與未連接的檢測及分離小珠包括將可檢測復合物與至少兩種不同靶核酸序列分離，以及將可檢測復合物與樣品分離。
29.權利要求28的方法，其中分離可檢測復合物與至少兩種不同靶核酸序列包括熱變性。
30.權利要求29的方法，其還包括在定量至少兩種不同靶核酸序列之前去除未處于可檢測復合物中的任何分離小珠。
31.權利要求30的方法，其中去除未處于可檢測復合物中的任何分離小珠包括將任何分離小珠及可檢測復合物置于密度梯度中，其中該分離小珠及可檢測復合物的密度不同；以及去除未處于可檢測復合物中的任何分離小珠。
32.權利要求5-14和16-31中任一項的方法，其中該檢測小珠還包含磁性顆粒。
33.權利要求32的方法，其中在檢測容器中定量樣品中至少兩種靶核酸序列，該檢測容器接近磁源的表面包含凹槽，其中凹槽包含第一端和第二端，并且其中可檢測復合物中的第一種可編碼標記和第二種可編碼標記在凹槽中沿磁源排列，以致可檢測復合物中的分離小珠較之可檢測復合物中的檢測小珠更接近于第一端排列。
34.檢測樣品中靶核酸序列的試劑盒，其包含特異性針對每種靶核酸序列的不同小珠組合，該小珠組合包含(a)至少一種包含磁性顆粒、包含兩種或多種標記的第一種可編碼標記以及第一種靶特異性探針的分離小珠，其中第一種可編碼標記特異性針對第一種靶特異性探針，以及(b)至少一種包含含有兩種或多種標記組合的第二種可編碼標記以及第二種靶特異性探針的檢測小珠，其中第二種可編碼標記特異性針對第二種靶特異性探針；其中第一種可編碼標記與第二種可編碼標記可檢測地不同；并且其中在互補靶序列上彼此相鄰雜交時，每一組合中的靶特異性探針適合于連在一起。
35.權利要求34的試劑盒，其還包含連接劑。
36.權利要求35的試劑盒，其中該連接劑是連接酶。
37.權利要求35的試劑盒，其中該連接劑是熱穩(wěn)定性連接酶。
38.權利要求37的試劑盒，其中該熱穩(wěn)定性連接酶選自Tth連接酶、Taq連接酶和Pfu連接酶中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測樣品中靶物質的方法和組合物。
文檔編號C12N9/22GK1608139SQ02825971
公開日2005年4月20日 申請日期2002年11月21日 優(yōu)先權日2001年11月21日
發(fā)明者C·S·范恩, 勞開勤, M·里德 申請人:艾普勒拉公司