專利名稱：睪丸肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及睪丸和附睪中參與肉堿和其類似物的鈉依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)的基因以及由所述基因編碼的多肽。
背景技術(shù)：
肉堿對生物體內(nèi)每個器官中脂肪酸的β-氧化具有重要的功能。每個器官的細(xì)胞由于脂肪酸β-氧化而在線粒體中產(chǎn)生ATP(腺苷三磷酸)，它是細(xì)胞的能量來源。脂肪酸的?；ㄟ^肉堿的作用在線粒體中轉(zhuǎn)化形成?；鵆o-A，然后?；鵆o-A進(jìn)行β-氧化產(chǎn)生ATP。很多肉堿是食物由來的，并且雖然一部分是在肝臟和大腦中生物合成的，但是幾乎所有細(xì)胞都需要從外界攝取肉堿；因此，根據(jù)從前的生理研究，人們猜測肉堿特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白存在于細(xì)胞膜中。
通過使用采取摘除的器官的灌注法的試驗系統(tǒng)或者分離細(xì)胞膜泡囊系統(tǒng)已經(jīng)對多種細(xì)胞進(jìn)行了肉堿攝取研究。但是，通過傳統(tǒng)方法，很難詳細(xì)分析穿過細(xì)胞膜的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，因此需要分離和分析轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白本身。
大鼠CT1(Sekine，T.等人，Biochem.Biophis.Res.Commun.，251卷，586-591頁，1998)已經(jīng)作為肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被分離出來。hOCTN2(Tamai，I.等人，J.Biol.Chem.，Vol.273，pp.20378-20382，1998)已被報道為CT1的人同源基因。肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白廣泛分布于全身的各個器官，參與多種細(xì)胞的肉堿攝取。它們也存在于腎臟中用于發(fā)揮從腎小管重新吸收肉堿的功能。
根據(jù)從前的研究，已經(jīng)證明在生物體內(nèi)的睪丸和附睪中肉堿濃度是最高的，根據(jù)肉堿的種類達(dá)到血清水平的2,000倍。因為，附睪的管是控制精子營養(yǎng)和成熟的器官，肉堿和精子功能的關(guān)系受到了廣泛的關(guān)注。
已經(jīng)證明在睪丸中產(chǎn)生的精子在該階段是不成熟的并且運(yùn)動活性低，而且缺乏受精能力。離開睪丸的精子移動到附睪中并在其中進(jìn)行多種修飾并成熟。另外，精子鞭毛運(yùn)動對于精子的受精是必須的，而且需要大量能量。因此有理由認(rèn)為大量肉堿對于ATP的產(chǎn)生是必須的，ATP是精子鞭毛運(yùn)動的能量來源。
實(shí)際上，已經(jīng)報道過揭示人精液中肉堿濃度和精子數(shù)量以及運(yùn)動活性之間正相關(guān)的研究。而且，在臨床醫(yī)學(xué)上，也已經(jīng)報道了肉堿給藥引起特發(fā)性男性不育患者受精能力的提高。
因此，特異于睪丸和附睪的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)被認(rèn)為在精子成熟和受精中有重要的功能，并且通過使用采取摘除的器官的灌注法的試驗系統(tǒng)或者分離細(xì)胞膜泡囊系統(tǒng)進(jìn)行了研究。雖然從研究中已經(jīng)證實(shí)了活性肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的存在，但是其分子物質(zhì)尚未明確。
在腎臟，肝臟，大腦和胎盤的藥物運(yùn)輸中有重要作用的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OAT1(有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1)(Sekine，T等人，J.Bio.Chem.，Vol.272，pp.18526-18529，1997)，OAT1(Sekine，T.，F(xiàn)EBSLetter，.，Vol.429，pp.179-182，1998)，OTA3(Kusuhara，H.等人，J.Bio.Chem.，Vol.274，pp.13675-13680，1999)，和OTA4(Cha，S.H.等人，J.Bio.Chem.，Vol.275，pp.4507-4512，2000)，已經(jīng)被本發(fā)明的一些發(fā)明者分離并報道。這些屬于OAT家族的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為能夠轉(zhuǎn)運(yùn)化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的多種有機(jī)陰離子也轉(zhuǎn)運(yùn)不同陰離子藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
近來，識別有機(jī)陽離子的OCT(有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)家族已經(jīng)被鑒定。因為肉堿為既具有正電荷也具有負(fù)電荷的有機(jī)離子，所以有人認(rèn)為從分子進(jìn)化的角度肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為介于OAT家族和OCT家族之間的蛋白。
鑒于這些事實(shí)，本發(fā)明的發(fā)明者推測特異于睪丸和附睪的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白屬于有機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族。
本發(fā)明的公開本發(fā)明的一個目的就是鑒定和提供一種新的參與睪丸和附睪中肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，以及一種肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，所述肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為由所述基因編碼的多肽。


圖1顯示了通過注射了人CT2基因的cRNA的卵母細(xì)胞的肉堿攝取試驗的結(jié)果(A)和時間依賴性(B)。
圖2顯示了通過注射了人CT2基因的cRNA的卵母細(xì)胞的肉堿攝取的Michaelis-Menten動態(tài)試驗的結(jié)果(A)和由CT2轉(zhuǎn)運(yùn)L-肉堿的D-肉堿抑制試驗的結(jié)果(B)。
圖3顯示了對于通過注射了人CT2基因的cRNA的卵母細(xì)胞的肉堿攝取試驗，添加鹽的影響結(jié)果(A)，以及pH的影響結(jié)果(B)。
圖4顯示了添加肉堿類似物對通過注射了人CT2基因的cRNA的卵母細(xì)胞的肉堿攝取試驗系統(tǒng)的影響。
圖5是代替圖片的照片，顯示了通過northern印跡方法在人器官中的CT2基因mRNA表達(dá)的分析結(jié)果。
圖6是代替圖片的照片，顯示了在睪丸和附睪中CT2蛋白表達(dá)的免疫組化分析結(jié)果。
圖7顯示了CT2基因的人基因組的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明涉及(1)一種能夠轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿或者其類似物的蛋白，包括由SEQ ID NO.1表示的氨基酸序列或者通過所述氨基酸序列中一個或多個氨基酸的缺失，取代或者添加而得到的氨基酸序列。
而且本發(fā)明涉及(2)一種編碼上述蛋白的基因。
另外本發(fā)明涉及(3)一種基因，包括具有由SEQ ID NO.1表示的堿基序列的DNA或者編碼與上述DNA在嚴(yán)格條件下雜交，并且能夠以鈉依賴方式轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿及其類似物的蛋白的DNA。
另外，本發(fā)明還涉及(4)一種表達(dá)載體，具有上述基因或者編碼所述基因的蛋白的基因。
而且，本發(fā)明涉及(5)一種由上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
另外，本發(fā)明涉及(6)一種核苷酸，包括由SEQ ID NO.1代表的堿基序列的連續(xù)14個或者更多個堿基的部分序列或者其互補(bǔ)序列。
另外，本發(fā)明涉及(7)一種探針，包括上述核苷酸并檢測編碼能夠以鈉依賴方式轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿及其類似物的蛋白的基因。
另外，本發(fā)明涉及(8)一種通過利用上述核苷酸調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方法，所述基因編碼能夠以鈉依賴方式轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿及其類似物的蛋白。
此外，本發(fā)明涉及(9)一種針對(1)中所定義蛋白的抗體。
此外，本發(fā)明涉及(10)一種通過利用(1)中所定義的蛋白檢測受試材料作為底物對所述蛋白的以鈉依賴方式轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿及其類似物的能力的作用。
此外，本發(fā)明涉及(11)一種通過利用所述蛋白、其特異性抗體、其啟動子或者抑制劑調(diào)節(jié)所述蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿及其類似物的能力，來調(diào)節(jié)由(1)所定義的蛋白在睪丸和附睪中轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿及其類似物的動態(tài)的方法。
另外，本發(fā)明涉及(12)一種通過利用所述蛋白、其特異性抗體、其啟動子或者抑制劑調(diào)節(jié)所述蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿及其類似物的能力，來調(diào)節(jié)由(1)所定義的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的肉堿及其類似物對于精子細(xì)胞的影響的方法。
另外，本發(fā)明涉及(13)一種通過利用所述蛋白、其特異性抗體、其啟動子或者抑制劑調(diào)節(jié)所述蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿及其類似物的能力，來調(diào)節(jié)由(1)所定義的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的肉堿及其類似物對于精子受精能力的影響的方法。
本發(fā)明還涉及(14)一種通過利用所述蛋白、其特異性抗體、其啟動子或者抑制劑，使蛋白在特定細(xì)胞中過量表達(dá)、或者調(diào)節(jié)細(xì)胞中現(xiàn)存的所述蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿及其類似物的能力，來檢測或者調(diào)節(jié)由(1)所定義的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的肉堿及其類似物對于精子細(xì)胞受精或者個體受精能力的影響的方法。
換言之，本發(fā)明的發(fā)明者分離了4種如上所述的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OAT1，OAT2，OAT3和OAT4。這些有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列彼此同源性為大約40％。本發(fā)明的發(fā)明者基于這些序列調(diào)查了EST(表達(dá)的序列標(biāo)記)數(shù)據(jù)庫，鑒定了一種新的cDNA片段，所述片段和OAT1，OAT2，OAT3和OTA4同源。利用所述cDNA片段，本發(fā)明的發(fā)明者已經(jīng)鑒定了一種新克隆(CT2)，所述克隆根據(jù)人睪丸cDNA文庫還未報道，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CT2具有通過細(xì)胞膜從一個細(xì)胞到另一個細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)L-肉堿及其類似物的能力，以及與屬于OAT家族或者OCT家族的其他藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白比較，具有窄的底物選擇性。
本發(fā)明的蛋白包括具有SEQ ID NO.1表示的氨基酸序列的蛋白或者具有通過缺失，取代或者添加一個到多個氨基酸從所述氨基酸序列衍生的氨基酸序列的蛋白。缺失，取代或者添加氨基酸的量可以是使得有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性不失去的程度，氨基酸的量通常從大約1到大約110，優(yōu)選從1到大約55。每種這些蛋白的氨基酸序列和由SEQ IDNO.1表示的氨基酸序列的同源性通常為75％，優(yōu)選90％。
本發(fā)明的基因包括含有具有由SEQ ID NO.1表示的堿基序列的DNA的基因，以及包括含有編碼一種蛋白的DNA的基因，所述蛋白與具有由SEQ ID NO.1表示的堿基序列的DNA在嚴(yán)格條件下雜交，并且能夠以鈉依賴的方式轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿及其類似物。
在本發(fā)明的嚴(yán)格條件下雜交可以是在5×SSC(標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽)雜交液或者在鹽濃度等同于5×SSC的雜交液中在從37℃到42℃的溫度條件下，進(jìn)行約12個小時，然后用5×SSC溶液或者鹽濃度等同于5×SSC的溶液進(jìn)行預(yù)洗滌，然后用0.1×SSC溶液或者鹽濃度等同于0.1×SSC的溶液進(jìn)行洗滌。通過用1×SSC溶液或者鹽濃度為1×SSC的溶液進(jìn)行洗滌可以達(dá)到較高的嚴(yán)格性。
本發(fā)明的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和蛋白可利用合適哺乳動物的器官，組織，或者培養(yǎng)細(xì)胞作為基因來源通過篩選得以分離和獲得。哺乳動物包括非人類的動物；諸如狗，牛，馬，山羊，羊，猴子，豬，兔子，大鼠，和小鼠；以及人。
基因的篩選和分離優(yōu)選通過同源篩選，PCR篩選等進(jìn)行。
獲得的cDNA的堿基序列可以通過常用方法進(jìn)行確定以分析翻譯區(qū)，從而確定由堿基序列編碼的蛋白，CT2的氨基酸序列。
例如利用下列方法，可以證實(shí)，獲得的cDNA為肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的cDNA，換言之，在cDNA中編碼的基因產(chǎn)物為肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
通過將從CT2cDNA制備而來的cRNAcRNA導(dǎo)入卵母細(xì)胞并表達(dá)以及利用常規(guī)的攝取試驗測定攝取到細(xì)胞中的底物(Sekine，T等人，Biochem.Biophis.Res.Commun.，Vol.251，pp.586-591，1998)，可以證明將肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)(攝取)到細(xì)胞中的能力，其中肉堿用作底物。
而且也可以通過將類似攝取試驗應(yīng)用于表達(dá)細(xì)胞來研究CT2的轉(zhuǎn)運(yùn)特性以及底物選擇性。
另外，也可以通過將類似攝取試驗應(yīng)用于表達(dá)細(xì)胞來研究CT2的特性，諸如時間依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)，鈉依賴性，底物選擇性，以及pH依賴性。
通過利用獲得的CT2基因的cDNA篩選合適的從不同基因來源制備的cDNA文庫或者基因組DNA文庫，有可能分離來自不同組織或者不同器官的同源基因，染色體基因等等。
而且，通過利用基于本發(fā)明公開的基因堿基序列(由SEQ ID NO.1所代表的或者其部分)信息設(shè)計的合成引物，有可能根據(jù)常規(guī)PCR的方法從cDNA文庫分離基因。
諸如cDNA文庫和基因組DNA文庫的DNA文庫可以通過所述方法進(jìn)行制備。例如，方法描述于分子克隆(Molecular Cloning)由Sambrook.J.，F(xiàn)ritsh，E.F.和Maniatis，T.所著T由冷泉港實(shí)驗室出版社在1989年出版發(fā)行?；蛘?，如果能買到，可以使用市售文庫。
為了獲得CT2基因的人基因組結(jié)構(gòu)，利用獲得的CT2基因的cDNA篩選基因組DNA文庫以分析通過篩選獲得的克隆?；蛘?，可以利用基于公開發(fā)表的人基因組分析結(jié)果信息的同源性搜索程序進(jìn)行檢索。
本發(fā)明的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CT2)可以通過利用例如編碼肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的cDNA的基因重組技術(shù)制備。例如，編碼肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的DNA(諸如cDNA)整合到合適的表達(dá)載體，諸如質(zhì)粒載體，噬菌體載體，以及病毒載體，以將獲得的重組DNA導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞。產(chǎn)生多肽的表達(dá)系統(tǒng)(宿主載體系統(tǒng))包括細(xì)菌，真菌，昆蟲細(xì)胞，哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)。在上述表達(dá)系統(tǒng)中，優(yōu)選利用昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞用于獲得功能蛋白。
例如，當(dāng)在哺乳動物中表達(dá)多肽時，編碼肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的DNA插入到合適表達(dá)載體(諸如，質(zhì)粒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒為基礎(chǔ)的載體，乳頭瘤病毒載體，痘苗病毒載體，以及SV40為基礎(chǔ)的載體)中合適啟動子(諸如SV40啟動子，LTR啟動子，以及延長1α啟動子)的下游，以構(gòu)建表達(dá)載體。因此，合適的動物細(xì)胞通過獲得的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基中產(chǎn)生目的多肽。宿主哺乳動物細(xì)胞包括猴COS-7細(xì)胞，中國倉鼠CHO細(xì)胞，人Hela細(xì)胞或者來自腎臟組織的原代培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞株，豬腎臟來源的LLC-PK1細(xì)胞，負(fù)鼠腎臟來源的OK細(xì)胞，小鼠來源的近曲小管S1，S2和S3細(xì)胞等。
編碼肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CT2的cDNA的例子包括但不限于，具有由SEQ ID NO.1代表的堿基序列的cDNA，而且相應(yīng)于氨基酸序列以及編碼多肽的DNA也可以用作cDNA。在這種情況下，已知一種氨基酸由1到6種密碼子編碼，以及所使用的密碼子可以隨意選擇，但是優(yōu)選設(shè)計的序列根據(jù)宿主利用密碼子表達(dá)的頻率能夠高水平表達(dá)。具有所設(shè)計堿基序列的DNA通過DNA的化學(xué)合成獲得，連同上述cDNA的片段，堿基序列的部分改變等等。堿基序列的人工部分變化以及突變的引入可以通過公開于Mark，D.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.18，pp.5662-5666，1984的位點(diǎn)特異性突變，利用由編碼目的變異的合成寡核苷酸組成的引物進(jìn)行。
在嚴(yán)格條件下可以和本發(fā)明肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因雜交的核苷酸(寡核苷酸或者多核苷酸)可以用作檢測肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的探針，也可作為反義寡核苷酸，核酶，或者誘導(dǎo)調(diào)節(jié)肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)。核苷酸包括含有由SEQ ID NO.1代表的堿基序列的連續(xù)14個或者更多堿基的部分序列，或者其互補(bǔ)序列，以及為了增強(qiáng)雜交特異性，諸如包括20或者更多個堿基以及30或者更多個堿基的較長序列也可以用作部分序列。
另外，通過使用本發(fā)明的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或者免疫學(xué)上等效的多肽，可以獲得其抗體，抗體可用于肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的檢測和純化?？梢岳帽景l(fā)明的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白片段或者部分序列的合成肽作為抗原生產(chǎn)抗體。可以通過將抗體接種給宿主動物(諸如大鼠和兔子)并回收抗血清的常規(guī)方法產(chǎn)生多克隆抗體，并且可以通過常規(guī)雜交瘤等方法產(chǎn)生單克隆抗體。
通過利用本發(fā)明的蛋白，可以檢測受試材料作為底物對所述蛋白的以鈉依賴方式轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿及其類似物的能力的作用。
另外，通過利用所述蛋白、其特異性抗體、其啟動子(例如激素，諸如雄激素)，或者其抑制劑(諸如反義核苷酸)調(diào)節(jié)本發(fā)明蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿及其類似物的能力，可以調(diào)節(jié)睪丸和附睪中由所述蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的肉堿及其類似物的動態(tài)。
另外，通過利用所述蛋白、其特異性抗體、其啟動子(例如激素諸如雄激素)，或者其抑制劑(諸如反義核苷酸)調(diào)節(jié)本發(fā)明蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿及其類似物的能力，可以調(diào)節(jié)由所述蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的肉堿及其類似物對精子受精能力的影響。
通過利用所述蛋白、其特異性抗體、其啟動子(例如激素，諸如雄激素)，或者其抑制劑(諸如反義核苷酸)調(diào)節(jié)本發(fā)明蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿及其類似物的能力，可以調(diào)節(jié)由所述蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的肉堿及其類似物對精子或者個體受精能力的影響。
此外，通過使本發(fā)明的蛋白在特定細(xì)胞過量表達(dá)，或者通過利用所述蛋白、其特異性抗體、其啟動子(例如激素，諸如雄激素)，或者其抑制劑(諸如反義核苷酸)調(diào)節(jié)在一個細(xì)胞中現(xiàn)存的所述蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿及其類似物的能力，可以檢測或者調(diào)節(jié)由所述蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的肉堿及其類似物對精子或者個體受精能力的影響。
實(shí)施例本發(fā)明隨后將通過實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述，但是并不限于這些實(shí)施例。
注意在下列實(shí)施例中的操作將根據(jù)描述于分子克隆(MolecularCloning)Sambrook.J.，F(xiàn)ritsh，E.F.和Maniatis，T著冷泉港實(shí)驗室出版社在1989年出版發(fā)行的方法進(jìn)行，除非另有說明，當(dāng)利用市售試劑盒時，根據(jù)其說明書進(jìn)行操作。
實(shí)施例1分離和分析特異于睪丸和附睪的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CT2)的cDNA基于由本發(fā)明的部分發(fā)明者分離的OAT1，OAT2，OAT3，OAT4以及CT1的堿基序列信息，搜索公開發(fā)表的EST數(shù)據(jù)庫。搜索結(jié)果顯示，獲得與OAT1，OAT2，OAT3，OAT4以及CT1同源的一新的cDNA片段AA778598。
通過使用32P標(biāo)記的AA778598探針，篩選提前制備的人睪丸cDNA文庫。在雜交液中50℃雜交一整天，然后用0.1×SSC(標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽)/0.1％SDS(十二烷基硫酸鈉)在50℃清洗濾膜。作為雜交液的緩沖溶液pH為6.5，含有50％甲酰胺，5×SSC，3×Denhard液，0.2％SDS，10％葡聚糖硫酸酯，0.2mg/ml的變性鮭精DNA，2.5mM的焦磷酸鈉，25mM的MES，以及0.01％的消泡劑B(泡沫抑制劑，由Sigma-Aldrich，Co生產(chǎn))。在λZipLox中分離的克隆通過體外剪切方法亞克隆到質(zhì)粒載體pZL1中。結(jié)果獲得具有肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)活性的一新cDNA(CT2cDNA)。
通過上述操作獲得的cDNA(CT2cDNA)堿基序列的測定由自動測序儀(Applied Biosystem的產(chǎn)品)利用特定引物(參見SEQ ID NO.1)進(jìn)行。
隨后，從含有CT2cDNA的質(zhì)粒通過使用T7RNA聚合酶(參見(Sekine，T等人，J.Bio.Chem.，Vol.272，PP.18526-18529，1997)體外制備cRNA(互補(bǔ)于cDNA的RNA)。
這樣獲得的cRNA根據(jù)報道的方法注入恒河豚卵母細(xì)胞(參見(Sekine，T等人，J.Bio.Chem.，Vol.272，pp.18526-18529，1997))，在卵母細(xì)胞中進(jìn)行放射性標(biāo)記的L-肉堿攝取試驗。結(jié)果，證實(shí)表達(dá)CT2的卵母細(xì)胞表現(xiàn)出圖1A所示的3H-L-肉堿攝取。相比之下，代表有機(jī)陰離子的14C-PAH(對氨基馬尿酸)和代表有機(jī)陽離子的14C-TEA(四乙銨)的攝取沒有被觀察到。
下文，轉(zhuǎn)運(yùn)功能分析，底物選擇性研究，基因表達(dá)分析，對由該基因編碼的蛋白在睪丸和附睪中的免疫研究，以及人基因組中CT2基因的結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果將按順序進(jìn)行描述，所有這些分析和研究都利用本發(fā)明的CT2進(jìn)行。
(1)CT2的時間依賴性肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)試驗作為試驗結(jié)果，表達(dá)CT2的卵母細(xì)胞表現(xiàn)出如圖1B所示的時間依賴性3H-L-肉堿攝取。從這個結(jié)果證實(shí)，CT2不僅和肉堿結(jié)合而且作為細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
(2)CT2的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)的米-曼(Michaelis-Menten)動態(tài)試驗。
由CT2進(jìn)行的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)的濃度依賴性根據(jù)調(diào)查多種濃度肉堿被CT2攝取量的變化進(jìn)行研究。通過利用注入了CT2cRNA的卵母細(xì)胞和根據(jù)上述方法進(jìn)行放射性標(biāo)記肉堿的攝取試驗。結(jié)果(圖2A)，L-肉堿攝取的Km值為大約20.3μM。
(3)作為L-肉堿異構(gòu)體的D-肉堿對于CT2的L-肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)的影響研究。
如圖2B所示，D-肉堿以濃度依賴的方式抑制CT2的L-肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)。Ki值為大約30.1μM。
(4)肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)中CT2的鈉依賴性的研究。
當(dāng)細(xì)胞外鈉用鋰和N-甲基-D-葡糖胺取代時，CT2的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)降低顯示CT2是細(xì)胞外鈉依賴的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(圖3A)。但是當(dāng)細(xì)胞外鈉用鋰和N-甲基-D-葡糖胺取代時，攝取并未完全降低，因此反映出CT2依賴于部分細(xì)胞外鈉。
(5)肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)中CT2的pH依賴性的研究。
如圖3B所示，當(dāng)細(xì)胞外pH降到酸性時，CT2的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)降低。
(6)為了進(jìn)一步研究CT2的底物選擇性，在由注入了CT2cRNA的卵母細(xì)胞的3H-肉堿攝取試驗系統(tǒng)中，多種肉堿類似物加入到系統(tǒng)中，并研究其影響(抑制試驗)。
根據(jù)上述方法，利用注入了CT2cRNA卵母細(xì)胞進(jìn)行3H-肉堿攝取試驗。在存在或者不存在5μM或者50μM多種化合物(未標(biāo)記)的條件下測定50nM的3H-肉堿的攝取。結(jié)果，多種肉堿類似物(D-肉堿，乙酰L-肉堿，乙酰DL-肉堿，辛酰L-肉堿，甜菜堿等)顯著抑制CT2的3H-肉堿的轉(zhuǎn)運(yùn)(圖4)。另外，陰離子物質(zhì)和陽離子物質(zhì)諸如對氨基馬尿酸和四乙銨沒有表現(xiàn)抑制效果(圖4)。從上述結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，CT2是肉堿及其類似物的特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
(7)人組織中CT2基因的表達(dá)(Northern印跡)的分析。
全長CT2cDNA用32P-dCTP標(biāo)記，并用作探針，對提取自多種人組織的濾膜(Clontech產(chǎn)品)印跡RNA進(jìn)行雜交。在含有全長CT2cDNA的雜交液中過夜雜交，并用含有0.1％SDS的0.1×SSC在65℃清洗濾膜。Northern印跡結(jié)果顯示，僅僅在睪丸中檢測到明顯的條帶(圖5)。
(8)睪丸和附睪中由CT2基因編碼的蛋白的免疫學(xué)研究。
合成含有CT2蛋白C端的14個氨基酸殘基的多肽，免疫兔子獲得抗血清。將人睪丸石蠟切片去石蠟并用3％過氧化氫溶液處理以使內(nèi)源性過氧化物酶失活。該切片和親和純化的多克隆抗-CT2抗體(初級抗體)一起溫育24小時，然后與用過氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG抗體反應(yīng)。最終，通過加入過氧化物酶的底物二氨基聯(lián)苯胺，獲得的棕色沉淀點(diǎn)利用光學(xué)顯微鏡被觀察到。如圖6所示，在睪丸支持細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，以及附睪上皮細(xì)胞的腔側(cè)觀察到明顯的染色(圖6中的箭頭顯示CT2表達(dá)位點(diǎn))。因此，CT2就是在睪丸的支持細(xì)胞中提供肉堿的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并從血液向附睪的腔內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿。
(9)人基因組中CT2基因結(jié)構(gòu)的分析。
利用同源性搜索程序搜索公開發(fā)表的人基因組分析結(jié)果信息找到CT2基因的外顯子結(jié)構(gòu)。如圖7所述，CT2基因由10個外顯子構(gòu)成，起始密碼子位于第二個外顯子中。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明特異于睪丸和附睪選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其基因能夠在體外研究肉堿及其類似物在所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)部位的轉(zhuǎn)運(yùn)，同時基于本研究預(yù)測在生殖器官中所述化合物的動態(tài)。肉堿是用于產(chǎn)生精子運(yùn)動性和受精能力所必需能量的重要因素，而且認(rèn)為所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的發(fā)明將有助于未來闡明先天性男性不育的原因。另外，通過解釋調(diào)節(jié)所述轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的控制因子，本發(fā)明可用于發(fā)展調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿能力的方法，以及發(fā)展調(diào)節(jié)精子受精能力的方法。
序列表<110>人體細(xì)胞組織有限公司(Human Cell Systems，Inc.)<120>睪丸肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其基因(Testicular carnitine transporter and gene thereof)<130>SCT032830-25<150>JP 2001-161212<151>2001-05-29<160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2048<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(285)..(1916)<400>1tcgaggggcc agatctcact cgtagggggt gcctgtgcct ggccgcccgt ttctctaatc 60
cgccgccact tccctagacg gctgctgccc agttctgccc tgcgcctccg tagggcctcc 120ctctgtgcct ggcaggtgtt ccccagggac aaccgttagt cagagttggt tgccgtttat 180taaaacctaa tacctgccag gtacactgta cctggcgctt acacatagtt cttcatttga 240tgttcaccgg gaccctgcaa aggaggagta gtgaaaatgt gtat atg agg act ctg 296Met Arg Thr Leu1cat gca gtt tct cat cct tac agt aac tca atg aga ttc cag aga gtc344His Ala Val Ser His Pro Tyr Ser Asn Ser Met Arg Phe Gln Arg Val5 10 15 20ctc tat ttc ata tgt gcc ttc cag aac atc tct tgt ggt att cac tac392Leu Tyr Phe Ile Cys Ala Phe Gln Asn Ile Ser Cys Gly Ile His Tyr25 30 35ttg gct tct gtg ttc atg gga gtc acc cct cat cat gtc tgc agg ccc440Leu Ala Ser Val Phe Met Gly Val Thr Pro His His Val Cys Arg Pro40 45 50cca ggc aat ttg cag aat ggt gag atc tgg gag ctc tca agg tgt agc488Pro Gly Asn Leu Gln Asn Gly Glu Ile Trp Glu Leu Ser Arg Cys Ser55 60 65agg aat aag agg gag aac aca tcg agt ttg ggc tat gaa tac act ggc536Arg Asn Lys Arg Glu Asn Thr Ser Ser Leu Gly Tyr Glu Tyr Thr Gly70 75 80
agt aag aaa gag ttt cct tgt gtg gat ggc tac ata tat gac cag aac584Ser Lys Lys Glu Phe Pro Cys Val Asp Gly Tyr Ile Tyr Asp Gln Asn85 90 95 100aca tgg aaa agc act gcg gtg acc cag tgg aac ctg gtc tgt gac cga632Thr Trp Lys Ser Thr Ala Val Thr Gln Trp Asn Leu Val Cys Asp Arg105 110 115aaa tgg ctt gca atg ctg atc cag ccc cta ttt atg ttt gga gtc cta680Lys Trp Leu Ala Met Leu Ile Gln Pro Leu Phe Met Phe Gly Val Leu120 125 l30ctg gga tcg gtg act ttt ggc tac ttt tct gac agg cta gga cgc cgg728Leu Gly Ser Val Thr Phe Gly Tyr Phe Ser Asp Arg Leu Gly Arg Arg135 140 145gtg gtc ttg tgg gcc aca agc agt agc atg ttt ttg ttt gga ata gca776Val Val Leu Trp Ala Thr Ser Ser Ser Met Phe Leu Phe Gly Ile Ala150 155 160gcg gcg ttt gca gtt gat tat tac acc ttc atg gct gct cgc ttt ttt824Ala Ala Phe Ala Val Asp Tyr Tyr Thr Phe Met Ala Ala Arg Phe Phe165 170 175 180ctt gcc atg gtt gca agt ggc tat ctt gtg gtg ggg ttt gtc tat gtg872Leu Ala Met Val Ala Ser Gly Tyr Leu Val Val Gly Phe Val Tyr Val185 190 195
atg gaa ttc att ggc atg aag tct cgg aca tgg gcg tct gtc cat ttg920Met Glu Phe Ile Gly Met Lys Ser Arg Thr Trp Ala Ser Val His Leu200 205 210cat tcc ttt ttt gca gtt gga acc ctg ctg gtg gct ttg aca gga tac968His Ser Phe Phe Ala Val Gly Thr Leu Leu Val Ala Leu Thr Gly Tyr215 220 225ttg gtc agg acc tgg tgg ctt tac cag atg atc ctc tcc aca gtg act1016Leu Val Arg Thr Trp Trp Leu Tyr Gln Met Ile Leu Ser Thr Val Thr230 235 240gtc ccc ttt atc ctg tgc tgt tgg gtg ctc cca gag aca cct ttt tgg1064Val Pro Phe Ile Leu Cys Cys Trp Val Leu Pro Glu Thr Pro Phe Trp245 250 255 260ctt ctc tca gag gga cga tat gaa gaa gca caa aaa ata gtt gac atc1112Leu Leu Ser Glu Gly Arg Tyr Glu Glu Ala Gln Lys Ile Val Asp Ile265 270 275atg gcc aag tgg aac agg gca agc tcc tgt aaa ctg tca gaa ctt tta1160Met Ala Lys Trp Asn Arg Ala Ser Ser Cys Lys Leu Ser Glu Leu Leu280 285 290tca ctg gac cta caa ggt cct gtt agt aat agc ccc act gaa gtt cag1208Ser Leu Asp Leu Gln Gly Pro Val Ser Asn Ser Pro Thr Glu Val Gln295 300 305aag cac aac cta tca tat ctg ttt tat aac tgg agc att acg aaa agg1256
Lys His Asn Leu Ser Tyr Leu Phe Tyr Asn Trp Ser Ile Thr Lys Arg310 315 320aca ctt acc gtt tgg cta atc tgg ttc act gga agt ttg gga ttc tac1304Thr Leu Thr Val Trp Leu Ile Trp Phe Thr Gly Ser Leu Gly Phe Tyr325 330 335 340tcg ttt tcc ttg aat tct gtt aac tta gga ggc aat gaa tac tta aac1352Ser Phe Ser Leu Asn Ser Val Asn Leu Gly Gly Asn Glu Tyr Leu Asn345 350 355ctc ttc ctc ctg ggt gta gtg gaa att ccc gcc tac acc ttc gtg tgc1400Leu Phe Leu Leu Gly Val Val Glu Ile Pro Ala Tyr Thr Phe Val Cys360 365 370atc gcc atg gac aag gtc ggg agg aga aca gtc ctg gcc tac tct ctt1448Ile Ala Met Asp Lys Val Gly Arg Arg Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu375 380 385ttc tgc agt gca ctg gcc tgt ggt gtc gtt atg gtg atc ccc cag aaa1496Phe Cys Ser Ala Leu Ala Cys Gly Val Val Met Val Ile Pro Gln Lys390 395 400cat tat att ttg ggt gtg gtg aca gct atg gtt gga aaa ttt gcc atc1544His Tyr Ile Leu Gly Val Val Thr Ala Met Val Gly Lys Phe Ala Ile405 410 415 420ggg gca gca ttt ggc ctc att tat ctt tat aca gct gag ctg tat cca1592Gly Ala Ala Phe Gly Leu Ile Tyr Leu Tyr Thr Ala Glu Leu Tyr Pro
425 430 435acc att gta aga tcg ctg gct gtg gga agc ggc agc atg gtg tgt cgc1640Thr Ile Val Arg Ser Leu Ala Val Gly Ser Gly Ser Met Val Cys Arg440 445 450ctg gcc agc atc ctg gcg ccg ttc tct gtg gac ctc agc agc att tgg1688Leu Ala Ser Ile Leu Ala Pro Phe Ser Val Asp Leu Ser Ser Ile Trp455 460 465atc ttc ata cca cag ttg ttt gtt ggg act atg gcc ctc ctg agt gga1736Ile Phe Ile Pro Gln Leu Phe Val Gly Thr Met Ala Leu Leu Ser Gly470 475 480gtg tta aca cta aag ctt cca gaa acc ctt ggg aaa cgg cta gca actl784Val Leu Thr Leu Lys Leu Pro Glu Thr Leu Gly Lys Arg Leu Ala Thr485 490 495 500act tgg gag gag gct gca aaa ctg gag tca gag aat gaa agc aag tca1832Thr Trp Glu Glu Ala Ala Lys Leu Glu Ser Glu Asn Glu Ser Lys Ser505 510 515agc aaa tta ctt ctc aca act aat aat agt ggg ctg gaa aaa acg gaa1880Ser Lys Leu Leu Leu Thr Thr Asn Asn Ser Gly Leu Glu Lys Thr Glu520 525 530gcg att acc ccc agg gat tct ggt ctt ggt gaa taa atgtgccatg 1926Ala Ile Thr Pro Arg Asp Ser Gly Leu Gly Glu535 540
cctgctgtct agcacctgaa atattattta ccctaatgcc tttgtattag aggaatctta 1986ttctcatctc ccatatgttg tttgtatgtc tttttaataa attttgtaag aaaaaaaaaa 2046aa 2048<210>2<211>543<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Arg Thr Leu His Ala Val Ser His Pro Tyr Ser Asn Ser Met Arg1 5 10 15Phe Gln Arg Val Leu Tyr Phe Ile Cys Ala Phe Gln Asn Ile Ser Cys20 25 30Gly Ile His Tyr Leu Ala Ser Val Phe Met Gly Val Thr Pro His His35 40 45Val Cys Arg Pro Pro Gly Asn Leu Gln Asn Gly Glu Ile Trp Glu Leu50 55 60Ser Arg Cys Ser Arg Asn Lys Arg Glu Asn Thr Ser Ser Leu Gly Tyr65 70 75 80Glu Tyr Thr Gly Ser Lys Lys Glu Phe Pro Cys Val Asp Gly Tyr Ile85 90 95Tyr Asp Gln Asn Thr Trp Lys Ser Thr Ala Val Thr Gln Trp Asn Leu100 105 110Val Cys Asp Arg Lys Trp Leu Ala Met Leu Ile Gln Pro Leu Phe Met
115 120125Phe Gly Val Leu Leu Gly Ser Val Thr Phe Gly Tyr Phe Ser Asp Arg130 135 140Leu Gly Arg Arg Val Val Leu Trp Ala Thr Ser Ser Ser Met Phe Leu145 150 155 160Phe Gly Ile Ala Ala Ala Phe Ala Val Asp Tyr Tyr Thr Phe Met Ala165 170 175Ala Arg Phe Phe Leu Ala Met Val Ala Ser Gly Tyr Leu Val Val Gly180 185 l90Phe Val Tyr Val Met Glu Phe Ile Gly Met Lys Ser Arg Thr Trp Ala195 200 205Ser Val His Leu His Ser Phe Phe Ala Val Gly Thr Leu Leu Val Ala210 215 220Leu Thr Gly Tyr Leu Val Arg Thr Trp Trp Leu Tyr Gln Met Ile Leu225 230 235 240Ser Thr Val Thr Val Pro Phe Ile Leu Cys Cys Trp Val Leu Pro Glu245 250 255Thr Pro Phe Trp Leu Leu Ser Glu Gly Arg Tyr Glu Glu Ala Gln Lys260 265 270Ile Val Asp Ile Met Ala Lys Trp Asn Arg Ala Ser Ser Cys Lys Leu275 280 285Ser Glu Leu Leu Ser Leu Asp Leu Gln Gly Pro Val Ser Asn Ser Pro290 295 300Thr Glu Val Gln Lys His Asn Leu Ser Tyr Leu Phe Tyr Asn Trp Ser305 310 315 320Ile Thr Lys Arg Thr Leu Thr Val Trp Leu Ile Trp Phe Thr Gly Ser325 330 335Leu Gly Phe Tyr Ser Phe Ser Leu Asn Ser Val Asn Leu Gly Gly Asn340 345 350
Glu Tyr Leu Asn Leu Phe Leu Leu Gly Val Val Glu Ile Pro Ala Tyr355 360 365Thr Phe Val Cys Ile Ala Met Asp Lys Val Gly Arg Arg Thr Val Leu370 375 380Ala Tyr Ser Leu Phe Cys Ser Ala Leu Ala Cys Gly Val Val Met Val385 390 395 400Ile Pro Gln Lys His Tyr Ile Leu Gly Val Val Thr Ala Met Val Gly405 410 415Lys Phe Ala Ile Gly Ala Ala Phe Gly Leu Ile Tyr Leu Tyr Thr Ala420 425 430Glu Leu Tyr Pro Thr Ile Val Arg Ser Leu Ala Val Gly Ser Gly Ser435 440 445Met Val Cys Arg Leu Ala Ser Ile Leu Ala Pro Phe Ser Val Asp Leu450 455 460Ser Ser Ile Trp Ile Phe Ile Pro Gln Leu Phe Val Gly Thr Met Ala465 470 475 480Leu Leu Ser Gly Val Leu Thr Leu Lys Leu Pro Glu Thr Leu Gly Lys485 490 495Arg Leu Ala Thr Thr Trp Glu Glu Ala Ala Lys Leu Glu Ser Glu Asn500 505 510Glu Ser Lys Ser Ser Lys Leu Leu Leu Thr Thr Asn Asn Ser Gly Leu515 520 525Glu Lys Thr Glu Ala Ile Thr Pro Arg Asp Ser Gly Leu Gly Glu530 535 540
權(quán)利要求
1.一種具有轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿及其類似物能力的蛋白，包括由SEQ IDNO.1所表示的氨基酸序列或者通過缺失，取代或者添加一個到多個氨基酸從所述氨基酸序列衍生的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的蛋白，其中蛋白來自人。
3.權(quán)利要求1或者2所述的蛋白，其中蛋白來自器官，組織或者培養(yǎng)細(xì)胞。
4.一種編碼權(quán)利要求1所定義的蛋白的基因。
5.一種基因，其包括由SEQ ID NO.1所表示的堿基序列的DNA或者編碼一種蛋白的DNA，所述蛋白與上述DNA在嚴(yán)格條件下雜交，并且能夠以鈉依賴方式轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿及其類似物。
6.權(quán)利要求5所述的基因，其中基因來自人。
7.權(quán)利要求5或者6所述的基因，其中基因來自器官，組織或者培養(yǎng)的細(xì)胞。
8.一種表達(dá)載體，其具有權(quán)利要求4到7中任一項所定義的基因或者包括所述基因中編碼蛋白的基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體，其中表達(dá)載體為質(zhì)粒。
10.一種由權(quán)利要求8所定義的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
11.一種核苷酸，其包括由SEQ ID NO.1所表示的堿基序列中所含的連續(xù)14個或者更多個堿基的部分序列或者其互補(bǔ)序列。
12.一種探針，其包括權(quán)利要求11所定義的核苷酸并檢測編碼能夠以鈉依賴方式轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿及其類似物的蛋白的基因。
13.一種通過利用權(quán)利要求11所定義的核苷酸調(diào)節(jié)編碼一種蛋白的基因的表達(dá)的方法，所述蛋白能夠以鈉依賴方式轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿及其類似物。
14.一種針對權(quán)利要求1到3中任一項所定義的蛋白。
15.一種使用權(quán)利要求1到3中任一項所定義的蛋白，檢測受試材料作為底物對所述蛋白的以鈉依賴方式轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿及其類似物的能力的作用的方法。
16.一種通過利用所述蛋白、其特異性抗體、其啟動子或者抑制劑調(diào)節(jié)所述蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿及其類似物的能力，來調(diào)節(jié)由權(quán)利要求1到3中任一項所定義的蛋白在睪丸和附睪中轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿及其類似物的動態(tài)的方法。
17.一種通過利用所述蛋白、其特異性抗體、其啟動子或者抑制劑調(diào)節(jié)所述蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿及其類似物的能力，來調(diào)節(jié)由權(quán)利要求1到3中任一項所定義的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的肉堿及其類似物對于精子細(xì)胞的影響的方法。
18.一種通過利用所述蛋白、其特異性抗體、其啟動子或者抑制劑調(diào)節(jié)所述蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿及其類似物的能力，來調(diào)節(jié)由權(quán)利要求1到3中任一項所定義的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的肉堿及其類似物對于精子受精能力的影響的方法。
19.一種通過利用所述蛋白、其特異性抗體、其啟動子或者抑制劑使蛋白在特定細(xì)胞中過量表達(dá)、或者調(diào)節(jié)細(xì)胞中現(xiàn)存的所述蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿及其類似物的能力，來檢測或者調(diào)節(jié)由權(quán)利要求1到3中任一項所定義的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的肉堿及其類似物對于精子細(xì)胞受精或者個體受精能力的影響的方法。
全文摘要
本發(fā)明的目的就是鑒定和提供一種新的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，所述基因參與睪丸和附睪中的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)，以及作為由所述基因編碼的蛋白的肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。本發(fā)明還提供了一種蛋白包括由SEQ ID NO.1所表示的氨基酸序列或者通過上述序列缺失，取代，添加一個到多個氨基酸從所述氨基酸序列衍生的氨基酸序列，并且能夠轉(zhuǎn)運(yùn)肉堿或者其類似物；以及編碼該蛋白的基因。
文檔編號C12P21/08GK1549857SQ02810938
公開日2004年11月24日 申請日期2002年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月29日
發(fā)明者遠(yuǎn)藤仁, 金井好克, 榎本篤, 克 申請人:人體細(xì)胞組織有限公司