專利名稱：制備作為動(dòng)物飼料添加劑的d-泛酸和/或其鹽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備D-泛酸和/或其鹽的改進(jìn)方法以及所述物質(zhì)作為動(dòng)物飼料添加劑的用途。
作為生物合成輔酶A的原料，D-泛酸鹽廣泛分布于植物界和動(dòng)物界中。與通過膳食消耗足量泛酸的人類不同，D-泛酸鹽缺乏癥狀常常不僅見于植物，而且也見于動(dòng)物。因此，D-泛酸鹽的可利用性具有重大經(jīng)濟(jì)價(jià)值，特別是在動(dòng)物飼料工業(yè)中。
傳統(tǒng)上，D-泛酸鹽通過化學(xué)合成由D-泛內(nèi)酯和β-丙氨酸鈣來制備(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry(Ullmann工業(yè)化學(xué)大全)，第六版，1999，電子版，“維生素”一章)。D-泛內(nèi)酯的制備需要經(jīng)由非對(duì)映鹽的復(fù)雜且經(jīng)典的外消旋體拆分。由該化學(xué)合成得到的工業(yè)產(chǎn)物通常是D-泛酸的鈣鹽，即D-泛酸鈣。
與化學(xué)合成相比，使用微生物的生物技術(shù)生產(chǎn)方法的優(yōu)點(diǎn)在于選擇性(對(duì)映體純)生產(chǎn)可用于高級(jí)生物的D型泛酸。因此，如化學(xué)合成中所需的復(fù)雜的外消旋體拆分就不必要了。
已公開大量通過微生物來制備D-泛酸的發(fā)酵方法，包括EP-0 590 857、WO 96/33283、US 6,013,492、WO 97/10340、DE 198 46 499、EP 1 001 027、EP 1 006 189、EP 1 006 192和EP 1 006 193中所述的方法。
因此，EP 1 006 189和EP 1 001 027描述了制備泛酸鹽的方法，其中在發(fā)酵溶液中達(dá)到的最大D-泛酸含量為1g/l。然而，對(duì)于經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)含有D-泛酸的動(dòng)物飼料添加劑，發(fā)酵溶液中這樣低的泛酸含量(即以固含量計(jì)不到10重量％)是不適用的。迄今所述方法的另一缺點(diǎn)在于產(chǎn)物從發(fā)酵培養(yǎng)基中的分離需要許多復(fù)雜的后處理步驟。尚未公開過在工業(yè)規(guī)模上經(jīng)濟(jì)的制備方法。
德國公開申請(qǐng)DE 100 16 321描述了一種制備含有D-泛酸的動(dòng)物飼料添加劑的發(fā)酵方法。然而，與上述制備D-泛酸的發(fā)酵方法一樣，該方法的一個(gè)重大缺點(diǎn)在于必須將該泛酸的前體-β-丙氨酸經(jīng)由發(fā)酵培養(yǎng)基供入微生物中以得到所需產(chǎn)物的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)率。
另外，US 6,013,492和WO 96/332839描述了通過從培養(yǎng)基中濾除不溶性成分(例如細(xì)胞物質(zhì))，將濾液吸附到活性炭上，隨后用有機(jī)溶劑、優(yōu)選甲醇洗脫D-泛酸，用氫氧化鈣中和以及隨后將D-泛酸鈣結(jié)晶而從發(fā)酵溶液中對(duì)D-泛酸進(jìn)行后處理。其重大缺點(diǎn)在于結(jié)晶過程中損失有價(jià)值的產(chǎn)物以及使用從產(chǎn)物中難以除去且需要復(fù)雜的溶劑回收步驟的有機(jī)溶劑。
EP 0 590 857描述了一種制備D-泛酸的發(fā)酵方法，其中培養(yǎng)微生物需要供入β-丙氨酸。將該發(fā)酵溶液過濾以分離除去生物質(zhì)，然后使其通過陽離子交換劑并然后通過陰離子交換劑，之后用氫氧化鈣中和，蒸發(fā)濃縮，加入活性炭，再次過濾以及加入甲醇和氯化鈣以結(jié)晶。所得含有泛酸鈣的產(chǎn)物除了含有鈣鹽形式的D-泛酸外，還含有摩爾比為1∶1的氯化鈣。降低氯化鈣含量需要電滲析和隨后的噴霧干燥。該方法的缺點(diǎn)在于由于大量復(fù)雜的工藝步驟和有機(jī)溶劑的使用使得既不經(jīng)濟(jì)又不生態(tài)。
本發(fā)明的目的是提供一種含有D-泛酸和/或其鹽的動(dòng)物飼料添加劑以及通過沒有上述缺點(diǎn)的制備D-泛酸和/或其鹽的改進(jìn)方法來制備它的方法。出于經(jīng)濟(jì)上的原因，在這種情況下理想的方法是，其中β-丙氨酸的供入大大降低或根本不需要。另外，制備其二價(jià)鹽形式且尤其是堿土金屬鹽形式的D-泛酸是所需的，因?yàn)樵摲核岬亩r(jià)鹽與其一價(jià)鹽相比具有更低的吸濕性，因而對(duì)于進(jìn)一步應(yīng)用例如用作動(dòng)物飼料添加劑具有不太顯著的團(tuán)聚趨勢(shì)。
我們發(fā)現(xiàn)該目的通過本發(fā)明有利地實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明涉及一種制備D-泛酸和/或其鹽的方法，其包括如下步驟a)使用至少一種產(chǎn)生D-泛酸的生物，在該生物中去調(diào)節(jié)泛酸(pan)和/或異亮氨酸/纈氨酸(ilv)的生物合成，并且該生物通過在培養(yǎng)基中發(fā)酵形成至少2g/l D-泛酸鹽，其中該培養(yǎng)基中供入有0-20g/l游離β-丙氨酸和/或β-丙氨酸鹽，b)將含有多價(jià)陽離子的鹽供入所形成的D-泛酸鹽中，其中形成D-泛酸的多價(jià)鹽，c)將該含有D-泛酸的多價(jià)鹽的溶液通過納米過濾(nanofiltration)來后處理，其中該D-泛酸的多價(jià)鹽富集，以及d)將含有D-泛酸的多價(jià)鹽的納米過濾保留物(retentate)進(jìn)行干燥和/或配制。
在本發(fā)明方法的變體中，步驟c)的保留物為含有D-泛酸的多價(jià)鹽的懸浮液。
另外，所述發(fā)酵可通過本身已知的程序以分批、補(bǔ)料分批或反復(fù)的補(bǔ)料分批方式或在連續(xù)工藝工序下進(jìn)行。為了中和所得泛酸，在這種情況下使用常規(guī)緩沖體系如含有NaOH、KOH或氨的磷酸鹽緩沖液。
在本發(fā)明方法的另一變體中，在步驟a)中，通過發(fā)酵在培養(yǎng)基中形成至少10g/l、優(yōu)選至少20g/l、特別優(yōu)選至少40g/l、非常特別優(yōu)選至少60g/l、尤其至少70g/l D-泛酸鹽。
對(duì)本發(fā)明而言，詞語“產(chǎn)生”指所述生物可合成比其自身代謝需要所需量要大的D-泛酸和/或其鹽。在本發(fā)明的有利變體中，所合成的D-泛酸和/或其鹽的量不存在于細(xì)胞內(nèi)部，但理想的是通過生物全部釋放到培養(yǎng)基中。該釋放通過本身公知的機(jī)理可以是主動(dòng)的或被動(dòng)的。
根據(jù)本發(fā)明，所用產(chǎn)生D-泛酸的生物是微生物。這些微生物根據(jù)本發(fā)明包括真菌、酵母和/或細(xì)菌。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選使用真菌如毛霉菌屬(Mucor)或酵母如酵母屬(Saccharomyces)或德巴利酵母屬(Debaromyces)，在這當(dāng)中優(yōu)選釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。根據(jù)本發(fā)明，有利地使用棒狀桿菌(coryneform bacteria)或芽孢桿菌科(Bacillaceae)。在本發(fā)明范圍內(nèi)優(yōu)選的例如是棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、埃希氏菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、短桿菌屬(Bevibacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)或根瘤菌屬(Rhizobium)的細(xì)菌。此處特別優(yōu)選的例如是谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)、短桿菌(Brevibacterium breve)或枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)、緩病芽孢桿菌(B.lentimorbus)、遲緩芽孢桿菌(B.lentus)、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(B.firmus)、泛酸芽孢桿菌(B.pantothenticus)、環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)、凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)、蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)、短芽孢桿菌(B.brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)和一組以其16sRNA表征的其它芽孢桿菌種，或Actinum mycetalis。該列舉目的在于解釋，決不是對(duì)本發(fā)明的限制。
此外，本發(fā)明還包括使用基因修飾生物以用于本發(fā)明制備含有游離D-泛酸和/或其鹽的動(dòng)物飼料添加劑。這類基因修飾生物例如可通過化學(xué)誘變和隨后使用合適的“篩選法”篩選來分離。根據(jù)本發(fā)明，稱作“生產(chǎn)菌株”的也包括在內(nèi)，它們適于制備本發(fā)明產(chǎn)物且在D-泛酸方向的代謝通量方面具有基因修飾，其中在D-泛酸和/或其鹽經(jīng)由細(xì)胞膜排出方面的修飾也包括在內(nèi)。這例如可通過對(duì)所用生物的相關(guān)代謝生物合成途徑中的關(guān)鍵位置的修飾來實(shí)現(xiàn)。
也可使用由必需的或可能需要的同源和/或異源核苷酸序列轉(zhuǎn)移得到的轉(zhuǎn)基因生物來合成所需產(chǎn)物。在這種情況下，單獨(dú)和/或組合位于基因組中的和/或位于載體上的一個(gè)或多個(gè)基因可以超表達(dá)和/或去調(diào)節(jié)。
這類轉(zhuǎn)基因生物可有利地含有額外的拷貝和/或基因修飾的基因，所述基因選自panB、panC、panD、panE和/或其組合和/或甚至是象panBCD操縱子那樣的組織單元。另外，如EP 1 006 189、EP 1 006 192、EP 1 006 193或EP 1 001 027所述，可有利地在生物中操作其它代謝途徑，例如異亮氨酸-纈氨酸生物合成途徑。結(jié)果，泛酸生物合成的支化鏈前體物質(zhì)越發(fā)可利用。合適的話，將用于該生物合成途徑的基因，即ilvB、ilvN、ilvC和/或ilvD有利地超表達(dá)。
另外，本發(fā)明還包括在所用的產(chǎn)生D-泛酸的生物中對(duì)天冬氨酸α-脫羧酶(panD)例如通過超表達(dá)和/或去調(diào)節(jié)進(jìn)行基因修飾。
對(duì)本發(fā)明而言，詞語“去調(diào)節(jié)”指在生物合成代謝途徑中改變或修飾至少一個(gè)編碼一種酶的基因，使得改變或修飾該酶在該微生物中的活性。優(yōu)選改變至少一個(gè)編碼一種生物合成代謝途徑的酶的基因，使得該基因產(chǎn)物以更大程度形成，或者具有增加的活性。術(shù)語“去調(diào)節(jié)的代謝途徑”也包括其中改變或修飾一個(gè)以上編碼一種以上酶的基因以改變或修飾該一種以上酶的活性的生物合成代謝途徑。
改變或修飾可包括但不限于除去內(nèi)源啟動(dòng)子或調(diào)節(jié)成分；同時(shí)引入強(qiáng)啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或多個(gè)啟動(dòng)子；除去調(diào)節(jié)序列以改變?cè)摶虍a(chǎn)物的表達(dá)；改變?cè)摶虻娜旧w位置；改變?cè)谠摶蚋浇蛟摶騼?nèi)的DNA序列，例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)；增加該基因組中該基因的拷貝數(shù)或引入數(shù)目不等的質(zhì)?？截?；修飾蛋白(例如調(diào)節(jié)蛋白、抑制因子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄激活因子等)，它們?cè)诨蜣D(zhuǎn)錄和/或在翻譯得到基因產(chǎn)物中起著作用。這也包括所有屬于現(xiàn)有技術(shù)的其它去調(diào)節(jié)基因的表達(dá)的可能方式，例如使用反義寡核苷酸或阻斷阻抑蛋白。去調(diào)節(jié)也可包括對(duì)例如導(dǎo)致除去基因產(chǎn)物中的反饋調(diào)節(jié)或?qū)е禄虍a(chǎn)物的更大或更小比活性的基因的編碼區(qū)的改變。
此外，對(duì)酶的基因修飾根據(jù)本發(fā)明是有利的，這些修飾影響泛酸前體的流出和/或泛酸流出產(chǎn)生輔酶A。編碼這些酶的基因的實(shí)例是alsD、avtA、ilvE、ansB、coaA、coaX等。該列舉目的在于解釋，決不是對(duì)本發(fā)明的限制。
另外，基因修飾是有利的，這些修飾保證輔因子(例如亞甲四氫葉酸、氧化還原等同物等)以對(duì)于泛酸產(chǎn)生而言最優(yōu)的量的細(xì)胞生產(chǎn)。
因此，β-丙氨酸有利地已經(jīng)以與相應(yīng)的非基因修飾生物相比增加的濃度存在于細(xì)胞中，因此不必將其作為前體加入培養(yǎng)基中，例如EP-A 0 590857中所要求的。其中去調(diào)節(jié)泛酸(pan)和/或異亮氨酸-纈氨酸(ilv)和/或天冬氨酸α-脫羧酶(panD)的生物合成的微生物是有利的。而且，微生物中酮泛解酸還原酶(panE)的額外超表達(dá)是有利的。
根據(jù)本發(fā)明，合適的話，若合成輔酶A所需的coaA基因的活性降低或者該基因被徹底切斷(例如在芽孢桿菌屬種中)，則將額外有利。這是因?yàn)檠挎邨U菌屬除含有coaA外還含有其它提供這種酶催功能的基因(＝coaX)。該coaX基因或相應(yīng)酶的活性也可改變，優(yōu)選降低，或者甚至消除，條件是coaA本身仍舊具有足夠的酶活性，即使是降低的酶活性，也就是說coaA的酶活性沒有徹底喪失。除各種基因的超表達(dá)之外，這些基因的啟動(dòng)區(qū)的基因操作也是有利的，條件是該操作導(dǎo)致該基因產(chǎn)物的超表達(dá)。
在本發(fā)明實(shí)施方案中，使用根據(jù)附件(PCT/US 0025993)描述的細(xì)菌菌株，例如枯草芽孢桿菌PA 824和/或其衍生物。在另一實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明在本發(fā)明方法中使用如附件(US 60/262,995)中所述的枯草芽孢桿菌PA 668微生物。這些枯草芽孢桿菌PA 824和PA 668菌株按如下方式生產(chǎn)從具有基因型trpC2(Trp-)的枯草芽孢桿菌168菌株(Marburg菌株ATCC 6051)開始，通過Trp+標(biāo)記(來自枯草芽孢桿菌野生型W23)轉(zhuǎn)導(dǎo)生產(chǎn)PY79菌株。經(jīng)典的基因工程方法(例如Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(編輯)在Molecular Biological Methods for Bacillus(芽孢桿菌屬的分子生物學(xué)方法)(1990)(John Wiley & Sons，Ltd.，Chichester，英國)中所述)將ΔpanB和ΔpanE1突變引入PY79菌株中。
使用枯草芽孢桿菌菌株P(guān)A221(基因型P26panBCD，trpC2(Trp-))的基因組DNA和枯草芽孢桿菌菌株P(guān)A303(基因型P26panE1)的基因組DNA將所得菌株轉(zhuǎn)化。所得菌株P(guān)A327具有基因型P26panBCD、P26panE1，且為色氨酸營養(yǎng)缺陷體(Trp-)。使用枯草芽孢桿菌菌株P(guān)A327，在10ml含有SVY培養(yǎng)基(將25g/l Difco Veal肉浸汁、5g/l Difco酵母提取物、5g/l谷氨酸鈉、2.7g/l硫酸銨加入740ml水中，將該混合物高壓滅菌，然后加入200ml1M磷酸鉀(pH7.0)和60ml 50％無菌的葡萄糖溶液)的培養(yǎng)物中，得到不超過3.0g/l(24h)的泛酸滴定度，其中所述培養(yǎng)基補(bǔ)加有5g/lβ-丙氨酸和5g/lα-酮異戊酸。
枯草芽孢桿菌菌株P(guān)A221(基因型P26panBCD，trpC2(Trp-))的生產(chǎn)描述在下列部分借助E.Coli的panBCD操縱子的序列信息(見Merkel等人，F(xiàn)EMSMicrobiol.Lett.，143，1996247-252)，從枯草芽孢桿菌GP275質(zhì)粒文庫開始，使用經(jīng)典的基因工程方法來克隆芽孢桿菌屬的panBCD操縱子。為了進(jìn)行克隆，使用E.coli菌株BM4062(birts)和該芽孢桿菌屬操縱子靠近birA基因的信息。將該panBCD操縱子引入可在E.coli中復(fù)制的質(zhì)粒中。為了改善該panBCD操縱子的表達(dá)，使用枯草芽孢桿菌噬菌體SP01(P26)的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子，并將panB基因前面的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(＝RBS)用人工RBS替換。在芽孢桿菌屬中緊鄰天然panB基因上游的DNA片段連接在質(zhì)粒上的P26panBCD盒前面。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成枯草芽孢桿菌菌株RL-1(通過經(jīng)典的誘變得到的枯草芽孢桿菌168的衍生物(Marburg菌株ATCC6051)，基因型trpC2(Trp-))，并且通過同源重組，用P26panBCD操縱子代替天然panBCD操縱子。所得菌株稱作PA221，并且具有基因型P26panBCD，trpC2(Trp-)。
使用枯草芽孢桿菌菌株P(guān)A221，在10ml含有SVY培養(yǎng)基的培養(yǎng)物中，得到不超過0.92g/l(24h)的泛酸滴定度，其中所述培養(yǎng)基中補(bǔ)加有5g/lβ-丙氨酸和5g/lα-酮異戊酸。
枯草芽孢桿菌菌株P(guān)A303(基因型P26panE1)的生產(chǎn)描述在下列部分利用E.Coli panE基因序列，通過類似方法克隆芽孢桿菌屬panE序列。發(fā)現(xiàn)在枯草芽孢桿菌中存在兩種同源E.Coli panE基因，稱作panE1和panE2。缺失分析發(fā)現(xiàn)panE1基因負(fù)責(zé)90％的泛酸產(chǎn)生，而缺失panE2基因?qū)Ψ核岙a(chǎn)生并無重大影響。此處與克隆panBCD操縱子相似，用強(qiáng)組成型啟動(dòng)子P26代替該啟動(dòng)子，并用人工結(jié)合位點(diǎn)代替panE1基因前面的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。將P26panE1片段克隆到載體中，該載體的構(gòu)建使得該P(yáng)26panE1片段能整合至枯草芽孢桿菌基因組中的原始panE1基因座。轉(zhuǎn)化和同源重組之后所得的菌株稱作PA303，并且具有基因型P26panE1。
使用枯草芽孢桿菌菌株P(guān)A303，在10ml含有SVY培養(yǎng)基的培養(yǎng)物中，得到不超過1.66g/l(24h)的泛酸滴定度，其中所述培養(yǎng)基中補(bǔ)加有5g/lβ-丙氨酸和5g/lα-酮異戊酸。
通過用含有P26ilvBNC操縱子和壯觀霉素的標(biāo)記基因的質(zhì)粒將PA327轉(zhuǎn)化而進(jìn)一步構(gòu)建所述菌株。該P(yáng)26ilvBNC操縱子整合入amyE基因座中，這通過PCR來顯示。將一種轉(zhuǎn)化體稱作PA340(基因型P26panBCD、P26pan E1、P26ilvBNC、specR、trpC2(Trp-))。
使用枯草芽孢桿菌菌株P(guān)A340，在10ml含有僅補(bǔ)加有5g/lβ-丙氨酸的SVY培養(yǎng)基的培養(yǎng)物中，得到不超過3.6g/l(24h)的泛酸滴定度；在10ml含有補(bǔ)加有5g/lβ-丙氨酸和5g/lα-酮異戊酸的SVY培養(yǎng)基的培養(yǎng)物中，得到不超過4.1g/l(24h)的泛酸滴定度。
另外，將去調(diào)節(jié)的ilvD盒引入菌株P(guān)A340中。為此，將含有ilvD基因的質(zhì)粒在控制含有人工RBS2的P26啟動(dòng)子的情況下轉(zhuǎn)化入PA340。通過同源重組將P26ilvD基因整合入原始ilvD基因座中。所得菌株P(guān)A374具有基因型P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、P26ilvD、specR和trpC2(Trp-)。
使用枯草芽孢桿菌菌株P(guān)A374，在10ml含有SVY培養(yǎng)基的培養(yǎng)物中，得到不超過2.99g/l(24h)的泛酸滴定度，其中所述培養(yǎng)基中僅補(bǔ)加有5g/lβ-丙氨酸。
為了在不供入β-丙氨酸的情況下使用菌株P(guān)A374來產(chǎn)生泛酸，將編碼天冬氨酸α-脫羧酶的基因panD的附加拷貝引入菌株P(guān)A374中。為此，將菌株P(guān)A401的染色體DNA轉(zhuǎn)化入PA374。通過在四環(huán)素上的選擇得到菌株P(guān)A377。
所得菌株P(guān)A377具有基因型P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、P26ilvD、specR、tetR和trpC2(Trp-)。
在不供入前體的情況下，使用枯草芽孢桿菌菌株P(guān)A377，在10ml含有SVY培養(yǎng)基的培養(yǎng)物中，得到不超過1.31g/l(24h)的泛酸滴定度。
枯草芽孢桿菌菌株P(guān)A401(基因型P26panD)的制備描述在下列部分由panBCD操縱子將枯草芽孢桿菌panD基因克隆入帶有四環(huán)素標(biāo)記基因的載體。將啟動(dòng)子P26和上述人工RBS克隆在panD基因前面。限制酶切消化產(chǎn)生含有四環(huán)素標(biāo)記基因和panD基因的片段。將該片段重新連接，并轉(zhuǎn)化入上述菌株P(guān)A221。將該片段整合入菌株P(guān)A211的基因組中。所得菌株P(guān)A401具有基因型P26panBCD、P26panD、tetR和trpC2(Trp-)。
使用枯草芽孢桿菌菌株P(guān)A401，在10ml含有已補(bǔ)加有5g/lα-酮異戊酸的SVY培養(yǎng)基的培養(yǎng)物中，得到不超過0.3g/l(24h)的泛酸滴定度。在10ml含有已補(bǔ)加有5g/lD-泛解酸和10g/l L-天冬氨酸的SVY培養(yǎng)基的培養(yǎng)物中，得到不超過2.2g/l(24h)的泛酸滴定度。
從菌株P(guān)A377開始，用菌株P(guān)Y79的染色體DNA的轉(zhuǎn)化來產(chǎn)生色氨酸-原養(yǎng)菌株。該菌株P(guān)A824具有基因型P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、P26ilvD、specR、tetR和Trp+。
在不供入前體的情況下，使用枯草芽孢桿菌菌株P(guān)A824，在10ml含有SVY培養(yǎng)基的培養(yǎng)物中，得到不超過4.9g/l(48h)的泛酸滴定度(對(duì)照PA377不超過3.6g/l(48h))。所述菌株的確切構(gòu)建參見PCT/US 0025993的附件。
PA668的制備描述在下列部分由野生型panBCD操縱子將芽孢桿菌屬panB基因克隆并插入除含有氯霉素抗性基因外還含有vpr基因座的枯草芽孢桿菌序列的載體中。
在panD基因5’端之前引入強(qiáng)組成型啟動(dòng)子P26。通過限制酶切消化得到一個(gè)含有P26panB基因、氯霉素抗性的標(biāo)記基因以及枯草芽孢桿菌vpr序列的片段。將分離出來的片段重新連接并用于轉(zhuǎn)化菌株P(guān)A824。所得菌株稱作PA668。PA668的基因型為P26panBCD、P26panE1、P26ilvBNC、P26ilvD、P26panB、specR、tetR、CmR和Trp+。
分離PA668的兩種菌落并分別稱作PA668-2A和PA668-24。
使用枯草芽孢桿菌菌株P(guān)A668-2A，在10ml含有沒有供入前體的SVY培養(yǎng)基的培養(yǎng)物中，在48h內(nèi)得到1.5g/l的泛酸滴定度。在10ml含有補(bǔ)加有10g/l天冬氨酸的SVY培養(yǎng)基的培養(yǎng)物中，得到不超過5g/l的滴定度。
使用枯草芽孢桿菌菌株P(guān)A668-24，在10ml含有沒有供入前體的SVY培養(yǎng)基的培養(yǎng)物中，在48h內(nèi)得到1.8g/l的泛酸滴定度。在10ml含有補(bǔ)加有10g/l L-天冬氨酸的SVY培養(yǎng)基的培養(yǎng)物中，得到不超過4.9g/l的滴定度。
所述菌株的確切構(gòu)建參見PCT/US 0025993和US 60/262,995的附件。
使用上述菌株P(guān)A377，在SVY培養(yǎng)基(25g/l Difco Veal肉浸汁，5g/lDifco酵母提取物，5g/l色氨酸，5g/l谷氨酸鈉，2g/l(NH4)2SO4，10g/lKH2PO4，20g/l K2HPO4，0.1g/l CaCl2，1g/l MgSO4，1g/l檸檬酸鈉，0.01g/lFeSO4·7H2O和1ml/l組成如下的痕量鹽溶液0.15g Na2MoO4·2H2O、2.5g H3BO3、0.7g CoCl2·6H2O、0.25g CuSO4·5H2O、1.6g MnCl2·4H2O、0.3g ZnSO4·7H2O與水共同構(gòu)成1升)中以10升規(guī)模在連續(xù)供入葡萄糖溶液下的葡萄糖限制發(fā)酵中，在36h(48h)內(nèi)在發(fā)酵液中得到的泛酸濃度為18-19(22-25g/l)。
在PA824(PA377的色氨酸-原養(yǎng)衍生物)的葡萄糖限制發(fā)酵的情況下，在酵母提取物培養(yǎng)基(10g/lDifco酵母提取物、5g/l谷氨酸鈉、8g/l(NH4)2SO4、10g/l KH2PO4、20g/l K2HPO4、0.1g/l CaCl2、1g/l MgSO4、1g/l檸檬酸鈉、0.01g/l FeSO4·7H2O和1ml/l上述痕量鹽溶液)中以10升規(guī)模在連續(xù)供入葡萄糖溶液下，在36h、48h和72h內(nèi)在發(fā)酵液中得到的泛酸濃度分別為20g/l、28g/l和36g/l。
通過培養(yǎng)基的進(jìn)一步優(yōu)化，使用菌株P(guān)A824，在由10g/lDifco酵母提取物、10g/lNZ胺A(Quest International GmbH，Erftstadt)、10g/l谷氨酸鈉、4g/l(NH4)2SO4、10g/l KH2PO4、20g/l K2HPO4、0.1g/l CaCl2、1g/lMgSO4、1g/l檸檬酸鈉、0.01g/l FeSO4·7H2O和1ml/l上述痕量鹽溶液組成的培養(yǎng)基中以10升規(guī)模在連續(xù)供入葡萄糖溶液下的葡萄糖限制發(fā)酵中，在36h(48h)內(nèi)在發(fā)酵液中得到的泛酸濃度為37g/l(48g/l)。
通過培養(yǎng)基的進(jìn)一步優(yōu)化、通過增加發(fā)酵時(shí)間、通過工藝和菌株改進(jìn)以及通過各步驟的組合可以進(jìn)一步提高發(fā)酵液中泛酸的濃度。因此，通過將為上述PA824的衍生物的菌株發(fā)酵也可得到上述泛酸濃度。衍生物可通過經(jīng)典的菌株發(fā)育和通過其它基因工程操作來制備。通過培養(yǎng)基、菌株和發(fā)酵方法的發(fā)展，可將發(fā)酵液中泛酸滴定度增加到大于40、45、50、55、60、65、70、75、80、85和＞90g/l。
本發(fā)明方法的重要優(yōu)點(diǎn)在于發(fā)酵在培養(yǎng)基中進(jìn)行，該培養(yǎng)基除含有至少一種碳源和氮源之外就不再含有其它作為起始化合物的前體。也就是說，D-泛酸的生物合成與其它前體的供入沒有關(guān)系。對(duì)本發(fā)明而言，這些前體是諸如β-丙氨酸和/或L-天冬氨酸和/或L-纈氨酸和/或α-酮異戊酸和/或其混合物的物質(zhì)。
在本發(fā)明方法的優(yōu)選變體中，產(chǎn)生D-泛酸的生物的發(fā)酵在培養(yǎng)基中進(jìn)行，該培養(yǎng)基含有碳源和氮源，但在發(fā)酵過程中不向其中加入或供入游離β-丙氨酸和/或β-丙氨酸鹽。也就是說，為了產(chǎn)生至少10g/l培養(yǎng)基、優(yōu)選至少20g/l、特別優(yōu)選至少40g/l、非常特別優(yōu)選至少60g/l、尤其至少70g/l的D-泛酸，根據(jù)本發(fā)明不需要供入游離β-丙氨酸和/或β-丙氨酸鹽。
與前體的供入無關(guān)這一點(diǎn)尤其是本發(fā)明方法與已知方法相比的重大經(jīng)濟(jì)優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)樵S多前體是非常昂貴的。
然而，本發(fā)明不排除加入β-丙氨酸和/或β-丙氨酸鹽，因此使得通過加入β-丙氨酸和/或β-丙氨酸鹽可進(jìn)一步提高D-泛酸的產(chǎn)率。若例如假定泛酸所有的所需前體都以足量存在，則只有panD基因的活性限制泛酸產(chǎn)生的進(jìn)一步增加，因此例如可通過加入游離β-丙氨酸和/或β-丙氨酸鹽將泛酸的產(chǎn)率再提高50％。
在本發(fā)明的有利變體中，可向培養(yǎng)基中加入不超過20g/l游離β-丙氨酸和/或β-丙氨酸鹽，以將泛酸的產(chǎn)率額外提高50％以上。優(yōu)選向培養(yǎng)基中加入約15g/l游離β-丙氨酸和/或β-丙氨酸鹽。
根據(jù)本發(fā)明，適合用于培養(yǎng)基中以將上述生物發(fā)酵的碳源的實(shí)例是糖類如淀粉水解產(chǎn)物(單-、二-、低聚糖)，優(yōu)選葡萄糖或蔗糖，以及甜菜或甘蔗糖蜜，蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，大豆粉，玉米漿，脂肪，游離脂肪酸，從前面的發(fā)酵再循環(huán)的細(xì)胞或其水解產(chǎn)物，以及酵母提取物。該列舉不是對(duì)本發(fā)明的限制。
另外，本發(fā)明方法有利的特征在于到發(fā)酵結(jié)束時(shí)總的糖含量降至最低，因?yàn)榉駝t的話這將由于粘連使隨后發(fā)酵溶液的干燥和/或配制變得困難。根據(jù)本發(fā)明，這可通過在碳源被消耗后(在分批培養(yǎng)的情況下)或在碳進(jìn)料(在以補(bǔ)料分批或反復(fù)的補(bǔ)料分批方式的工藝工序的情況下)被中斷和/或被調(diào)節(jié)以使該碳源的濃度基本為零(在補(bǔ)料分批、反復(fù)的補(bǔ)料分批或連續(xù)工藝工序的情況下)之后繼續(xù)發(fā)酵一段時(shí)間而實(shí)現(xiàn)。
根據(jù)本發(fā)明，這通過在中斷加入碳源(例如糖溶液)之后，繼續(xù)發(fā)酵直到在該發(fā)酵溶液中溶解氧濃度(pO2)為其飽和值的至少80％，優(yōu)選90％，特別優(yōu)選95％而達(dá)到。
根據(jù)本發(fā)明，合適的氮源的實(shí)例是氨、硫酸銨、尿素、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物或酵母提取物。該列舉不是對(duì)本發(fā)明的限制。
另外，發(fā)酵培養(yǎng)基含有無機(jī)鹽和/或微量元素，例如氨基酸和維生素。合適的發(fā)酵培養(yǎng)基的確切組成大量公知，并且對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員而言是可得的。
在用適合的產(chǎn)生D-泛酸的生物對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行接種(以本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的細(xì)胞密度)之后，合適的話加入消泡劑，培育該生物。培養(yǎng)基pH的任何必要調(diào)節(jié)都可使用各種無機(jī)或有機(jī)堿或酸如NaOH、KOH、氨、磷酸、硫酸、鹽酸、甲酸、琥珀酸、檸檬酸或類似物質(zhì)來實(shí)現(xiàn)。
考慮到發(fā)酵過程中所用的緩沖體系(該緩沖體系如上所述例如可以是NaOH、KOH、氨、磷酸、硫酸、鹽酸、甲酸、琥珀酸、檸檬酸或類似物質(zhì))，所形成的D-泛酸取決于所用的緩沖體系而以各自的鹽的形式存在于發(fā)酵溶液中。由于在這種情況下，尤其是D-泛酸的一價(jià)陽離子形式的鹽是不利的，因此根據(jù)本發(fā)明通過納米過濾來后處理發(fā)酵溶液。
為此，首先根據(jù)本發(fā)明將含有多價(jià)陽離子的鹽供入所形成的D-泛酸鹽中，這樣形成D-泛酸的多價(jià)鹽。根據(jù)本發(fā)明，可將含有多價(jià)陽離子的鹽以固體或水溶液形式在步驟a)的發(fā)酵過程中、優(yōu)選發(fā)酵結(jié)束時(shí)或發(fā)酵之后加入。例如可將含有多價(jià)陽離子的水溶液連續(xù)供入。
另外，在納米過濾的上游階段，即在本發(fā)明方法步驟c)的納米過濾之前，可將溶液中的細(xì)胞物質(zhì)或沉淀的成分分離除去。在這種情況下，所述分離可通過傾析或膜式過濾，優(yōu)選超濾來進(jìn)行。在本發(fā)明方法的變體中，膜式過濾以滲濾(diafiltration)進(jìn)行。此處，根據(jù)本發(fā)明，也可將含有多價(jià)陽離子的鹽以固體或水溶液形式在含有D-泛酸鹽的溶液的膜式過濾過程中或之后加入。例如，此處可將含有多價(jià)陽離子的水溶液連續(xù)供入。
在分離溶液中的細(xì)胞物質(zhì)和/或沉淀出來的成分例如微溶或不溶性磷酸鹽或硫酸鹽、酶、激素、蛋白質(zhì)、抗生素、致熱原、病毒、多糖、膠體、表面活性劑、殺蟲劑或其它無機(jī)物質(zhì)的過程中，該分離基于重力、離心力、壓力或真空的使用。示例性方法尤其是傾析、淘析、篩分、風(fēng)力分級(jí)、分粒、過濾、透析、沉降、微濾、超濾、浮選、泡沫分級(jí)分離、沉浮分離、澄清、離心分離或分離。由進(jìn)料側(cè)和滲透物側(cè)的壓力差操作的膜式分離法如微濾或超濾歸納為膜式過濾。這些方法例如通過它們的分離極限來區(qū)分。因此，在超濾的情況下，截止極限不是以粒度為基礎(chǔ)的(例如微濾的情況下)，而是以摩爾質(zhì)量為基礎(chǔ)，該摩爾質(zhì)量范圍為約103至2×106Da。在超濾中，除了濾液(滲透物)外，還得到公知為濃縮物(保留物)的部分。
為了分離除去固體物質(zhì)，或者富集或者貧化，使用溶解的中等分子量和高分子量物質(zhì)，有利的是使用具有不對(duì)稱結(jié)構(gòu)的多孔性膜。
在有利的變體中，本發(fā)明使用的膜可由分離層(其進(jìn)行實(shí)際分離)和一層或多層支撐層(它攜帶分離層且具有比分離層要粗大的孔)構(gòu)成。分離層和支撐層可由有機(jī)或無機(jī)聚合物、陶瓷、金屬或碳組成，并且必須在反應(yīng)介質(zhì)中和工藝溫度下是穩(wěn)定的。其實(shí)例描述在表1中，但本發(fā)明不限于此。
膜可以以位于本身公知的扁平狀、管狀、多通道元件、毛細(xì)管或盤繞組件中的撓性管路或管、毛細(xì)管、中空纖維或平膜形式使用。
保留物和滲透物之間的最佳可透膜壓取決于膜孔的直徑或截止極限(以分子量單位表示)、膜的機(jī)械穩(wěn)定性和膜的類型，基本為1-40巴。較高可透膜壓一般導(dǎo)致較高的滲透物流量。在其中將進(jìn)料(待處理溶液)以過壓供入的情況下，可透膜壓可通過增加滲透物壓力來調(diào)節(jié)。
操作溫度取決于產(chǎn)物穩(wěn)定性和膜穩(wěn)定性。它為約20-90℃，優(yōu)選約40-70℃。較高的溫度導(dǎo)致較高的滲透物流量。例如可使用根據(jù)表2的膜，但本發(fā)明不限于此。
根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞分離也可有利地通過特定類型的膜式過濾，即滲濾來進(jìn)行。
滲濾可通過使含有D-泛酸的多價(jià)鹽的溶液通過包括容器、泵和一個(gè)或多個(gè)膜組件的回路，并設(shè)定該膜組件中的壓力以得到滲透物而分批進(jìn)行。連續(xù)或以一定次數(shù)加入不含待除去產(chǎn)物或含有待除去產(chǎn)物但其濃度低于加入該分離回路的時(shí)間點(diǎn)時(shí)的濃度的水或水溶液。根據(jù)本發(fā)明，該水溶液可含有多價(jià)陽離子的鹽，例如鈣或鎂的鹵化物或其混合物，優(yōu)選氯化鈣和/或氯化鎂。
根據(jù)本發(fā)明，利用滲濾的細(xì)胞除去也可優(yōu)選用多個(gè)串聯(lián)連接的膜組件或在每種情況下用一個(gè)或多個(gè)串聯(lián)連接的含有膜組件的泵回路來連續(xù)進(jìn)行。在膜組件或泵回路的上游、中間或下游，可加入不含待除去產(chǎn)物或含有待除去產(chǎn)物但其濃度低于進(jìn)料點(diǎn)的濃度的水或水溶液，在這種情況下，如在分批變體中，該水溶液可含有多價(jià)金屬的鹽，例如鈣或鎂的鹵化物或其混合物，優(yōu)選氯化鈣和/或氯化鎂。
根據(jù)本發(fā)明，超濾或滲濾可使用發(fā)酵排出物直接進(jìn)行或在發(fā)酵排出物例如通過離心分離、傾析或類似工序處理之后而進(jìn)行。
若根據(jù)本發(fā)明除去溶液中的細(xì)胞物質(zhì)或沉淀出來的成分，則根據(jù)本發(fā)明方法步驟b)的含有多價(jià)陽離子的鹽可在超濾或滲濾的過程中或之后加入。在本發(fā)明方法的變體中，加入的多價(jià)陽離子例如是氯化鈣和/或鎂、硝酸鈣和/或鎂、氫氧化鈣和/或鎂、甲酸鈣和/或鎂、乙酸鈣和/或鎂、丙酸鈣和/或鎂、氨基乙酸鈣和/或鎂和/或乳酸鈣和/或鎂。在這種情況下，可將多價(jià)陽離子例如Ca2+以0.05-50mol Ca2+/mol D-泛酸鹽，優(yōu)選0.2-2mol Ca2+/molD-泛酸鹽的濃度供入。
在本發(fā)明方法步驟c)中，然后將含有D-泛酸的多價(jià)鹽的溶液通過納米過濾來后處理，其中D-泛酸的多價(jià)鹽富集，并且不需要的一價(jià)離子，優(yōu)選一價(jià)陽離子例如銨離子、鈉離子或鉀離子同時(shí)貧化。在本發(fā)明方法中，一價(jià)陽離子，優(yōu)選銨離子、鉀離子和/或鈉離子的含量降至≤5g/kg溶液的濃度。
本發(fā)明包括所有市購納米過濾體系。分離有利地在具有不對(duì)稱結(jié)構(gòu)的多孔性膜上進(jìn)行。在本發(fā)明方法的優(yōu)選變體中，將由分離層(它進(jìn)行真正的分離)和單層或多層支撐層(它攜帶分離層且具有比分離層要粗大的孔)構(gòu)成的膜用于此。分離層和支撐層可由有機(jī)聚合物、陶瓷、金屬或碳組成，并且必須在反應(yīng)介質(zhì)中和工藝溫度下是穩(wěn)定的。優(yōu)選的分離層材料是聚酰胺、聚酰亞胺或聚哌嗪。分離層也可帶有正或負(fù)表面電荷。陰離子官能化的納米過濾膜的實(shí)例是DESAL 5 DK膜，但本發(fā)明不限于僅使用該膜。
膜可以以位于本身公知的扁平狀、管狀、多通道元件、毛細(xì)管或盤繞組件中的撓性管路或管、毛細(xì)管、中空纖維或平膜形式使用。
在本發(fā)明方法的有利變體中，在步驟c)的納米過濾中，建立5-100巴，優(yōu)選20-80巴，特別優(yōu)選40-70巴的跨膜壓力差。
本發(fā)明方法的溫度有利地為20-80℃，優(yōu)選30-60℃。另外，納米過濾可以分一個(gè)或多個(gè)步驟以本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的方式連續(xù)或分批進(jìn)行。
在優(yōu)選的變體中，每種情況下在一個(gè)或多個(gè)納米過濾步驟之前，將含有多價(jià)陽離子的鹽以固體或水溶液形式加入。根據(jù)本發(fā)明，將多價(jià)陽離子以氯化鈣和/或鎂、硝酸鈣和/或鎂、氫氧化鈣和/或鎂、甲酸鈣和/或鎂、乙酸鈣和/或鎂、丙酸鈣和/或鎂、氨基乙酸鈣和/或鎂和/或乳酸鈣和/或鎂加入。在這種情況下，可將作為多價(jià)陽離子的Ca2+以0.05-50mol Ca2+/mol D-泛酸鹽，優(yōu)選0.2-2mol Ca2+/mol D-泛酸鹽的濃度(基于混合后的狀態(tài))供入。
在本發(fā)明方法中，將含有多價(jià)陽離子的鹽以固體或水溶液在步驟a)的發(fā)酵過程中、優(yōu)選結(jié)束時(shí)或之后或在細(xì)胞分離過程中或之后加入。
而且根據(jù)本發(fā)明，在納米過濾步驟中加入含有多價(jià)陽離子的鹽是有利的。另外，可將含有多價(jià)陽離子的水溶液連續(xù)供入。
在本發(fā)明方法的另一變體中，可在一個(gè)或多個(gè)納米過濾的上游工藝步驟中產(chǎn)生不同產(chǎn)物濃度的溶液。所述溶液可通過納米過濾進(jìn)一步加工，使得在順序的納米過濾步驟中所述溶液以漸升的產(chǎn)物濃度提供。
根據(jù)本發(fā)明，作為上述本發(fā)明方法的結(jié)果，主要是泛酸的多價(jià)鹽富集在納米過濾的保留物中。在滲透物溶液中，主要是一價(jià)離子富集，而當(dāng)使用陰離子官能化的納米過濾膜時(shí)，一價(jià)陽離子富集。保留物中一價(jià)陽離子，優(yōu)選銨離子、鉀離子和/或鈉離子的含量在這種情況下可降至≤5g/kg溶液的濃度。
根據(jù)本發(fā)明，納米過濾的保留物或其一部分可再循環(huán)到本發(fā)明方法步驟a)的發(fā)酵中。滲透物或其一部分的再循環(huán)可連續(xù)進(jìn)行。上述進(jìn)行的工藝步驟除納米過濾外，用于預(yù)濃縮或進(jìn)一步濃縮多價(jià)鹽形式的D-泛酸鹽。
本發(fā)明使用的納米過濾的另一優(yōu)點(diǎn)在于在減少一價(jià)陽離子(在保留物溶液中)的同時(shí)可降低保留物的體積。因此，該含有D-泛酸鹽的發(fā)酵溶液通過納米過濾的后處理可根據(jù)本發(fā)明用作制備D-泛酸鹽的離子交換和濃縮法。
這有利地導(dǎo)致隨后的工藝步驟的簡(jiǎn)化和同時(shí)增加的效率。例如，由于濃縮，干燥中的能量消耗顯著減少。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，通過離心分離和/或傾析和/或超濾從發(fā)酵溶液中除去細(xì)胞物質(zhì)。在添加0.05-50mol(Ca2+)離子/mol泛酸根離子，優(yōu)選0.2-2mol Ca2+離子/mol泛酸根離子之后(它們優(yōu)選以含有0.01-10molCa2+/l的稀溶液形式加入)，將所得溶液引入納米過濾組件中。跨膜壓力差為約5-100巴，優(yōu)選約20-80巴，特別優(yōu)選約40-70巴。在這種情況下在納米過濾之前或之中，可將含有Ca2+離子的水溶液加入流過在進(jìn)料側(cè)上的膜的溶液中。保留物的體積為起始溶液的30-200％。另外，除去約5-99％、優(yōu)選30-80％所存在的一價(jià)陽離子。
然后，將優(yōu)選含有D-泛酸鈣、D-泛酸鎂或其混合物的保留物進(jìn)行干燥和/或配制。該含有D-泛酸鈣和/或D-泛酸鎂的溶液的干燥和/或配制通過本身已知的方法例如噴霧干燥、噴霧粒化、流化床干燥、流化床?；?、轉(zhuǎn)鼓式干燥或旋轉(zhuǎn)急驟干燥(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，第六版，1999，電子版，“固體材料的干燥”一章)來進(jìn)行。對(duì)流干燥中氣體入口溫度為100-280℃，優(yōu)選120-210℃。氣體出口溫度為50-180℃，優(yōu)選60-150℃。為了建立所需粒度分布和有關(guān)的產(chǎn)物性能，可分離出細(xì)顆粒并再循環(huán)。另外，可將粗材料在磨中研磨，并且然后同樣再循環(huán)。
本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)在于不需要的陽離子被有效且基本完全除去，而同時(shí)體積減小，使得隨后的工藝步驟，尤其干燥和/或配制得以簡(jiǎn)化或更有效。另外，沒有發(fā)生產(chǎn)物分解，或僅發(fā)生極低的產(chǎn)物分解，而同時(shí)具有高產(chǎn)物產(chǎn)率。通過在發(fā)酵過程中或發(fā)酵結(jié)束時(shí)或在超濾或滲濾過程中或結(jié)束時(shí)或在納米過濾步驟過程中供入多價(jià)陽離子的鹽溶液和/或通過將滲透物再循環(huán)到發(fā)酵溶液中，可進(jìn)一步提高多價(jià)、優(yōu)選二價(jià)離子如鈣離子或鎂離子形式的D-泛酸鹽的產(chǎn)率。
另外根據(jù)本發(fā)明，在上述方法中，在產(chǎn)生具有良好生物價(jià)值的所需產(chǎn)物的同時(shí)，減少復(fù)雜的后處理步驟是有利的，尤其是省略使用有機(jī)溶劑。另外，根據(jù)本發(fā)明，所產(chǎn)生的廢水量顯著減少。因此這導(dǎo)致進(jìn)一步節(jié)省復(fù)雜的后處理和處理車間。因此，本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)在于與傳統(tǒng)方法相比它更簡(jiǎn)單、不易出錯(cuò)、耗時(shí)更少、顯著便宜并因而更經(jīng)濟(jì)。
然而，這并不排除本發(fā)明方法可以變化。本文開頭提及的本發(fā)明方法可通過一個(gè)或多個(gè)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟悉的下列工藝步驟來補(bǔ)充。在這種情況下，本發(fā)明包括下列工藝步驟與至今已知的工藝步驟的所有可能組合。
因此，例如可通過加熱(滅菌)或其它方法如巴氏消毒法或無菌過濾將來自本發(fā)明方法的溶液消毒。
在本發(fā)明方法的其它變體中，在干燥和/或配制保留物之前，可進(jìn)行至少一個(gè)下列步驟和/或這些步驟的組合生物質(zhì)的溶菌和/或滅菌和/或該生物質(zhì)從發(fā)酵溶液中的分離和/或加入其它添加劑和/或優(yōu)選通過除去水將該發(fā)酵溶液濃縮。
因此，本發(fā)明還涉及一種其中在發(fā)酵溶液中仍舊進(jìn)行生物質(zhì)的溶菌和/或滅菌或直到從該發(fā)酵溶液中分離除去該生物質(zhì)之后才進(jìn)行前述步驟的方法。這例如可通過優(yōu)選80-200℃下的溫度處理和/或優(yōu)選用硫酸或鹽酸的酸處理和/或優(yōu)選用溶菌酶的酶催方法來進(jìn)行。
也可直接通過納米過濾將所存在的細(xì)胞物質(zhì)除去，即同時(shí)進(jìn)行一價(jià)陽離子的交換，而多價(jià)陽離子保留。
可將通過納米過濾后處理所得的溶液在干燥和/或配制之前通過適合的蒸發(fā)器如降膜式蒸發(fā)器、薄膜式蒸發(fā)器或旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器濃縮。這些蒸發(fā)器例如由GIG(4800 Attnang Puchheim，奧地利)、GEA Canzler(52303Düren，德國)、Diessel(31103 Hildesheim，德國)和Pitton(35274 Kirchhain，德國)制造。
為了改善終產(chǎn)物的顏色性能，可進(jìn)行其中將少量活性炭加入該工藝過程中所得的溶液中的額外過濾步驟，并然后將該懸浮液過濾。或者，可使發(fā)酵過程中所得的溶液通過小活性炭床。為此所需的活性炭用量為該溶液重量的百分之幾，并且該量憑借本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員的知識(shí)和判斷是已知的。
這些過濾可通過在過濾之前向各溶液中加入工業(yè)上傳統(tǒng)的助凝劑(例如Sedipur CF 902或Sedipur CL 930，產(chǎn)自BASF AG，Ludwigshafen)而得以簡(jiǎn)化。
在本發(fā)明的有利實(shí)施方案中，發(fā)酵排出物(發(fā)酵液)通過加熱來滅菌，然后通過離心分離、過濾、超濾或傾析除去細(xì)胞物質(zhì)。在基于發(fā)酵排出物加入50-1000mg/kg、優(yōu)選100-200mg/kg工業(yè)上傳統(tǒng)的助凝劑之后，將該懸浮液過濾通過活性炭與砂子的短床以得到具有高D-泛酸含量的不含生物質(zhì)的溶液。然后將該處理后的溶液通過納米過濾進(jìn)行處理。
然后將該溶液例如通過噴霧干燥而干燥。這可以并流、逆流或混合流進(jìn)行。為了霧化，可使用所有已知的霧化器，尤其是離心霧化器(霧化盤)、單流噴嘴或雙流噴嘴。優(yōu)選的干燥溫度條件是150-250℃的塔入口溫度和70-130℃的塔出口溫度。然而，干燥也可在更高或更低的溫度水平下進(jìn)行。為了得到非常低的殘留濕氣，可以在流化床下游提供另一干燥步驟。
噴霧干燥也可在FSD或SBD干燥器中進(jìn)行(FSD流化床噴霧干燥器；SBD噴霧床干燥器)，如由Niro(丹麥哥本哈根)和APV-Anhydro(丹麥哥本哈根)制造的，它們是噴霧干燥器與流化床的組合。
在噴霧干燥過程中，可添加助流劑。這可減少干燥器壁上的沉積并改善流動(dòng)特性，特別是在細(xì)粒粉末的情況下?？墒褂玫闹鲃┯绕涫枪杷猁}、硬脂酸鹽、磷酸鹽和玉米淀粉。
原則上，干燥也可在噴霧的流化床中進(jìn)行，在這種情況下這不僅可連續(xù)進(jìn)行，還可分批進(jìn)行。可將溶液不僅從頂部(頂部噴霧)和從底部(底部噴霧)噴霧，而且還可從側(cè)面(側(cè)面噴霧)進(jìn)行噴霧。
本發(fā)明還涉及一種用作動(dòng)物飼料添加劑和/或動(dòng)物飼料添加物的組合物，其中它可通過如下步驟制備a)使用至少一種產(chǎn)生D-泛酸的生物，在該生物中去調(diào)節(jié)泛酸(pan)和/或異亮氨酸/纈氨酸(ilv)的生物合成，并且該生物通過在培養(yǎng)基中發(fā)酵形成至少2g/l D-泛酸鹽，其中該培養(yǎng)基中供入有0-20g/l、優(yōu)選0g/l游離β-丙氨酸和/或β-丙氨酸鹽，b)將含有多價(jià)陽離子的鹽供入所形成的D-泛酸鹽中，其中得到D-泛酸的多價(jià)鹽，c)將該含有D-泛酸鹽的發(fā)酵溶液通過納米過濾后處理，其中該D-泛酸的多價(jià)鹽富集，以及d)將含有D-泛酸的多價(jià)鹽的納米過濾保留物進(jìn)行干燥和/或配制。
在本發(fā)明的變體中，包括一種組合物，該組合物通過在步驟c)的納米過濾之前優(yōu)選通過膜式過濾、特別優(yōu)選通過超濾、非常特別優(yōu)選通過滲濾將溶液中的細(xì)胞物質(zhì)或沉淀出來的成分除去來制備。本發(fā)明還涉及一種組合物，該組合物可通過將含有多價(jià)陽離子的鹽(以固體或水溶液形式)在除去溶液中的細(xì)胞物質(zhì)或沉淀出來的成分的過程中或之后供入來制備。根據(jù)本發(fā)明，在另一變體中，也可將這些鹽在納米過濾過程中供入。
根據(jù)本發(fā)明，所述組合物的進(jìn)一步特征在于它包含濃度為至少1-100重量％、優(yōu)選至少20-100重量％、特別優(yōu)選至少50重量％的D-泛酸鹽。本發(fā)明涉及一種包含D-泛酸的二價(jià)陽離子形式的鹽、優(yōu)選D-泛酸鈣和/或D-泛酸鎂的組合物。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選D-泛酸的一價(jià)陽離子形式的鹽的含量≤5g/lg的組合物。
根據(jù)本發(fā)明，通過上述方法，得到滿足飼料添加劑要求的D-泛酸鈣或D-泛酸鎂。這些要求例如是較高含量的D-泛酸鹽和與目標(biāo)生物的高相容性以及高的表示本發(fā)明產(chǎn)物的“維生素活性”的生物價(jià)值。
本發(fā)明將通過下列實(shí)施例更詳細(xì)地描述，然而這些實(shí)施例不是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1在容量為14升的裝有攪拌器和氣體引入裝置的實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵罐中加入具有下列組成的含水發(fā)酵培養(yǎng)基
滅菌后，加入下列無菌培養(yǎng)基成分
所述痕量鹽溶液具有下列組成0.15g Na2MoO4·2H2O、2.5g H3BO3、0.7g CoCl2·6H2O、0.25gCuSO4·5H2O、1.6g MnCl2·4H2O、0.3g ZnSO4·7H2O與水共同構(gòu)成1升。該痕量鹽溶液通過無菌過濾加入。初始液體體積為5升。上面所給含量以該值為基礎(chǔ)。
向該溶液中，加入100ml枯草芽孢桿菌PA668的接種培養(yǎng)物(OD＝10)，并將該接種的培養(yǎng)物于43℃和劇烈攪拌下在12L/min的氣體引入速率下發(fā)酵。該菌株按照US 262,995中的附件進(jìn)行描述。
在47h內(nèi)，加入2.1升無菌水溶液，其組成如下
在發(fā)酵過程中，通過加入25％濃度的氨溶液或20％濃度的磷酸將pH保持為7.2。氨同時(shí)還起發(fā)酵用氮源的作用?？刂茢嚢杵髟霓D(zhuǎn)速，以將溶解的氧氣含量保持為其飽和值的30％。在停止加入碳源之后，繼續(xù)發(fā)酵直到溶解的氧氣含量(pO2)達(dá)到其飽和值的95％。D-泛酸鹽的濃度在48h后停止時(shí)為22.8g/l。
按相似方法，也可生產(chǎn)未供入β-丙氨酸且泛酸滴定度大于20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85和＞90g/l的發(fā)酵液。
實(shí)施例2將7000ml根據(jù)實(shí)施例1制備的發(fā)酵排出物進(jìn)行超離心，其中使用陶瓷單通道管式組件(來自Atech，Gladbeck，德國)。在這種情況下，首先使用孔寬度為20kD(10nm)的膜，然后使用孔寬度為50nm的膜。
實(shí)驗(yàn)溫度為40℃，溢流速率為4m/s，除非另有說明，可透膜壓(TMP＝[p(進(jìn)料)+p(保留物)]/2-p(滲透物))為1巴。
在

圖1中，將可透膜流量(滲透物流量)對(duì)濃集因素MK(MK(t)＝m進(jìn)料/m保留物(t))作圖。
顯而易見的是，具有較低孔寬度(20kD)的膜比具有較大孔寬度(50nm)的膜具有顯著更高的流量。
實(shí)施例3在與實(shí)施例2相似的條件下，將7000ml如實(shí)施例1制備的發(fā)酵排出物進(jìn)行超濾，其中所用膜的孔寬度為20kD。
圖2表明，使用已經(jīng)離心分離的發(fā)酵排出物得到的濃度顯著高于實(shí)施例2中的濃度。
實(shí)施例4將1000ml含有泛酸鈣的水溶液(根據(jù)表3，保留物進(jìn)料一欄)置于最大操作容量約1.5升的攪拌器壓力池中。通過氮?dú)膺^壓在該池子中產(chǎn)生“進(jìn)料”壓力，并通過使用由電磁連軸節(jié)驅(qū)動(dòng)的錨式攪拌器的攪拌來保證膜的溢流。
使用從在Moers的Osmonics Deutschland GmbH得到的納米過濾膜DESAL 5DK。
在用上述溶液的實(shí)驗(yàn)之前、之中或之后，為了試驗(yàn)?zāi)さ耐暾?，用MgSO4溶液(2000ppm(重量))進(jìn)行舍棄試驗(yàn)。
舍棄率Ri列于表3右邊的兩欄中。此處，舍棄率定義如下Ri＝1-Ci， 滲透物/Ci，保留物；其中Ri＝組分i的舍棄率，Ci，滲透物＝滲透物中組分i的濃度，Ci， 保留物＝保留物中組分i的濃度。
各濃度指在限定時(shí)間點(diǎn)下在非穩(wěn)態(tài)實(shí)驗(yàn)中即刻建立的濃度，但不是試驗(yàn)結(jié)束后得到的級(jí)分中的濃度。在理想情況下，舍棄率Ri與濃度無關(guān)，它也用作由各級(jí)分中的濃度來計(jì)算報(bào)導(dǎo)值的基礎(chǔ)。
由表3可見，Ca2+和泛酸根的舍棄率分別為84％和99％，也就是說它們存在保留物中。
實(shí)施例5在泛酸鈉水溶液(0.2mol/l)的后處理過程中，在與實(shí)施例4相似的條件下通過納米過濾進(jìn)行濃縮。表4表明，泛酸根的舍棄率為80％。
實(shí)施例6在與實(shí)施例4相似的條件下的NaCl/CaCl2等摩爾溶液的濃縮總結(jié)在表5中。由該表可見，該膜對(duì)Ca2+的舍棄率為41％或42％，與鈣和泛酸根組合的情形下的高舍棄率(實(shí)施例5)相比，該舍棄率較低。
附圖和附表說明圖1超濾過程中發(fā)酵排出物的可透膜流量(滲透物流量)作為使用孔寬度為50nm和20kD的膜的濃集因素MK的函數(shù)的圖解表示。
圖2超濾過程中經(jīng)離心的發(fā)酵排出物的可透膜流量(滲透物流量)作為使用孔寬度為20kD的膜的濃集因素MK的函數(shù)的圖解表示。
表1將溶液中的細(xì)胞物質(zhì)或沉淀出來的成分分離除去的具有不對(duì)稱結(jié)構(gòu)的膜的概要。
表2將溶液中的細(xì)胞物質(zhì)或沉淀出來的成分分離除去的膜及其性能的概要。
表3納米過濾的分析值、尤其是有關(guān)含有0.1mol/kg泛酸鈣和0.2mol/kg NaCl的水溶液中鈣離子和泛酸根的舍棄率的概要。
表4納米過濾的分析值、尤其是有關(guān)含有0.2mol/l泛酸鈉和0.1mol/lCaCl2的水溶液中鈣離子和泛酸根的舍棄率的概要。
表5納米過濾的分析值、尤其是有關(guān)含有等摩爾量NaCl和CaCl2的水溶液中鈣離子的舍棄率的概要。
權(quán)利要求
1.一種制備D-泛酸和/或其鹽的方法，其包括如下步驟a)使用至少一種產(chǎn)生D-泛酸的生物，在該生物中去調(diào)節(jié)泛酸(pan)和/或異亮氨酸/纈氨酸(ilv)的生物合成，并且該生物通過在培養(yǎng)基中發(fā)酵形成至少2g/l D-泛酸鹽，其中該培養(yǎng)基中供入有0-20g/l游離β-丙氨酸和/或β-丙氨酸鹽，b)將含有多價(jià)陽離子的鹽供入所形成的D-泛酸鹽中，其中形成D-泛酸的多價(jià)鹽，c)將該含有D-泛酸的多價(jià)鹽的溶液通過納米過濾來后處理，其中該D-泛酸的多價(jià)鹽富集，以及d)將含有D-泛酸的多價(jià)鹽的納米過濾保留物進(jìn)行干燥和/或配制。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述培養(yǎng)基中沒有供入游離β-丙氨酸和/或β-丙氨酸鹽。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所用的產(chǎn)生D-泛酸的生物是細(xì)菌、酵母或真菌。
4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其中所用微生物是來自芽孢桿菌科的細(xì)菌。
5.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其中使用芽孢桿菌屬的細(xì)菌，優(yōu)選枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌種。
6.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟a)中，形成D-泛酸和/或其鹽，含量為至少10g/l培養(yǎng)基，優(yōu)選至少20g/l，特別優(yōu)選至少40g/l，非常高度優(yōu)選至少60g/l培養(yǎng)基。
7.如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟c)中的納米過濾之前將溶液中的細(xì)胞物質(zhì)或沉淀出來的成分分離除去。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述分離通過傾析或膜式過濾、優(yōu)選超濾來進(jìn)行。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其中所述膜式過濾以滲濾進(jìn)行。
10.如權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述含有多價(jià)陽離子的鹽以固體或水溶液形式在步驟a)的發(fā)酵過程中、優(yōu)選結(jié)束時(shí)或之后或含有D-泛酸鹽的溶液的膜式過濾過程中或之后加入。
11.如權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)所述的方法，其中將含有多價(jià)陽離子的鹽以固體或水溶液形式在納米過濾過程中加入。
12.如權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的方法，其中將含有多價(jià)陽離子的水溶液連續(xù)供入。
13.如權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多價(jià)陽離子以氯化鈣和/或鎂、硝酸鈣和/或鎂、氫氧化鈣和/或鎂、甲酸鈣和/或鎂、乙酸鈣和/或鎂、丙酸鈣和/或鎂、氨基乙酸鈣和/或鎂和/或乳酸鈣和/或鎂加入。
14.如權(quán)利要求1-13任一項(xiàng)所述的方法，其中所供入的多價(jià)陽離子是濃度為0.05-50mol Ca2+/mol D-泛酸鹽、優(yōu)選0.2-2mol Ca2+/mol D-泛酸鹽的Ca2+。
15.如權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟c)中的納米過濾中，建立5-100巴，優(yōu)選20-80巴，特別優(yōu)選40-70巴的跨膜壓力差。
16.如權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟c)中的納米過濾使一價(jià)陽離子，優(yōu)選銨離子、鉀離子和/或鈉離子的含量降至≤5g/kg溶液的濃度。
17.如權(quán)利要求1-16任一項(xiàng)所述的方法，其中將來自步驟c)的滲透物或其一部分再循環(huán)到步驟a)的發(fā)酵中。
18.如權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述滲透物或其一部分連續(xù)再循環(huán)。
19.如權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所述的方法，其中來自步驟c)的保留物是含有D-泛酸的多價(jià)鹽的懸浮液。
20.一種用作動(dòng)物飼料添加劑和/或動(dòng)物飼料添加物的組合物，其可通過如下步驟制備a)使用至少一種產(chǎn)生D-泛酸的生物，在該生物中去調(diào)節(jié)泛酸(pan)和/或異亮氨酸/纈氨酸(ilv)的生物合成，并且該生物通過在培養(yǎng)基中發(fā)酵形成至少2g/l D-泛酸鹽，其中該培養(yǎng)基中供入有0-20g/l、優(yōu)選0g/l游離β-丙氨酸和/或β-丙氨酸鹽，b)將含有多價(jià)陽離子的鹽供入所形成的D-泛酸鹽中，其中得到D-泛酸的多價(jià)鹽，c)將該含有D-泛酸的多價(jià)鹽的溶液通過納米過濾來后處理，其中該D-泛酸的多價(jià)鹽富集，以及d)將含有D-泛酸的多價(jià)鹽的納米過濾保留物進(jìn)行干燥和/或配制。
21.如權(quán)利要求20所述的組合物，其可通過在步驟c)之前優(yōu)選通過膜式過濾、特別優(yōu)選通過超濾、非常特別優(yōu)選通過滲濾將溶液中的細(xì)胞物質(zhì)或沉淀出來的成分除去來制備。
22.如權(quán)利要求20或21所述的組合物，其中將含有多價(jià)陽離子的鹽在分離溶液中的細(xì)胞物質(zhì)或沉淀出來的成分的過程中或之后供入。
23.如權(quán)利要求20-22任一項(xiàng)所述的組合物，其中將含有多價(jià)陽離子的鹽在納米過濾之前或之中供入。
24.如權(quán)利要求20-23任一項(xiàng)所述的組合物，含有D-泛酸的二價(jià)陽離子形式的鹽，優(yōu)選D-泛酸鈣和/或D-泛酸鎂。
25.如權(quán)利要求20-24任一項(xiàng)所述的組合物，含有濃度為1-100重量％、優(yōu)選20-100重量％、特別優(yōu)選至少50重量％的D-泛酸鹽。
26.如權(quán)利要求20-25任一項(xiàng)所述的組合物，其中D-泛酸的一價(jià)陽離子形式的鹽的含量≤5g/kg。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備D－泛酸和/或其鹽的改進(jìn)方法以及所述物質(zhì)作為動(dòng)物飼料添加劑的用途。
文檔編號(hào)C12R1/125GK1492933SQ02805274
公開日2004年4月28日 申請(qǐng)日期2002年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月21日
發(fā)明者C·貝克, H-P·哈爾茨, D·克萊因, M·萊曼, M·洛沙德伊特, S·比特利希, H·福斯, C 貝克, 乩, 車亂撂, 騁 申請(qǐng)人:巴斯福股份公司