專利名稱::可誘導(dǎo)RNAi途徑的用于基因治療的系列重組腺相關(guān)病毒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
:本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域:
,具體涉及一系列通過RNAi途徑特異地抑制特定疾病相關(guān)基因的用于基因治療領(lǐng)域的腺病毒伴隨病毒載體的構(gòu)建策略、方法及用途。
背景技術(shù):
:本發(fā)明申請是在我們所申請的前一個(gè)類似的發(fā)明專利申請(專利申請?zhí)?2125762.0,發(fā)明名稱利用RNA干擾現(xiàn)象介導(dǎo)功能基因下調(diào)的腺相關(guān)病毒載體)的基礎(chǔ)上(馬鑫,魯曉春,吳小兵等。AAV載體質(zhì)粒介導(dǎo)的熒光素酶shRNA抑制其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志,2002,16(3)253-255)所做的進(jìn)一步的應(yīng)用,同時(shí),也是重組腺相關(guān)病毒載體的進(jìn)一步的應(yīng)用(WUZj,WUXb,CAOH,等,Anovelandhighlyefficientproductionsystemforrecombinantadeno-associatedvirusvector.中國科學(xué)C輯英文2002;45(1)96-104。吳小兵,董小巖,伍志堅(jiān)等.一種快速高效分離和純化重組腺病毒伴隨病毒載體的方法??茖W(xué)通報(bào),2000,45(19)2071-2075。伍志堅(jiān),吳小兵,曹暉等.一種高效的重組腺伴隨病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)。中國科學(xué)C輯,2001,31(5)423-430)。在專利申請?zhí)枮?2125762.0的發(fā)明專利申請中,我們描述了用重組腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒pSNAV質(zhì)粒攜帶RNAi核苷酸片段,將攜帶RNAi的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)或動(dòng)物體內(nèi),從而使質(zhì)粒能在細(xì)胞內(nèi)或動(dòng)物體內(nèi)源源不斷地復(fù)制RNAi核苷酸片段,來達(dá)到RNAi核苷酸片段應(yīng)起到的生物學(xué)作用。另外,該RNAi核苷酸片段也被包裝成為一種攜帶了RNAi核苷酸片段的重組腺相關(guān)病毒(載體),通過重組腺相關(guān)病毒這種載體進(jìn)行RNAi核苷酸片段的基因轉(zhuǎn)移和基因復(fù)制,來達(dá)到RNAi核苷酸片段應(yīng)起到的生物學(xué)作用。在專利申請?zhí)枮?2125762.0的發(fā)明專利申請中,做為實(shí)施例,我們應(yīng)用上述思路和策略構(gòu)建了一個(gè)短發(fā)夾環(huán)表達(dá)質(zhì)粒(pSNAV/U6/Luc),并使其在BHK-21細(xì)胞中抑制熒光素酶的表達(dá)(馬鑫,吳小兵等,AAV載體質(zhì)粒介導(dǎo)的熒光素酶shRNA抑制其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志。2002,16(3)253-255)。該實(shí)施例的具體方法是從人基因組DNA中設(shè)計(jì)引物用PCR調(diào)出人U6snRNA啟動(dòng)子,與被9bp序列間隔的21bp熒光素酶靶序列的反向重復(fù)及AAV載體質(zhì)粒pSNAV相連接,構(gòu)建成熒光素酶RNAi表達(dá)質(zhì)粒pSNAV/U6/Luc。將熒光素酶RNAi表達(dá)質(zhì)粒pSNAV/U6/Luc與pMAMneoLuc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,以及單獨(dú)轉(zhuǎn)染熒光素酶細(xì)胞株,分別檢測對熒光素酶表達(dá)的抑制效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示pSNAV/U6/Luc對共轉(zhuǎn)染的pMAMneoLuc中熒光素酶的表達(dá)抑制50%,而對熒光素酶細(xì)胞株中熒光素酶的表達(dá)抑制70%。抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)體內(nèi)轉(zhuǎn)錄出的短發(fā)夾環(huán)熒光素酶能夠有效抑制其在BHK-21細(xì)胞中的表達(dá)?;虺聊?GENESILENCING)現(xiàn)象廣泛存在于植物、真菌和動(dòng)物(LeirdalM,SioudM.GenesilencinginmammaliancellsbypreformedsmallRNAduplexes.BiochemBiophysResCommun.2002Jul19;295(3)744-8.)中,由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的興起,人們對轉(zhuǎn)基因沉默進(jìn)行了更深入的研究。在高等植物中大約30%的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)都導(dǎo)致了基因沉默,是一種普遍存在的基因調(diào)控機(jī)制。轉(zhuǎn)基因沉默主要分為兩種類型一是轉(zhuǎn)錄水平上的基因沉默(TranscriptionalGeneSilencing,TGS),二是轉(zhuǎn)錄后水平上的基因沉默(PosttranscriptionalGeneSilencing,PTGS)。前者是發(fā)生在核內(nèi)的事件,而后者發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中。兩者都與超甲基化(Hypermethylated)有關(guān),在TGS現(xiàn)象中,甲基化主要發(fā)生在啟動(dòng)子區(qū)域,基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制;而PTGS中,甲基化主要發(fā)生在基因的編碼區(qū),基因能夠轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生mRNA,但mRNA在細(xì)胞質(zhì)中被特異性地降解。二者在時(shí)間上并非簡單的前后關(guān)系,在空間上也不因?yàn)楹四さ拇嬖诙嗷ジ綦x。轉(zhuǎn)錄后沉默表現(xiàn)為一種序列特異性的RNA降解過程,主要作用于同源性較高的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,包括具有同源性的內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。它廣泛存在于各種生物中,直到最近人們才發(fā)現(xiàn)在植物中被稱為共抑制(Cosuppression)、真菌中被稱為(Quelling)、動(dòng)物中被稱為RNA干擾(RNAinterference,RNAi)的現(xiàn)象可能具有很大的相似性,都與PTGS現(xiàn)象有關(guān)(HannonGJ.RNAinterference.Nature.2002Jul11;418(6894)244-51.)?,F(xiàn)在普遍認(rèn)為PTGS是生物在長期進(jìn)化過程中所形成的對病毒、轉(zhuǎn)座因子和其它可轉(zhuǎn)移核酸的防御系統(tǒng)。因?yàn)檫@些外源核酸的引入很可能使宿主細(xì)胞內(nèi)的平衡機(jī)制遭到致命破壞。而轉(zhuǎn)基因沉默,無非是宿主細(xì)胞將外源基因視為對自身有害的序列而將其抑制。細(xì)胞對外源核酸的這種抑制作用具有序列特異性的特點(diǎn),所以一旦細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄后沉默機(jī)制被啟動(dòng),細(xì)胞對轉(zhuǎn)入的核酸的同源序列就有了“免疫”能力。盡管PTGS(首先在植物和真菌中證實(shí))和RNAi(首先在caenorhabditis線蟲和果蠅中觀察到)分別被證實(shí),遺傳和生化分析揭示這些多步驟途徑間的進(jìn)化上的聯(lián)系。這些途徑有一些共同的成分,包括它們被雙鏈RNA(dsRNA)引發(fā),且引發(fā)的dsRNA被酶切加工成小的長為20-25個(gè)堿基的片段,這些片段介導(dǎo)序列特異性識(shí)別靶單鏈RNA(ssRNA)。已經(jīng)證實(shí)負(fù)責(zé)切割引發(fā)dsRNA的酶是dsRNA特異性RNase,稱為Dicer,產(chǎn)生dsRNA降解產(chǎn)物。這些小dsRNA或者短的干擾性RNAs(siRNAs)作為降解靶ssRNA所需的酶復(fù)合體的向?qū)Вㄔ趯?yīng)于輸入dsRNA的區(qū)域中常規(guī)間隙中21-23個(gè)堿基。Dicer還有解旋酶活性,其它區(qū)域的功能尚不能確定,這些對果蠅和線蟲中的RNAi是很重要的。而且,Dicer在正常發(fā)育所需的轉(zhuǎn)錄物的加工中有作用。到目前為止,僅證實(shí)多亞基復(fù)合體或者RNA介導(dǎo)的切割靶RNA沉默復(fù)合體(RISC)中的一種蛋白質(zhì)成分Argonaute2。dsRNA引發(fā)哺乳動(dòng)物體細(xì)胞中的基因沉默小的合成的dsRNA或者siRNA能夠避免哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基因表達(dá)的這種非特異性抑制。研究RNAi作為實(shí)驗(yàn)調(diào)控基因表達(dá)和在基因組水平探索基因功能的一種方法。RNA干擾是一種進(jìn)化上保守的基因組水平的免疫監(jiān)控機(jī)制,是多步驟過程,涉及通過RNaseIII內(nèi)切核酸酶Dicer的作用產(chǎn)生有活性的小的21-23nt干擾性RNA(siRNA),介導(dǎo)其互補(bǔ)同源mRNA序列的特異性降解(HannonGJ.RNAinterference.Nature.2002Jul11;418(6894)244-51。SharpPA.RNAinterference-2001.GENES&DEVELOPMENT,2001,15485-490)。RNAi現(xiàn)象廣泛發(fā)現(xiàn)于真菌、擬南芥、水螅、渦蟲、錐蟲、斑馬魚等大多數(shù)真核生物中。RNAi的機(jī)制正在逐步闡明,與此同時(shí),作為功能基因組研究領(lǐng)域中的有力工具,RNAi也越來越為人們所重視。有關(guān)RNAi最令人感興趣的地方是1.dsRNA即雙鏈RNA,而非單鏈反義RNA,是干擾試劑。2.其作用是高度特異的。3.其作用強(qiáng)度是相當(dāng)強(qiáng)的(每個(gè)細(xì)胞中僅需要幾個(gè)dsRNA分子即可以產(chǎn)生有效的干預(yù))4.干預(yù)活性(并假設(shè)是dsRNA)能在遠(yuǎn)離導(dǎo)入位點(diǎn)的細(xì)胞和組織中產(chǎn)生干預(yù)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞對dsRNAs的反應(yīng)可以活化兩條途徑,超過30bp的dsRNAs引起的廣泛的非序列特異性mRNA的降解和翻譯的關(guān)閉,體外合成的短的dsRNA分子19-23bp(shortdsRNAmolecules,siRNA)模擬RNAi途徑中間體,能在哺乳動(dòng)物中引起序列特異性的基因表達(dá)的抑制(BrummelkampTR,BernardsR,AgamiR.AsystemforstableexpressionofshortinterferingRNAiinmammaliancells.Science,2002,296550-553。SuiG,SoohooC,AffarEIB,etal.ADNAvectorbasedRNAitechnologytosuppressgeneexpressioninmammaliancells.PNAS,2002,995515-5520。YuJY,DeRuiterSL,TurnerDL.RNAinterferencebyexpressionofshort-interferingRNAsandhairpinRNAsinmammaliancells.PNAS,2002,996047-6052)。RNA干擾(RNAi)是一種具有高度的序列專一性,特異地使特定基因沉默,使其功能喪失或降低的一種RNA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式,它屬于轉(zhuǎn)錄后水平上的基因沉默(PosttranscriptionalGeneSilencing,PTGS)。RNA干擾(RNAi)的基本過程分兩步,首先進(jìn)入細(xì)胞的雙鏈RNA(doublestrandsRNA,dsRNS)被一種RNA酶III家族成員Dicer切割成21-23核苷酸長的小RNA片段(smallinterferingRNAs,siRNA),這些siRNA片段可與該核酸酶的dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合,整合進(jìn)入RNA沉默復(fù)合物(RISC),作為模板識(shí)別目的mRNA,在RISC復(fù)合物中,mRNA與dsRNA的有義鏈發(fā)生鏈互換,原先dsRNA中的有義鏈被mRNA代替,從酶-dsRNA復(fù)合物中釋放出來,而mRNA則處于原先的有義鏈的位置。核酸酶在同樣位置對mRNA進(jìn)行切割降解,這樣又產(chǎn)生了21-23核苷酸長的dsRNA小片段,與核酸酶形成復(fù)合物,繼續(xù)對目的mRNA進(jìn)行切割,從而使目的基因沉默,產(chǎn)生RNAi現(xiàn)象(RNA干擾,RNAinterference)。其優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)在于其高度的序列專一性和高效的靶基因抑制效率。RNAi現(xiàn)象在各種生物的基因調(diào)控機(jī)制中廣泛存在,被認(rèn)為是一種細(xì)胞抗RNA病毒復(fù)制的機(jī)制,與其它幾種導(dǎo)致功能喪失或降低突變的技術(shù)相比,RNAi技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢,它比反義RNA技術(shù)和同源共抑制更有效,更容易產(chǎn)生功能喪失。正是其高度序列專一性和高效靶基因抑制效率的特點(diǎn)使其倍受矚目,從發(fā)現(xiàn)至今的短短不足5年間RNAi技術(shù)的應(yīng)用從線蟲、斑馬魚等低等生物迅速擴(kuò)展到高等植物、哺乳動(dòng)物。目前RNAi技術(shù)主要做為一種強(qiáng)有力的用以確定特定基因功能的后基因組計(jì)劃研究工具,用以對特定基因進(jìn)行功能喪失或降低突變,從而確定其功能,并已在美麗線蟲的幾近全部19000個(gè)基因功能分析中獲得成功。1.早期的RNAi技術(shù)是通過注射或浸泡等方法將合成的dsRNA直接導(dǎo)入靶組織細(xì)胞內(nèi)的,這些方法雖然可以抑制目的基因的表達(dá),但這種基因沉默卻不能穩(wěn)定存在(BillyE,BrondaniV,ZhangH,etal.Specificinterferencewithgeneexpressioninducedbylong,double-strandedRNAinmouseembryonalteratocarcinomacelllines.ProcNatlAcadSciUSA.2001Dec4;98(25)14428-33。ElbashirSM,HarborthJ,LendeckelW,etal.Duplexesof21-nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells.Nature.2001May24;411(6836)494-8。FraserAG,KamathRS,ZipperlenP,etal.FunctionalgenomicanalysisofC.eleganschromosomeIbysystematicRNAinterference.Nature.2000Nov16;408(6810)325-30。SchmidtU,MonteF,MiyamotoMI,etal.RestorationofdiastolicfunctioninsenescentratheartsthroughadenoviralgenetransferofsarcoplasmicreticulumCa2+-ATPase.Circulation2000;101790-6)。而后科學(xué)家們對RNAi技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn),將目的基因的靶序列以反向重復(fù)的方式,在特定啟動(dòng)子調(diào)控下,在轉(zhuǎn)基因生物中表達(dá)形成具發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的dsRNA產(chǎn)物,從而使目的基因沉默。進(jìn)入2002年,關(guān)于RNAi的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體不斷涌現(xiàn),最初的載體采用長莖發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)(longhairpinRNA,lhRNA),使目的基因得到極大抑制,達(dá)到90%以上,但因其激活RNA依賴蛋白激酶(RNA-dependentproteinkinase,PKR)、引發(fā)其他mRNA非特異降解和機(jī)體干擾素反應(yīng),而應(yīng)用受限。隨后科學(xué)家們(MiyagishiM,TairaK.U6promoterdrivensiRNAswithfoururidine3′overhangsefficientlysuppresstargetedgeneexpressioninmammaliancells.NatureBiotechnol.2002May;20(5)497-500。PaulCP,GoodPD,WinerI,etal.EffectiveexpressionofsmallinterferingRNAinhumancells.NatBiotechnol.2002May;20(5)505-8)利用在DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶III(TFIII)的基因外啟動(dòng)子(包括U6snRNA、H1RNA等)構(gòu)建了可形成具小片段(19-23堿基莖)發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)dsRNA(shorthairpinRNA,shRNA)產(chǎn)物的載體,模仿Dicer切割成的21-23bpsiRNA獲得成功,該方法具有抑制作用強(qiáng)、不激活PKR、不引發(fā)其他mRNA降解、表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定、作用持久等優(yōu)點(diǎn)。目前已有數(shù)個(gè)對此的相關(guān)報(bào)導(dǎo)(PaddisonPJ,CaudyAA,BernsteinE,etal.ShorthairpinRNAs(shRNAs)inducesequence-specificsilencinginmammaliancells.GenesDev.2002Apr15;16(8)948-58.PaddisonPJ,CaudyAA,HannonGJ.StablesuppressionofgeneexpressionbyRNAiinmammaliancells.PNAS.2002,991443-1448。SuiG,SoohooC,AffarEIB,etal.ADNAvectorbasedRNAitechnologytosuppressgeneexpressioninmammaliancells.PNAS,2002,995515-5520。Wurl,P.;Kappler,M.;Meye,A.;etalCo-expressionofsurvivinandTERTandriskoftumour-relateddeathinpatientswithsoft-tissuesarcoma.Lancet2002,359943-945,.),并有利用該類載體構(gòu)建的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系產(chǎn)生。在傳統(tǒng)反義基因治療方案中,人們通常病毒、質(zhì)粒等方式,使特定靶基因的反義鏈得以表達(dá),或直接通過非病毒載體導(dǎo)入經(jīng)或未經(jīng)修飾的反義DNA(EizemaK,F(xiàn)echnerH,BezstarostiK,etal.Adenovirus-basedphospholambanantisenseexpressionasanovelapproachtoimprovecardiaccontractiledysfunctioncomparisonofaconstitutiveviralversusanendothelin-1-responsivecardiacpromoter.Circulation.2000May9;101(18)2193-9.)。這些方法雖然可使特定靶基因得到某種程度的抑制,但抑制程度效果大多仍無法達(dá)到臨床治療的要求。隨著RNAi研究的深入,應(yīng)用各種方式使dsRNA在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的方法接連涌現(xiàn),在此基礎(chǔ)上,在專利中請?zhí)枮?2125762.0的發(fā)明專利申請中,我們提出了應(yīng)用AAV為載體,導(dǎo)入可產(chǎn)生誘導(dǎo)RNAi途徑,使特定疾病相關(guān)基因得以高度、特異性抑制的基因治療方案。另外,需要說明的是,國外文獻(xiàn)中對轉(zhuǎn)錄出某一特定RNAi核苷酸片段的過程稱之為表達(dá)。我們認(rèn)為,表達(dá)是說明由DNA轉(zhuǎn)錄成RNA然后翻譯成蛋白質(zhì)的完整過程,而由DNA轉(zhuǎn)錄成RNA的這一特定的過程應(yīng)該稱之為轉(zhuǎn)錄,因而,在本發(fā)明的描述中,涉及相關(guān)概念之處我們一般描述為轉(zhuǎn)錄,而完成轉(zhuǎn)錄作用的功能單位我們稱之為轉(zhuǎn)錄單元。但也有按國外同行慣例沿用“表達(dá)”字眼的。腺病毒伴隨病毒(adeno-associatedvirus,AAV)是一種非致病性的微小病毒,基因組為4680nt的單鏈DNA。AAV病毒的生活周期有潛伏性感染和裂解性感染兩種方式。AAV病毒的裂解性復(fù)制需要有輔助病毒如腺病毒或單純皰疹病毒(herpessimplexvirus,HSV)的參與。在沒有輔助病毒存在時(shí),AAV病毒以前病毒方式整合在宿主細(xì)胞染色體中。由AAV病毒改造而來的重組AAV病毒載體因其安全、穩(wěn)定、既可感染分裂細(xì)胞又可感染不分裂細(xì)胞、感染效率高、可長期表達(dá)外源基因等優(yōu)點(diǎn)而受到關(guān)注,是一種具有廣泛用途的新型基因轉(zhuǎn)移及基因治療載體。在本發(fā)明中,我們使用了我們先前發(fā)明的重組AAV病毒載體的包裝和生產(chǎn)的策略(吳小兵等,申請?zhí)?9119039.4,發(fā)明名稱可用于大規(guī)模生產(chǎn)的重組腺病毒伴隨病毒生產(chǎn)方法及用途;伍志堅(jiān),吳小兵,曹暉等.一種高效的重組腺伴隨病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)。中國科學(xué)C輯,2001,31(5)423-430),將各種具有特定目的的RNAi核苷酸片段進(jìn)行包裝,成為各種攜帶了RNAi核苷酸片段的重組腺相關(guān)病毒。并通過重組腺相關(guān)病毒這種載體進(jìn)行RNAi核苷酸片段的基因轉(zhuǎn)移和基因復(fù)制,以達(dá)到相應(yīng)的研究和治療目的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明利用了我們先前申請的發(fā)明的技術(shù)平臺(tái)(專利申請?zhí)?9119038.6,發(fā)明名稱系列通用型腺病毒伴隨病毒載體的構(gòu)建及用途;專利申請?zhí)?9119039.4,發(fā)明名稱可用于大規(guī)模生產(chǎn)的重組腺病毒伴隨病毒生產(chǎn)方法及用途),通過提供一系列可產(chǎn)生誘導(dǎo)RNAi途徑,使特定疾病相關(guān)基因得以高度、特異性抑制的AAV載體構(gòu)建方法,生產(chǎn)出可供基因治療研究和臨床應(yīng)用的重組AAV病毒。本發(fā)明的RNAi技術(shù)涉及具有18-29堿基莖的shRNA,含有較長100-700堿基莖和包含或不包含其它相關(guān)基因序列的環(huán)狀結(jié)構(gòu)lhRNA以及不具有發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)的dsRNA。本發(fā)明涉及(1)確定特定靶基因的用于誘導(dǎo)RNAi的目的序列,構(gòu)建在U6snRNA或H1RNA啟動(dòng)子控制下的可形成shRNA產(chǎn)物的AAV載體;(2)構(gòu)建在U6snRNA或H1RNA啟動(dòng)子分別控制下的特定靶基因的正義和反義DNA序列的AAV載體;(3)構(gòu)建在多個(gè)U6snRNA或H1RNA啟動(dòng)子分別控制下的特定靶基因的多個(gè)目的序列的可形成shRNA產(chǎn)物的AAV載體;(4)構(gòu)建在多個(gè)U6snRNA或H1RNA啟動(dòng)子分別控制下的多個(gè)特定靶基因的單個(gè)或多個(gè)目的序列的可形成shRNA產(chǎn)物的AAV載體;(5)構(gòu)建含特異調(diào)控序列(如單個(gè)和多個(gè)缺氧反應(yīng)元件、血糖反應(yīng)元件等)和/或組織特異性或強(qiáng)效啟動(dòng)子控制下的可形成具lhRNA產(chǎn)物的AAV載體。在本發(fā)明的各種攜帶有l(wèi)hRNA結(jié)構(gòu)的重組AAV病毒的構(gòu)建過程中,首先需要確定并獲得特定靶基因的用于誘導(dǎo)RNAi的目的序列,然后構(gòu)建在U6snRNA或H1RNA啟動(dòng)子控制下的shRNA結(jié)構(gòu)AAV載體質(zhì)粒,構(gòu)建含特異調(diào)控序列和/或組織特異性或強(qiáng)效啟動(dòng)子控制下的可形成lhRNA結(jié)構(gòu)的AAV載體質(zhì)粒,之后制備相應(yīng)的重組AAV病毒,最后我們對常見的心血管疾病、腫瘤及自身免疫性疾病的數(shù)個(gè)靶基因進(jìn)行了抑制實(shí)驗(yàn)。針對特定靶基因的用于誘導(dǎo)RNAi的目的序列的確定的方法和步驟1.獲得特定靶基因mRNA序列;2.如利用U6snRNA或H1RNA啟動(dòng)子,在其起始密碼子下游50-100bp以下位置開始尋找,以避開DNA結(jié)合蛋白位點(diǎn),一般選取起始密碼子后100-300(經(jīng)驗(yàn)值);2.1方法A目的序列應(yīng)以G為開始(PCR引入法shRNAi轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物先反義),向后記錄18-29個(gè)堿基,推薦19-23bp;方法B目的序列應(yīng)以C(PCR引入法shRNAi轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物先正義)為開始,2.2尋到或?qū)嶒?yàn)獲得的最佳目的序列片段5’端如無G或C,應(yīng)添加G或C,一般而言添加1-5個(gè)堿基對RNAi抑制作用無明顯影響,除轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)應(yīng)為G外,5’端1-3個(gè)A可能有利于shRNA穩(wěn)定;2.3要求序列內(nèi)無連續(xù)3個(gè)及以上T,如采用發(fā)夾樣結(jié)構(gòu),還要求序列內(nèi)無連續(xù)3個(gè)及以上A;2.4要求序列GC含量在20%-70%,推薦30%-65%;并可將引物中與正義鏈互補(bǔ)的A換為G或反之,注意與反義鏈互補(bǔ)部分不要變,改變后可在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成UG配對,可能不影響RNAi活性,仍要求正義序列內(nèi)無連續(xù)3個(gè)及以上T;2.5如采用發(fā)夾樣結(jié)構(gòu),應(yīng)進(jìn)行序列2級結(jié)構(gòu)分析;3.如利用lsRNA結(jié)構(gòu),50-700堿基莖序列應(yīng)大部分在編碼區(qū),推薦200-600bp;3.1建議序列GC含量適中,環(huán)內(nèi)若包含其它基因,應(yīng)選擇其編碼區(qū)小于莖長度1/2的基因;3.2本方法另一種選擇,尋找兩個(gè)序列,其中一個(gè)序列包含有另一個(gè)序列,長片段多出部分主要集中在一端,用以形成環(huán)狀結(jié)構(gòu);3.3注意不要使編碼區(qū)得以正確轉(zhuǎn)錄;4.將尋到的序列到NCBI進(jìn)行BLAST查詢,確保該序列僅有一個(gè)靶序列,否則重復(fù)步驟2或3;5.對于要求抑制效率很高的序列選擇,可采用以下兩種方法5.1將選擇的多個(gè)序列人工合成方法或體外dsRNA合成試劑盒(如DharmaconsiACE-RNAi)合成dsRNA;5.2在相對的兩個(gè)U6snRNA啟動(dòng)子或其它TFIII的基因外啟動(dòng)子之間插入雙鏈選擇的多個(gè)序列,構(gòu)建小規(guī)模質(zhì)粒文庫,進(jìn)行轉(zhuǎn)染,在蛋白和或RNA水平檢測,觀察抑制效率,或通過抗體親和、免疫磁珠、流式細(xì)胞儀等方法的篩選,以選擇最佳。構(gòu)建在U6snRNA或H1RNA啟動(dòng)子控制下的shRNA結(jié)構(gòu)AAV載體質(zhì)粒的方法方法1PCR引入法1.1上游引物在U6snRNA啟動(dòng)子或其它三類TFIII的基因外啟動(dòng)子的近端調(diào)控元件5’外側(cè),一般而言PCR擴(kuò)增產(chǎn)物包含TATA盒及近端調(diào)控元件即可使引入的shRNA結(jié)構(gòu)得到有效轉(zhuǎn)錄,在此范圍內(nèi)還可加入特定調(diào)控序列,如缺氧反應(yīng)元件、四環(huán)素可誘導(dǎo)元件等。我們實(shí)驗(yàn)的上游引物位于U6啟動(dòng)子的-329--312(GGTGTTTCGTCCTTTCCACAA),為便于操作,5’加入Xho1位點(diǎn)。1.2下游引物為兩部分,首先確定外側(cè)發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)序列,莖應(yīng)用前面方法B或A確定的片段,環(huán)結(jié)構(gòu)為5-9bp堿基,一般9bp效果最理想。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)和文獻(xiàn),轉(zhuǎn)錄后的5’為正義片段,3’為反義片段比相反設(shè)計(jì)所產(chǎn)生的抑制效果要高,在其外側(cè)加入終止序列TTTTT和所用的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(我們用BglII或BamHI)。內(nèi)側(cè)部分為U6啟動(dòng)子的3’端,我們應(yīng)用-1--20部分(CCCCAGTGGAAAGACGCG)。注意這是反義引物。1.3模板我們應(yīng)用我們提取構(gòu)建的pTeasy-U6質(zhì)粒,該質(zhì)粒包括U6基因的-417-300片段。條件循環(huán)30個(gè)94℃45”、56℃45”、72℃45”,產(chǎn)物可經(jīng)酶切后連接于穿梭質(zhì)粒,或經(jīng)T載體后再構(gòu)建。方法2大銜接頭法2.1確定發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)序列,莖應(yīng)用前面方法A確定的片段,環(huán)結(jié)構(gòu)為5-9bp堿基,一般9bp效果最理想。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)和文獻(xiàn),轉(zhuǎn)錄后的5’為正義片段,3’為反義片段比反過來抑制效果要高。在其外側(cè)加入終止序列TTTTT和所用的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(我們用BglII或BamHI)酶切后的末端構(gòu)造。內(nèi)側(cè)添加堿基以保證發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)序列在U6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄后位點(diǎn)。人工合成一平一粘的大銜接頭,可用合成雙鏈,退火后應(yīng)用,注意平端5’應(yīng)磷酸化。2.2上游引物同上(參見“方法1PCR引入法,1.1”)下游引物為GAAGTGTTTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACA,引入了Xmn1位點(diǎn),(應(yīng)用該下游引物,需在發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)序列5’端加入兩個(gè)堿基AC,以保證發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)的正確轉(zhuǎn)錄)。2.3將大銜接頭、U6啟動(dòng)子片段及穿梭質(zhì)粒載體行3片段連接構(gòu)建目的質(zhì)粒。構(gòu)建在多個(gè)TFIII的基因外啟動(dòng)子分別控制下多個(gè)發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的AAV載體質(zhì)粒方法即將上述方法加以改進(jìn),將各單元串連即可,但要保證方向一致。構(gòu)建含特異調(diào)控序列和/或組織特異性或強(qiáng)效啟動(dòng)子控制下的可形成lhRNA結(jié)構(gòu)的AAV載體質(zhì)粒將酶切或PCR法得到莖及環(huán)片段連接在AAV載體質(zhì)粒pSNAV的目的啟動(dòng)子下游并連有PolyA序列。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)和文獻(xiàn),該方法產(chǎn)物抑制效率極高,但可能引起干擾素反應(yīng),激活PKR和RNaseL,非特異降解其它mRNA,并可能引發(fā)凋亡。對此我們采用環(huán)中引入腺病毒VAIRNA以求克服此付作用。通用型AAV載體質(zhì)粒pSNAV為本室構(gòu)建(中國專利申請?zhí)?9119038.6)。可形成lhRNA結(jié)構(gòu)的重組AAV病毒載體細(xì)胞株的建立及相應(yīng)的重組AAV病毒的制備用攜帶了lhRNA結(jié)構(gòu)的pSNAV重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞經(jīng)選擇培養(yǎng)得到相應(yīng)的AAV病毒載體細(xì)胞株BHK/pSNAV/lhRNABHK細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)。將攜帶了lhRNA結(jié)構(gòu)的pSNAV重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體lipofectamine(GIBCOBRL)轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞,24hr后消化,1∶2~5傳代。加G418800μg/ml選擇培養(yǎng)。10天后可形成明顯抗性細(xì)胞克隆。在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆,見細(xì)胞狀況良好,將其消化后混合并擴(kuò)大培養(yǎng)并分別凍存保種。用全功能輔助病毒HSV1-rc感染擴(kuò)大培養(yǎng)的細(xì)胞,經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了重組AAV-lhRNA病毒。測定重組AAV-lhRNA病毒的滴度。重組AAV病毒的生產(chǎn)、制備方法(吳小兵,董小巖,伍志堅(jiān)等.一種快速高效分離和純化重組腺病毒伴隨病毒載體的方法。科學(xué)通報(bào),2000,45(19)2071-2075。伍志堅(jiān),吳小兵,曹暉等.一種高效的重組腺伴隨病毒載體生產(chǎn)系統(tǒng)。中國科學(xué)C輯,2001,31(5)423-430)參見我們先前所申請的專利技術(shù)(專利申請?zhí)?9119039.4,發(fā)明名稱可用于大規(guī)模生產(chǎn)的重組腺病毒伴隨病毒生產(chǎn)方法及用途;專利申請?zhí)?9119038.6,發(fā)明名稱系列通用型腺病毒伴隨病毒載體的構(gòu)建及用途)。具體實(shí)施例方式我們對常見的心血管疾病、腫瘤及自身免疫性疾病(Folkman,JAngiogenesisincancer,vascular,rheumatoidandotherdisease.NatureMed.1995,127-31)的數(shù)個(gè)靶基因進(jìn)行了抑制,下面提供出部分實(shí)施實(shí)例并對其中部分方法和用途作了詳細(xì)說明,但并不意味著本發(fā)明范圍僅限于下面所列舉的序列、靶基因和疾病,也并不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例1用于治療心血管疾病的可誘導(dǎo)RNAi途徑的重組腺相關(guān)病毒通過對心血管疾病相關(guān)的研究進(jìn)展的分析,我們進(jìn)行了下面的設(shè)計(jì)。所參考的相關(guān)的文獻(xiàn)如下(BaartscheerA.AdenovirusgenetransferofSERCAinheartfailure.Apromisingtherapeuticapproach?CardiovascRes.2001Feb1;49(2)249-52.delMonteF,HardingSE,DecGW,etalTargetingphospholambanbygenetransferinhumanheartfailure.Circulation.2002Feb26;105(8)904-7.GelbandCH,ReavesPY,EvansJ,etal.AngiotensinIItype1receptorantisensegenetherapypreventsalteredrenalvascularcalciumhomeostasisinhypertension.Hypertension.1999Jan;33(1Pt2)360-5。Martens,J.R.;Reaves,P.Y.;etalPreventionofrenovascularandcardiacpathophysiologicalchangesinhypertensionbyangiotensinIItype1receptorantisensegenetherapy.Proc.Nat.Acad.Sci.1998,952664-2669.MiyamotoMI,MonteF,SchmidtU,etal.AdenoviralgenetransferofSERCA2aimprovesleft-ventricularfunctioninaortic-bandedratsintransitiontoheartfailure.ProNatAcadSci2000;97793-8。PachoriAS,NumanMT,F(xiàn)errarioCM,etal.Bloodpressure-independentattenuationofcardiachypertrophybyAT(1)R-ASgenetherapy.Hypertension.2002May;39(5)969-75.Paradis,P.;Dali-Youcef,N.;Paradis,F(xiàn).W.;etalOverexpressionofangiotensinIItypeIreceptorincardiomyocytesinducescardiachypertrophyandremodeling.Proc.Nat.Acad.Sci.2000,97931-936。PeriasamyM,HukeS.SERCApumplevelisacriticaldeterminantofCa(2+)homeostasisandcardiaccontractility.JMolCellCardiol.2001;Jun;33(6)1053-63.SchmidtU,MonteF,MiyamotoMI,etal.RestorationofdiastolicfunctioninsenescentratheartsthroughadenoviralgenetransferofsarcoplasmicreticulumCa2+-ATPase.Circulation2000;101790-6)。1.1治療心力衰竭,針對的靶基因A是受磷蛋白基因(phospholamban)。針對受磷蛋白基因(PHOSPHOLAMBAN)的SHRNA1其編碼區(qū)為受磷蛋白基因的59-79,序列為GCCCCAGCAAGCGCGTCAGAA,在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-1。在此編碼區(qū)的基礎(chǔ)上采用大銜接頭法設(shè)計(jì)所獲的序列為5’-CGCCCCAGCAAGCGCGTCAGAACTATCGTACTTCTGACGCGCTTGCTGGGGCTTTTTAGATC-3’,在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-24。針對受磷蛋白基因(phospholamban)的ShRNA2其編碼區(qū)為受磷蛋白基因的73-93,序列為GTCAGAACCTCCAGAACCTCT,在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-2。loop環(huán)應(yīng)用GGACTCGAT。下游引物5’-AAAAAGTCAGAACCTCCAGAACCTCTGGACTCGATAGAGGTTCTGGAGGTTCTGACGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3’,在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-25。以下各shRNAi方法中l(wèi)oop環(huán)均采用TCAAGCTTC(內(nèi)含HindIII位點(diǎn))。針對受磷蛋白基因(phospholamban)的ShRNA3其編碼區(qū)為受磷蛋白基因的59-78,序列為GCCCCAGCAAGCGCGTCAGA,在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-3。下游引物5’-AAAAAGACATATCAAGATGAGACAGATCAAGCTTCTCTGTCTCATCTTGATATGTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3’,在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-26。針對受磷蛋白基因(phospholamban)的LhRNA用Shortsenceprimer和Antisenceprimer兩條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到的針對受磷蛋白基因(phospholamban)的lhRNA短片段的長度為535bp。用Longsenceprimer和Antisenceprimer兩條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到的針對受磷蛋白基因(phospholamban)的lhRNA長片段的長度為652bp。用Shortsenceprimer和Antisenceprimer兩條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到的針對受磷蛋白基因(phospholamban)的lhRNA,將長、短片段首、首相接,兩尾斷形成新lhRNA的首尾,用設(shè)計(jì)的內(nèi)切酶位點(diǎn)連于載體。ShortsenceprimerAAGTCCAATACCTTACTCGC(編碼區(qū)7-26)短片段,在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-4。AntisenceprimerAAAAGTGGTGGCAACGCAG,在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-5。LongsenceprimerTAAAAGGAGACAGCTCGCG長片段,在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-6。1.2治療高血壓,靶基因B血管緊張素2受體1型(angiotensinreceptor1,ATR1)shRNA4GCTGAAGACTGTGGCCAGTGT(編碼區(qū)174-194),在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-7。下游引物5’-GGATCCAAAAACTGAAGACTGTGGCCAGTGTTCAAGCTTCACACTGGCCACAGTCTTCAGGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3’,在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-27。實(shí)施例2用于治療腫瘤的可誘導(dǎo)RNAi途徑的重組腺相關(guān)病毒通過對腫瘤疾病相關(guān)的研究進(jìn)展7,9,11,13,14,15,27,29,32,34的分析,我們進(jìn)行了下面的設(shè)計(jì)。2.1靶基因C血管內(nèi)皮生長因子165(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)shRNA5GTCTATCAGCGCAGCTACTGC(編碼區(qū)136-156),在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-7。下游引物5’-GGATCCAAAAAGTCTATCAGCGCAGCTACTGCTCAAGCTTCGCAGTAGCTGCGCTGATAGACGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3’,在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-28。shRNA6GTGGACATCTTCCAGGAGTAC(編碼區(qū)175-195),在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-8。下游引物5’-GGATCCAAAAAGTGGACATCTTCCAGGAGTACTCAAGCTTCGTACTCCTGGAAGATGTCCACGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3’,在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-29。shRNA7GCTACTGCCATCCAATCGAGACC(編碼區(qū)149-171),在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-9。下游引物5’-GGATCCAAAAAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCTCAAGCTTCGGTCTCGATTGGATGGCAGTAGCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3’,在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-30。lhRNAShortsenceprimerGAGGAGGGCAGAATCATCACGA(編碼區(qū)95-116),在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-10。AntisenceprimerGCCTTGCAACGCGAGTCTGT(編碼區(qū)502-521),在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-11。LongsenceprimerCAATGACGAGGGCCTGGAGTG(編碼區(qū)261-281),在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-12。長片段426bp短片段260bp。2.2靶基因D細(xì)胞周期蛋白D1(cyclinD1)shRNA8GAAGATCGTCGCCACCTGGAT(編碼區(qū)171-191),在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-13。下游引物5’-GGATCCAAAAAGAAGATCGTCGCCACCTGGATTCAAGCTTCATCCAGGTGGCGACGATCTTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3’,在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-31。shRNA9GAGGTCTGCGAGGAACAGAAG(編碼區(qū)196-216),在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-14。下游引物5’-GGATCCAAAAAGAGGTCTGCGAGGAACAGAAGTCAAGCTTCCTTCTGTTCCTCGCAGACCTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3’,在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-32。shRNA10GAACAGAAGTGCGAGGAGGAG(編碼區(qū)208-228),在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-15。下游引物5’-GGATCCAAAAAGAACAGAAGTGCGAGGAGGAGTCAAGCTTCCTCCTCCTCGCACTTCTGTTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3’,在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-33。lhRNAShortsenceprimerCGCGCCCTCGGTGTCCTACTTCA(編碼區(qū)141-136)510bp,在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-16。AntisenceprimerACGCTCCCCGCTGCCACCAT(編碼區(qū)604-623),在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-17。LongsenceprimerGCTGCGGGCCATGCTGAAGG(編碼區(qū)81-100)543bp,在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-18。長片段543bp短片段510bp。2.3靶基因E端粒酶RNA成分(TelomeraseRNA,TR)在載體構(gòu)建中我們采用了雙U6啟動(dòng)子分別控制下的雙shRNA的串連方式。shRNA11GCCTTCCACCGTTCATTCTAG(編碼區(qū)98-118),在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-19。下游引物5’-GGATCCAAAAAGCCTTCCACCGTTCATTCTAGTCAAGCTTCCTAGAATGAACGGTGGAAGGCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3’,在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-34。shRNA12GAAGAGTTGGGCTCTGTCAGC(編碼區(qū)255-275),在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-20。下游引物5’-GGATCCAAAAAGAAGAGTTGGGCTCTGTCAGCTCAAGCTTCGCTGACAGAGCCCAACTCTTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3’,在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-35。2.4靶基因F端粒酶逆轉(zhuǎn)錄組分(telomerasereversetranscriptase,TERT)在載體構(gòu)建中我們采用了雙U6啟動(dòng)子分別控制下的雙shRNA(shRNA11和shRNA13)的串連方式。shRNA13GTGTCCTGCCTGAAGGAGCTG(編碼區(qū)220-240),在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-21。下游引物5’-GGATCCAAAAAGTGTCCTGCCTGAAGGAGCTGTCAAGCTTCCAGCTCCTTCAGGCAGGACACGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3’,在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-36。實(shí)施例3用于治療自身免疫疾病的可誘導(dǎo)RNAi途徑的重組腺相關(guān)病毒治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,靶基因腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactorα,TNF-α)。shRNA14GTGGAGCTGAGAGATAACCAG(編碼區(qū)121-141),在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-22。下游引物5’-GGATCCAAAAAGTGGAGCTGAGAGATAACCAGTCAAGCTTCCTGGTTATCTCTCAGCTCCACGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-3’,在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-37。shRNA15GATAACCAGCTGGTGGTGCCA(編碼區(qū)133-153),在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-23。下游引物5’-GGATCCAAAAAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAAGCTTCTGGCACCACCAGCTGGTTATCGGTGTTTTCGTCCTTTCCACAA-3’,在電子版的核酸序列中的代碼為sequence-38。權(quán)利要求1.一類攜帶了特定的RNAi核苷酸片段的重組腺相關(guān)病毒由以下成分構(gòu)成1)重組腺相關(guān)病毒外殼;2)特定的RNAi核苷酸片段;3)對重組腺相關(guān)病毒外殼內(nèi)包裹攜帶的特定的RNAi核苷酸片段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、表達(dá)調(diào)控的調(diào)控單元。2.根據(jù)權(quán)利要求1,重組腺相關(guān)病毒外殼來源于2型腺相關(guān)病毒。3.根據(jù)權(quán)利要求1,重組腺相關(guān)病毒外殼來源于1型腺相關(guān)病毒。4.根據(jù)權(quán)利要求1,重組腺相關(guān)病毒所攜帶特定的RNAi核苷酸片段是針對心血管疾病的;5.根據(jù)權(quán)利要求1,重組腺相關(guān)病毒所攜帶特定的RNAi核苷酸片段是針對腫瘤的;6.根據(jù)權(quán)利要求4,針對心血管疾病的特定的ShRNAi核苷酸片段的核苷酸序列特征是5’-GCCCCAGCAAGCGCGTCAGAA-3’。7.根據(jù)權(quán)利要求5,針對腫瘤疾病的特定的RNAi核苷酸片段的核苷酸序列特征是5’-GTCTATCAGCGCAGCTACTGC-3’。8.根據(jù)權(quán)利要求1,對特定的RNAi核苷酸片段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、表達(dá)調(diào)控的調(diào)控單元的結(jié)構(gòu)是在U6snRNA或H1RNA啟動(dòng)子控制下的可形成shRNA產(chǎn)物的AAV載體。9.根據(jù)權(quán)利要求1,攜帶了特定的RNAi核苷酸片段的重組腺相關(guān)病毒可以用于治療各種疾病。全文摘要本發(fā)明名稱為“可誘導(dǎo)RNAi途徑的用于基因治療的系列重組腺相關(guān)病毒”,屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域:
,具體涉及一系列通過RNAi途徑特異地抑制特定疾病相關(guān)基因的用于基因治療領(lǐng)域的腺病毒伴隨病毒載體的構(gòu)建策略、方法及用途。文檔編號C12N15/11GK1498964SQ02149319公開日2004年5月26日申請日期2002年11月7日優(yōu)先權(quán)日2002年11月7日發(fā)明者吳小兵,魯曉春,馬鑫,董小巖,侯云德申請人:本元正陽基因技術(shù)股份有限公司