專利名稱：用于檢測細菌的免疫捕捉法通用引物pcr方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測細菌的免疫捕捉法通用引物PCR方法。
(2)背景技術(shù)細菌感染性疾病長期危害人類健康，快速敏感檢出病原菌是防制疾病的重要步驟。近年來，PCR技術(shù)已被應(yīng)用于病原菌的檢測，這些檢測技術(shù)可分為2大類，分別為特異性引物PCR和非特異性引物PCR，前者依目的菌不同而往往需要不同的引物，而不同引物序列又可能需要不同的擴增條件，故當待檢菌不明時則需進行多次PCR才可能得到結(jié)果，因此，難以達到快速特異檢測的目的；后者一般根據(jù)細菌16S rRNA基因的保守性合成通用引物，所擴增的產(chǎn)物往往需要配合RFLP(限制性段片多態(tài)性分析)、SSCP(單鏈構(gòu)象性多態(tài)性分析)或序列分析才能進行確定，故操作步驟較為繁鎖。
(3)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的旨在提供一種利用抗體特異性識別待檢菌，再采用細菌16S rRNA基因通用引物進行PCR擴增，快速特異地檢測病原菌的方法。
本發(fā)明所說的免疫捕捉法通用引物PCR(iUPPCR)方法操作步驟如下1)抗體包被采用pH9.6，0.01mol/L碳酸緩沖液，將針對各種細菌的特異性抗體配制成抗體含量為1～10μg/mL的溶液，分別包被至固相載體上，每份50mL于4℃下過夜，然后用pH7.4，0.01mol/L磷酸鹽-吐溫緩沖液(PBS-T)洗板3次，每次3～5min；所說的固相載體為酶聯(lián)反應(yīng)板或塑料反應(yīng)小管；2)封閉每孔加入50μL10％小牛血清，36～38℃封閉1hr，甩干；3)免疫捕捉每孔加入細菌溶液20～40μL，于36～38℃溫育1hr，用PBS-T洗板5次，每次3～5min；4)熱變性釋放模板每孔加入20～40μL無菌雙蒸水，沸水浴加熱8～10min，吸取8～36μL裂解液作為PCR反應(yīng)模板；5)通用引物PCR(UPPCR)在PCR反應(yīng)管中依次加入10×PCR緩沖液2.5μL，25mmol/L的MgCl23μL，混合dNTPs(各10mmol/L)0.5μL，74μmol/L的引物0.085μL，5U/μL的Taq酶0.1μL，最后加入模板至總體積25～50μL，混合后，94℃變性1min，51℃復(fù)性1min，70℃延伸2.5min，共循環(huán)40次；所說的引物為通用引物，由Sangon公司合成，選自細菌16S rRNA基因保守區(qū)，引物序列如下正向引5’-AAACTCAAAGGAATTCGG-3’，逆向引物5’-GACGGGCGGTG TACAA-3’；6)PCR產(chǎn)物鑒定取PCR產(chǎn)物5μL，與適量加樣緩沖液混合，點樣于含0.5mg/μL的溴化乙啶(EB)的2.5％瓊脂糖凝膠中，80V電泳30min，觀察結(jié)果。
本發(fā)明將抗原抗體反應(yīng)的特異性與PCR強大的擴增效率相結(jié)合，建立了檢測病原菌的iUPPCR，其特異性是通過抗體對抗原的特異識別來達到，只有能被抗體識別的細菌才能被捕捉到，而被捕捉到的細菌均可經(jīng)通用引物按同一程序擴增，故可以達到快速檢出的目的，本免疫捕捉法PCR具有相當?shù)拿舾行?，比直接裂解法PCR敏感，PCR產(chǎn)物條帶更清晰。這可能是由于免疫捕捉的過程是利用了親和層析的原理，從而將不利于PCR擴增的雜質(zhì)除去，因此理論上1個細菌也可檢出，這對于臨床血液標本中的病原菌的檢測具有重要意義。PCR標本來源不同，處理方法各異，用傳統(tǒng)PCR檢測方法不僅費時費力，而且干擾PCR擴增的物質(zhì)也較多，容易出現(xiàn)假陰性，對于微量標本更是如此。采用本法可直接將標本加入反應(yīng)孔內(nèi)，通過親和法進行標本純化，從而不但提高了敏感性、同時也減少所需時間。具有快速、特異、敏感的特點，且重復(fù)性高。由于本發(fā)明使用的是細菌的通用引物，因此可推廣至其它病原菌的檢測，具有較好的臨床推廣價值。
(4)


圖1為實施例3中福氏志賀菌型間交叉實驗結(jié)果的PCR產(chǎn)物電泳圖。
圖2為實施例5中免疫捕捉法UPPCR和熱變性法UPPCR檢測糞便中志賀菌的比較實驗PCR產(chǎn)物電泳圖。
(5)具體實施方式
實施例1實驗菌種痢疾志賀菌(Shinglla dysenteriae)I型，宋氏志賀菌(Shigella sonnei)，福氏志賀菌(Shigella flexneri)1a、2a、2b、3a、4、5、Y變種，鮑氏志賀菌(Shigella boydii)1。其中痢疾志賀菌I型、宋氏志賀菌、福氏志賀菌4、鮑氏志賀菌16購自江西省衛(wèi)生防疫站，福氏志賀菌1a、2a、2b、3a、5、Y變種購自福建省衛(wèi)生防疫站。
通用引物由Sangon公司合成，選自細菌16S rRNA基因保守區(qū)，經(jīng)鑒定為電泳純。引物序列如下正向引物5’-AAACTCAAAGGAATTGACGG-3’逆向引向物5’-GACGGGCGGTGTGTACAA-3’。
診斷血清上述志賀菌屬各菌診斷血清為衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所產(chǎn)品，4步硫酸銨法提純抗體。PCR試劑Taq酶(MBI產(chǎn)品)，dNTPs(Sangon產(chǎn)品)。
限制性內(nèi)切酶Hae III(Ferments產(chǎn)品)。
分子量標準pGEM-7Zf(+)/Hae III Markers(Sangon產(chǎn)品)。
肉湯培養(yǎng)基0.5％牛肉膏，1％蛋白胨，0.5％氯化鈉，pH7.2-7.4，121℃滅菌20min，37℃搖床培養(yǎng)18～24h。
細菌計數(shù)顯微鏡直接計數(shù)和平板計數(shù)。
iUPPCR操作步驟1)首先抗體包被用pH9.6，0.01mol/L碳酸緩沖液將上述志賀菌屬各菌抗體稀釋為10μg/mL，分別加入酶聯(lián)反應(yīng)板各孔，每孔50μL，于4℃冰箱過夜，然后用pH7.4，0.01mol/LPBS-T洗板3次，每次3min。
2)封閉10％小牛血清37℃封閉1hr后甩干。
3)免疫捕捉每孔加入細菌溶液20μL，于37℃保溫1hr，用PBS-T洗板5次，每次3min。
4)熱變性釋放模板每孔加入20μL無菌雙蒸水，沸水浴加熱10min，吸取18μL裂解液作為PCR反應(yīng)模板。
5)UPPCR在PCR反應(yīng)管中依次加入10×PCR buffer 2.5μL，MgCl2(25mmol/L)3μL，混合dNTPs(各10mmol/L)0.5μL，引物(74μmol/L)各0.085uL，Taq酶(5U/μL)0.1μL，最后加入模板至總體積25μL。混合后，94℃變性1min，51℃復(fù)性1min，70℃延伸2.5min，共循環(huán)40次。
6)PCR產(chǎn)物鑒定取PCR產(chǎn)物5μL，與適量加樣緩沖液混合，點樣于2.5％的含0.5μg/mL EB的瓊脂糖凝膠中，80V電泳30min。取限制性內(nèi)切酶Hae III產(chǎn)品對PCR產(chǎn)物進行酶切鑒定，結(jié)果其酶切片段大小與理論值相符。
實施例2中和實驗同時設(shè)立中和組和對照組進行中和實驗。材料及iUPPCR操作步驟均同實施例1，將痢疾志賀菌I型、宋氏志賀菌、福氏志賀菌4、鮑氏志賀菌16菌液稀釋成20μL菌液中含50 CFU病原菌。中和組取20μL菌液與等體積50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL相應(yīng)抗體混合，于37℃溫育1hr后加于反應(yīng)板中；對照組則加入20μL菌液和20μL無菌水，其余步驟不變。中和結(jié)果見表1，三組中和組均無PCR擴增產(chǎn)物，而相應(yīng)對照組均有擴增產(chǎn)物。
表1iUPPCR檢測痢疾志賀菌I型、宋氏志賀菌、福氏志賀菌4、鮑氏志賀菌16的中和實驗結(jié)果中和組抗體濃度 對照組50μg/mL 100μg/mL200μg/mL痢疾志賀菌I型- -- +宋氏志賀菌 - -- +福氏志賀菌4 - -- +鮑氏志賀菌16 - -- +實施例3iUPPCR交叉實驗1)用種特異的單價診斷血清提純抗體進行交叉實驗材料同實施例1，以痢疾志賀氏菌I型、宋氏志賀菌、福氏志賀菌4和鮑氏志賀菌16的單價診斷血清所提抗體包被反應(yīng)板，每種抗體包被4孔，分別用于捕捉4種志賀氏菌，其余步驟同實施例1，PCR產(chǎn)物鑒定結(jié)果表明種間無交叉反應(yīng)出現(xiàn)(見表2)。
表2采用特異性單價抗體捕捉的iUPPCR檢測痢疾志賀菌I型、宋氏志賀菌、福氏志賀菌4和鮑氏志賀菌16的交叉實驗結(jié)果痢疾志賀菌I型宋氏志賀菌福氏志賀菌4鮑氏志賀菌16抗痢疾志賀氏I型 + - - -抗宋內(nèi)志賀氏 - + - -抗福氏志賀氏4 - - + -抗鮑氏志賀氏16-18 - - - +2)用型特異的單價診斷血清提純抗體進行交叉實驗以福氏志賀菌1型、2型、3型、4型、5型、6型單價診斷血清所提抗體包被反應(yīng)板，每一種抗體包被6孔，分別用于捕捉福氏志賀菌1a、2a、3a、4、5、Y變種，其余步驟不變，PCR產(chǎn)物鑒定結(jié)果表明，型間無交叉反應(yīng)出現(xiàn)(見表3)。圖1為福氏志賀菌型間交叉反應(yīng)實驗結(jié)果的PCR產(chǎn)物電泳圖，圖1中1福氏志賀菌1a與抗1型抗體反應(yīng)2福氏志賀菌2a與抗1型抗體反應(yīng)3福氏志賀菌2a與抗2型抗體反應(yīng)4福氏志賀菌3a與抗2型抗體反應(yīng)
5福氏志賀菌3a與抗3型抗體反應(yīng)6福氏志賀菌4與抗3型抗體反應(yīng)7福氏志賀菌4與抗4型抗體反應(yīng)8福氏志賀菌5與抗4型抗體反應(yīng)9福氏志賀菌5與抗5型抗體反應(yīng)10福氏志賀菌Y變種與抗5型抗體反應(yīng)11福氏志賀菌Y變種與抗6型抗體反應(yīng)MpGEM-7Zf(+)/HaeIII Makers表3采用型特異性單價抗體捕捉的iUPPCR檢測福氏志賀菌1a、2a、3a、4、5和Y變種的交叉實驗結(jié)果福氏志賀菌1a2a3a45Y變種抗1型抗體 + - --- -抗2型抗體 - + --- -抗3型抗體 - - +-- -抗4型抗體 - - -+- -抗5型抗體 - - --+ -抗6型抗體 - - --- -實施例4實驗菌種宋氏志賀菌(Shigella sonnei)購自江西省衛(wèi)生防疫站。
通用引物同實施例1。
診斷血清宋氏志賀菌診斷血清為衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所產(chǎn)品，4步硫酸銨法提純抗體。
PCR試劑同實施例1。
分子量標準同實施例1。
肉湯培養(yǎng)基同實施例1。
細菌計數(shù)同實施例1。
每孔加入稀釋定量后的細菌20μl進行捕捉，其濃度分別為每20μL菌液中含有菌體20、100、500、1000CFU。同時采用iUPPCRT和直接裂解法UPPCR進行擴增，iUPPCR操作方法同實施例1。直接裂解法UPPCR為取細菌培養(yǎng)液于3500rpm離心20min收集菌體，依實驗要求用雙蒸水稀釋細菌，沸水變性10min，12000rpm離心10min。取上清液作為模板，進行UPPCR擴增。結(jié)果兩法均為陽性。
將細菌濃度定為200、100和20個CFU/400μL，均分為20份。10份用于免疫捕捉，另10份用于熱變性，其余步驟不變，結(jié)果表明兩法有非常顯著的差異(P均＜0.01)。(見表4)表4比較免疫捕捉法UPPCR和熱變性法UPPCR檢測10、5和ICFU細菌的敏感性10 CFU細菌 5 CFU細菌 1 CFU細菌管數(shù)陽性數(shù) 陽性率(％) 陽性數(shù) 陽性率(％) 陽性數(shù) 陽性率(％)免疫捕捉UPPCR10 10 100.0 10 100.04 40.0熱變性法UPPCR10 6 60.02 20.0 0 0空白對照 50 0 0 00 0P＜0.01實施例5糞便環(huán)境模擬實驗實驗菌種痢疾志賀菌(Shigella dysenteriae)I型購自江西省衛(wèi)生防疫站。
通用引物同實施例1。
診斷血清痢疾志賀菌診斷血清為衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所產(chǎn)品，4步硫酸銨法提純抗體。
PCR試劑同實施例1。
限制性內(nèi)切酶同實施例1。
分子量標準同實施例1。
肉湯培養(yǎng)基同實施例1。
細菌計數(shù)同實施例1。
糞便環(huán)境模擬標本用無菌生理鹽水將正常人糞便1g均勻懸浮，2500r/min離心10min，取上清稀釋痢疾志賀菌I型，稀釋后濃度為100 CFU/200μL，分別于10個反應(yīng)孔中進行捕捉，其余步驟不變。取糞便環(huán)境模擬標本，同時用iUPPCR和熱變性直接裂解法UPPCR檢測。iUPPCR方法同實施例1，熱變性法同實施例4，結(jié)果前法的10管中有8管為陽性，陽性率為80％，后法的10管中無擴增產(chǎn)物出現(xiàn)(見圖3)。兩者有非常顯著的差異(P＜0.01)。PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切鑒定，其片段與理論值相符。圖3中1pGEM-7Zf(+)/HaeIII Markers2免疫捕捉法UPPCR產(chǎn)物3熱變性法UPPCR產(chǎn)物實施例6
通用引物同實施例1。
診斷血清同實施例1。
PCR試劑同實施例1。
限制性內(nèi)切酶同實施例1。
分子量標準同實施例1。
肉湯培養(yǎng)基同實施例1。
細菌計數(shù)同實施例1。
iUPPCR操作步驟同實施例1。
沙門氏志賀氏瓊脂(SS Agar)上海市醫(yī)學化驗所試劑廠產(chǎn)品。
污水樣品采集從廈門大學附近醫(yī)院和居民區(qū)污水排放點取污水35份，每份5mL，置于無菌容器中室溫靜置2hr，分別取上清20μL用于捕捉和40μL用于細菌培養(yǎng)。
污水細菌培養(yǎng)稱取53克沙門氏志賀氏瓊脂，加入1000mL冷蒸餾水微火煮沸使完全溶解，冷至50℃左右傾入無菌平皿中凝固后備用。取40μL污水樣品涂布平皿，37℃培養(yǎng)24hr。
血清學鑒定挑取無色半透明菌落，按玻片凝集實驗進行血清學鑒定。
以志賀菌屬各菌型特異性抗體包被反應(yīng)板，檢測采自廈門大學附近的污水樣品35份，同時采用細菌培養(yǎng)結(jié)合血清型反應(yīng)的檢測方法比較。結(jié)果iUPPCR檢測的陽性率顯著高于細菌培養(yǎng)和血清學方法(見表5)。從表中可看出兩法有非常顯著的差異(P＜0.01)，同時隨機對5份陽性產(chǎn)物進行酶切鑒定，結(jié)果與理論片段長度一致。
表5采用iUPPCR和細菌培養(yǎng)結(jié)合血清學方法檢測35份污水樣品的陽性率比較免疫捕捉法UPPCR 細菌培養(yǎng)和血清學方法陽性數(shù) 陽性率(％) 陽性數(shù) 陽性率在(％)痢疾志賀菌I型 2 5.7 0 0.0痢疾志賀菌II型 0 0.0 0 0.0福氏志賀菌1型 0 0.0 0 0.0福氏志賀菌2型 15 42.95 14.3福氏志賀菌3型 3 8.6 0 0.0福氏志賀菌4型 0 0.0 0 0.0福氏志賀菌5型 0 0.0 0 0.0福氏志賀菌6型 0 0.0 0 0.0宋氏志賀菌 3 8.6 0 0.0鮑氏志賀菌1-6 00.0 00.0鮑氏志賀菌7-11 00.0 00.0鮑氏志賀菌12-1500.0 00.0鮑氏志賀菌16-1800.0 00.0合計 23 65.8 514.3*P＜0.0
權(quán)利要求
1.用于檢測細菌的免疫捕捉法通用引物PCR方法，其特征在于操作步驟如下1)抗體包被采用pH9.6，0.01mol/L碳酸緩沖液，將針對各種細菌的特異性抗體配制成抗體含量為1～10μg/mL的溶液，將溶液分別包被至固相載體上，每份50μL，于4℃下過夜，然后用pH7.4，0.01mol/L磷酸鹽-吐溫緩沖液(PBS-T)洗板3次，每次3～5min；2)封閉每份加入50μL10％小牛血清，36～38℃封閉1hr，甩干；3)免疫捕捉每份加入細菌溶液20～40μL，于36～38℃溫育1hr，用PBS-T洗液洗板5次，每次3～5min；4)熱變性釋放模板每份加入20～40μL無菌雙蒸水，沸水浴加熱8～10min，吸取18～36μL裂解液作為PCR反應(yīng)模板；5)通用引物PCR(UPPCR)在PCR反應(yīng)管中依次加入10×PCR緩沖液2.5μL，25mmol/L的MgCl23μL，混合dNTPs(各10mmol/L)0.5μL，74μmol/L的引物0.085μL，5U/μL的Tag酶0.1μL，最后加入模板至總體積25～50μL，混合后，94℃變性1min，51℃復(fù)性1min，70℃延伸2.5min，共循環(huán)40次；所說的引物為通用引物，選自細菌16S rRNA基因保守區(qū)，引物序列如下正向引物5’-AAACTCAAAGGAATTGACGG-3，逆向引物5’-GACGGGCGGTGTGTACAA-3’；6)PCR產(chǎn)物鑒定取PCR產(chǎn)物5μL，與適量加樣緩沖液混合，點樣于0.5μg/mL溴化乙啶(EB)的2.5％瓊脂糖凝膠中，80V電泳30min，觀察結(jié)果。
2.如權(quán)利要求1所述的用于檢測細菌的免疫捕捉法通用引物PCR方法，其特征在于步驟4熱變性釋放模板中無菌雙蒸水每份所加體積與步驟3免疫捕捉中每份所加細菌溶液體積一致。
3.如權(quán)利要求1所述的用于檢測細菌的免疫捕捉法通用引物PCR方法，其特征在于所說的固相載體為酶聯(lián)反應(yīng)板或塑料反應(yīng)小管。
4.如權(quán)利要求3所述的用于檢測細菌的免疫捕捉法通用引物PCR方法，其特征在于所說的固相載體為酶聯(lián)反應(yīng)板。
全文摘要
涉及一種檢測細菌的免疫捕捉法通用引物PCR方法,采用針對各種細菌的特異性抗體進行包被,經(jīng)封閉后加入細菌溶液于36～38℃下免疫捕捉,然后熱變性釋放模板,吸取裂解液作為PCR反應(yīng)模板,最后利用細菌16S rRNA基因通用引物進行PCR,本發(fā)明將抗原抗體反應(yīng)的特異性與PCR強大的擴增效率相結(jié)合,建立了檢測病原菌的iUPPCR,其特異性是通過抗體對抗原的特異識別來達到,只有能被抗體識別的細菌才能被捕捉到,而被捕捉到的細菌均可經(jīng)通用引物按同一程序擴增,故可以達到快速檢出的目的,重復(fù)性好,特異性強、敏感性高,其原理可用于幾乎所有病原菌的檢測,具有較好的應(yīng)用推廣價值。
文檔編號C12Q1/68GK1366183SQ0210198
公開日2002年8月28日 申請日期2002年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月22日
發(fā)明者彭宣憲, 王三英, 張建營 申請人:廈門大學