專利名稱：生產(chǎn)純化的補(bǔ)血鐵-糖復(fù)合物的方法及產(chǎn)品的生產(chǎn)的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及包括可腸胃外給藥補(bǔ)血藥物的具有治療活性的含鐵物質(zhì)。對(duì)于本發(fā)明的目的而言，“補(bǔ)血”指化合物或組合物中含有一種形式的鐵，該鐵能夠增加哺乳動(dòng)物，具體是人的血液中血色素含量。雖然這種化合物在特性上廣泛地認(rèn)為是包括葡聚糖的鐵-碳水化合物復(fù)合物，但本發(fā)明涉及稱作鐵-糖復(fù)合物(iron-saccharidic)的同屬亞類，并包括含有蔗糖的葡糖酸鐵鈉復(fù)合物(SFGCS)、氫氧化鐵-蔗糖復(fù)合物(FHSC)和/或其它在特性上為鐵糖的復(fù)合物。對(duì)于本發(fā)明的目的而言，這種活性含鐵種類一般指鐵-糖復(fù)合物或補(bǔ)血活性物質(zhì)(AHS)。在相關(guān)的領(lǐng)域的各類文獻(xiàn)中，術(shù)語(yǔ)“復(fù)合物”可能具有其它的含義。在一個(gè)方面，術(shù)語(yǔ)復(fù)合物可用于描述兩個(gè)或多個(gè)離子之間相結(jié)合形成相對(duì)低分子量的非-聚合性組合物，該組合物在給定的一組條件下單獨(dú)存在。這種類型的復(fù)合物稱作“初級(jí)復(fù)合物”。使用該術(shù)語(yǔ)的另一方式是描述多個(gè)初級(jí)復(fù)合物結(jié)合或附聚形成大的高分子，或“次級(jí)復(fù)合物”。對(duì)于本發(fā)明的目的而言，后者附聚物本文也稱作高分子。對(duì)于本發(fā)明的目的而言，這種高分子或次級(jí)復(fù)合物被鑒定為“聚復(fù)合物”并簡(jiǎn)單地稱作復(fù)合物。具有上述特征的一個(gè)例子，葡糖酸亞鐵是一種含有二價(jià)鐵離子和葡糖酸陰離子的組合物。一個(gè)二價(jià)鐵離子和兩個(gè)葡糖酸陰離子形成較低分子量(約450道爾頓)的初級(jí)復(fù)合物，當(dāng)這類初級(jí)復(fù)合物溶解于水性培養(yǎng)基時(shí)不會(huì)聚集形成高分子。因此葡糖酸亞鐵是一種不屬于本發(fā)明術(shù)語(yǔ)“復(fù)合物”范疇的組合物。然而葡糖酸鐵卻屬于本文所用術(shù)語(yǔ)的組合物，因?yàn)槿齼r(jià)鐵離子和葡糖酸陰離子的初級(jí)復(fù)合物附聚形成大的高分子(可具有大約100,000到600,000道爾頓或更高的分子量)。下面描述了商業(yè)購(gòu)得具有治療活性鐵離子化合物的一些實(shí)施例。對(duì)于本發(fā)明的目的而言，術(shù)語(yǔ)“賦形劑”指不具有補(bǔ)血活性的成分，包括合成反應(yīng)副產(chǎn)物和未反應(yīng)的起始物質(zhì)、降解副產(chǎn)物、稀釋劑等，存在于鐵-糖復(fù)合物等具有治療活性的含鐵物質(zhì)的混合物中。
缺鐵性貧血癥是一種血液疾病，可服用含鐵的各種治療制劑進(jìn)行治療。這些制劑包括如硫酸亞鐵、葡糖酸亞鐵、延胡索酸亞鐵、乳清酸亞鐵和其它的簡(jiǎn)單鐵鹽。如果口服給予這些物質(zhì)不能改善鐵的缺乏，更高水平的治療包括鐵的腸胃外給藥。取決于患者的臨床狀況，腸胃外給予聚葡聚糖或葡聚糖結(jié)合的鐵可作為有效的治療性鐵輸送載體?？刹捎眉∪鈨?nèi)注射或靜脈內(nèi)途徑給予這些鐵葡聚糖；這種產(chǎn)品的商品化樣品包括那些具有“Imferon”和“INFeD”商品名的產(chǎn)品。需要腸胃外給予鐵的各種臨床疾病顯示了鐵葡聚糖的實(shí)用補(bǔ)血價(jià)值。鐵葡聚糖的應(yīng)用經(jīng)受了其合成、生產(chǎn)過(guò)程中和過(guò)敏患者反應(yīng)的特異性考查。這些作用可能顯示為嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)，過(guò)敏癥狀或輕微的瞬時(shí)癢感癥狀。這種過(guò)敏性作用或其它不良作用是否是由于患者個(gè)體對(duì)于活性成分或?qū)τ谀c胃外給藥溶液中的副產(chǎn)物、雜質(zhì)或降解產(chǎn)物具有敏感性尚沒(méi)確定。
作為鐵葡聚糖的替代物，本文把鐵-糖復(fù)合物看作是非葡聚糖補(bǔ)血?jiǎng)?。鐵葡聚糖包含聚合的單糖殘基，而本發(fā)明的鐵-糖復(fù)合物特征是基本上沒(méi)有這種聚合單糖。鐵-糖復(fù)合物可從市售獲得，例如，商品名為Ferrlecit，它被鑒定為含有蔗糖的葡糖酸鐵鈉復(fù)合物(SFGCS)。生產(chǎn)商聲明該產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)式為[NaFe2O3(C6H11O7)(C12H22O11)5]n，其中n約為200，并具有350,000±23,000道爾頓的表觀分子量。然而，注意到根據(jù)剛才引用的公開(kāi)結(jié)構(gòu)式，該結(jié)構(gòu)式的分子量應(yīng)明顯較高，為417,600(雖然，如公開(kāi)的那樣，該結(jié)構(gòu)式難以精確解釋)。另外，市售的補(bǔ)血性組合物是包含20％蔗糖的水溶液，wt./vol.(195mg.mL)?；瘜W(xué)名稱表明藥理學(xué)上給予的這種形式的治療性鐵(Fe)，是氧化鐵形式Fe(III)，而不是還原的亞鐵形式Fe(II)。由于Fe(III)氧化狀態(tài)的改變，有人提出葡糖酸(五羥己酸，C6H12O7)以配位復(fù)合物或配體形式也存在于蔗糖溶液中。對(duì)于本發(fā)明的目的而言，應(yīng)理解葡糖酸化學(xué)物質(zhì)不論是否與Fe(III)組成配體復(fù)合物，都不能排除其能與其它存在的糖類如蔗糖發(fā)生相互作用。因此，使用術(shù)語(yǔ)鐵-糖復(fù)合物時(shí)應(yīng)理解為表示存在一種非特異性和不精確的結(jié)構(gòu)，在這一結(jié)構(gòu)中離子化的葡糖酸和蔗糖分子通過(guò)各種結(jié)合性相互反應(yīng)微弱地結(jié)合，產(chǎn)生了可摻入Fe(III)的一種分子構(gòu)架。本文描述的本發(fā)明另一種非葡聚糖補(bǔ)血性組合物為氫氧化鐵-蔗糖復(fù)合物(FHSC)?？墒袌?chǎng)上購(gòu)得商品名為“Venofer”的該腸胃外給藥補(bǔ)血?jiǎng)?。?duì)于SFGCS，該描述名稱提示一種三價(jià)鐵形式Fe(III)存在于與蔗糖或某些蔗糖衍生物形成的立體復(fù)合物中。因此，本發(fā)明的非-葡聚糖、鐵-糖復(fù)合物包括SFGCS、FHSC及其混合物。對(duì)于本發(fā)明的目的而言，這些鐵輸送載體包括含鐵的結(jié)構(gòu)性復(fù)合物，命名為補(bǔ)血活性物質(zhì)(AHS)。
對(duì)于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)AHS可與鐵-糖復(fù)合物、糖鐵輸送載體和糖酸鐵相互交換使用。術(shù)語(yǔ)“糖酸鹽”或“糖類的”用于一般描述鐵原子與另一種分子或其具有鑒定結(jié)構(gòu)為-CH(OH)-C(O)-的蔗糖基團(tuán)的聚合物的相互作用。蔗糖基團(tuán)最簡(jiǎn)單出現(xiàn)在某分子的標(biāo)準(zhǔn)Fischer分子投影模型中的兩個(gè)末端位置，分別為(-CH(OH)-CHO)或(-CHO-CH2OH)的醛基或酮基。
該術(shù)語(yǔ)形式的描述也見(jiàn)于Zapsalis，C.和R.A.Beck，1985，“食品化學(xué)和營(yíng)養(yǎng)生化”(“Food Chemistry and Nutritional Biochemistry”)，第6章，John Wiley和Sons，第315-321頁(yè)(在允許的范圍內(nèi)本文引用作為參考)。分子中產(chǎn)生這種基團(tuán)及其最初的氧化或還原產(chǎn)物認(rèn)為是單糖，該單糖含有碳原子和與水有相同比例的氫和氧。例如，已知的醛糖如葡萄糖，以葡糖酸作為其最初的氧化產(chǎn)物，而葡萄糖醇也稱作山梨糖醇作為最初的還原產(chǎn)物。由葡萄糖模型為代表的起始單糖及其可能的反應(yīng)產(chǎn)物保留了氧化或還原形式的特征性糖基團(tuán)的證據(jù)。雖然存在這些結(jié)構(gòu)變化，但二者仍被看作是單糖和碳水化合物。在實(shí)際應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)中，蔗糖基團(tuán)的氧化型式顯示了一個(gè)羧基，該羧基在適宜的pH條件下按照其獨(dú)特的離子化常數(shù)和pKa值離子化。當(dāng)離子化時(shí)，氧化的糖基稱作“糖酸鹽”，或一般稱為糖酸，其在氧化的糖基保留了可離子化的質(zhì)子。如果糖基的離子化羧基與陽(yáng)離子如鈉結(jié)合，就形成了糖酸鹽。例如，葡萄糖氧化產(chǎn)生葡糖酸，該糖酸的鈉鹽是葡糖酸鈉。類似的，亞鐵陽(yáng)離子(FeII)與葡糖酸的羧基靜電性結(jié)合，形成葡糖酸亞鐵。單糖亦即醛糖通常經(jīng)過(guò)氧化產(chǎn)生其糖酸等價(jià)物或者，當(dāng)它們電離時(shí)，單糖形式可與所選化合價(jià)為+1到+3的陽(yáng)離子反應(yīng)。甘油醛是最簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)，它顯示出這種醛基，而二羥基丙酮作為相應(yīng)的酮基的例子。這種結(jié)構(gòu)實(shí)際上延伸了6個(gè)碳原子，解釋了兩種碳水化合物分類法的描述性基礎(chǔ)，一種形式是醛糖而另一種是酮糖。醛糖和酮糖分別由單糖如葡萄糖或果糖為代表。源自單糖的許多可能的分子內(nèi)和分子間的反應(yīng)產(chǎn)物，包括稱作葡糖酸的葡萄糖氧化產(chǎn)物，致力使鐵與糖形成復(fù)合物從而產(chǎn)生了AHS。對(duì)于本發(fā)明的目的而言，認(rèn)為AHS是一種化學(xué)上比同屬主要化合物含有蔗糖的葡糖酸鐵鈉復(fù)合物(SFGCS)或氫氧化鐵-葡萄糖復(fù)合物(FHSC)更復(fù)雜的補(bǔ)血鐵復(fù)合物的體現(xiàn)，因此，包括鐵-糖復(fù)合物或糖-鐵輸送載體或糖-鐵這些名稱可AHS互換使用。因此，補(bǔ)血?jiǎng)┖铣蛇^(guò)程中分子內(nèi)或分子間反應(yīng)或單糖與鐵反應(yīng)所致的結(jié)合可同時(shí)產(chǎn)生具有補(bǔ)血特性的多種結(jié)構(gòu)性物質(zhì)，這些包含在本發(fā)明中。
為了輸送高達(dá)100mg Fe(III)/2.0mL的注射液體，通常提供鐵葡聚糖，而鐵-糖復(fù)合物可提供商品化的單一劑量50-120mg的Fe(III)/5.0mL。在制備時(shí)，許多這些鐵-糖復(fù)合物產(chǎn)品含有10-40％(w/v)非-補(bǔ)血性賦形劑以及合成反應(yīng)副產(chǎn)物。
而在美國(guó)藥典(United State Pharmacopoeia(USP))或National Formulary(NF)的保護(hù)下，一些補(bǔ)血?jiǎng)┚哂幸汛_定的簡(jiǎn)明狀態(tài)，鐵-糖復(fù)合物沒(méi)有公認(rèn)的簡(jiǎn)明參考品、標(biāo)準(zhǔn)化的分子身分特征或文獻(xiàn)記錄的補(bǔ)血活性物質(zhì)獨(dú)特的分子特異性。這表明在諸如SFGCS或FHSC等非-葡聚糖補(bǔ)血?jiǎng)┲械蔫F-輸送載體事先沒(méi)有被充分地純化，并與生產(chǎn)中的賦形劑分離以賦予其詳細(xì)的特征。因此，還沒(méi)有開(kāi)發(fā)出一種基準(zhǔn)參考標(biāo)準(zhǔn)品或一種能夠?qū)⑺杼伢拥难a(bǔ)血?jiǎng)┡c其它特性不確定的物質(zhì)區(qū)分開(kāi)來(lái)的不含賦形劑的質(zhì)量分析控制標(biāo)準(zhǔn)品。自從1975年USP和NF合并產(chǎn)生藥物的USP-NF簡(jiǎn)明準(zhǔn)則以來(lái)，已為3800多種藥物開(kāi)發(fā)出標(biāo)準(zhǔn)的身分和分析方法，而35％的市售藥物仍未包括在USP-NF中。補(bǔ)血藥物如SFGCS和FHSC屬于后者范疇。該問(wèn)題最近發(fā)表于“Raising the Bar for Quality Drugs”，第26-33頁(yè)，Chemical and EngineeringNews，American Chemical Society，2001年3月19日。在特異性抗原引起的免疫和過(guò)敏反應(yīng)的情況下，分子特異性和組成差異的精密分界線可以將一種補(bǔ)血活性分子結(jié)構(gòu)和賦形劑的不良作用水平，與可引起這種不良反應(yīng)另一種補(bǔ)血?jiǎng)┓珠_(kāi)。因此，需要鑒定的特征是記錄一種補(bǔ)血?jiǎng)┌踩托Ч煌谄渌a(bǔ)血?jiǎng)┑奶卣?，其中?duì)于鐵-輸送載體、代表合成時(shí)試劑過(guò)量的賦形劑或補(bǔ)血?jiǎng)┖铣煞磻?yīng)的副產(chǎn)物知之其少。另外，沒(méi)有用現(xiàn)代化分析儀器獲得長(zhǎng)期詳細(xì)的樣品檔案或數(shù)據(jù)，這種分析儀器能有意義地分析即使是最安全的腸胃外給藥的鐵-糖復(fù)合物的化學(xué)物質(zhì)。而且，沒(méi)有鑒定到補(bǔ)血?jiǎng)┱Ｉa(chǎn)條件的變化和投放市場(chǎng)的補(bǔ)血?jiǎng)┗瘜W(xué)結(jié)構(gòu)可鑒定的變化而致其隨后效果不佳之間的相互關(guān)系。本發(fā)明的方法將涉及這些問(wèn)題。
本發(fā)明還提供了用于指紋分析和特性分析SFGCS、FHSC和其它鐵-糖復(fù)合物以及辨別競(jìng)爭(zhēng)性產(chǎn)物和個(gè)別產(chǎn)物所顯示的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化之間的不同的常規(guī)方法的分析基礎(chǔ)。
特性分析AHS的需要也反映在生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量控制需求中，特別是當(dāng)吸熱狀態(tài)和加熱轉(zhuǎn)移可能影響最終產(chǎn)物的質(zhì)量時(shí)。不彩何種專利特主行合成方法、在一些市售的非-葡聚糖產(chǎn)物中可能有熱-驅(qū)動(dòng)或Strecker反應(yīng)而形成的副產(chǎn)物，表明在生產(chǎn)過(guò)程中補(bǔ)血產(chǎn)品的形成至少受到一些可控制的熱-輸入影響。如果加工溫度不需要低于約50℃，這種賦形劑將不產(chǎn)生。此后，產(chǎn)品的質(zhì)量在某種程度上，涉及加熱轉(zhuǎn)移的速率和熱暴露的持續(xù)時(shí)間。當(dāng)產(chǎn)品對(duì)熱加工條件特別敏感時(shí)，對(duì)賦形劑分布圖的知識(shí)還可提供對(duì)于活性藥物學(xué)物質(zhì)的產(chǎn)品質(zhì)量的了解。換句話說(shuō)，監(jiān)測(cè)藥劑的安全有效性也可通過(guò)控制投入市場(chǎng)藥物中存在的賦形劑的性質(zhì)和穩(wěn)定性來(lái)顯示。
對(duì)包括AHS及其共存的賦形劑的鐵-糖復(fù)合物的分析研究，受到低濃度、分子相互作用、分析信號(hào)的重疊等因素所阻礙。對(duì)于SFGCS和FHSC，分析難題包括高濃度的親水性賦形劑、過(guò)量反應(yīng)物和反應(yīng)后的副產(chǎn)物，AHS沒(méi)有預(yù)先分離或報(bào)告它們的個(gè)別特性等等。藥物的參考標(biāo)準(zhǔn)需要遵守實(shí)施方案，常規(guī)上采用分析性辨別方法來(lái)達(dá)到此目的，并且可能要證實(shí)和驗(yàn)證。對(duì)這此方法持續(xù)的需要和本發(fā)明的應(yīng)用有利于遵守該協(xié)議以及證實(shí)生產(chǎn)的持續(xù)性和產(chǎn)品的穩(wěn)定性。
發(fā)明綜述一種監(jiān)測(cè)含有至少一種補(bǔ)血活性物質(zhì)的鐵-糖復(fù)合物產(chǎn)品的方法，其中進(jìn)行這種監(jiān)測(cè)的時(shí)間選自(a)在該復(fù)合物的生產(chǎn)過(guò)程中；(b)該復(fù)合物生產(chǎn)過(guò)程完成時(shí)；(c)復(fù)合物生產(chǎn)后；該方法包括將至少一種補(bǔ)血活性物質(zhì)的分析性反應(yīng)與相應(yīng)于至少一個(gè)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較。例如可以通過(guò)純化溶于稀釋液通常是水的含有鐵-糖復(fù)合物的補(bǔ)血?jiǎng)┙M合物，得到這種標(biāo)準(zhǔn)品，該復(fù)合物含有至少一種補(bǔ)血活性物質(zhì)和至少一種賦形劑。純化方法包括(1)將至少一種補(bǔ)血活性物質(zhì)與至少一種賦形劑分離和任選地，(2)凍干至少一種補(bǔ)血活性物質(zhì)。例如，通過(guò)使用層析柱可完成這種分離。可將各種先進(jìn)和有力的分析方法應(yīng)用于該純化的標(biāo)準(zhǔn)品，因此可監(jiān)視生產(chǎn)過(guò)程和產(chǎn)品的穩(wěn)定性，以及促進(jìn)新的和改良的補(bǔ)血?jiǎng)┑拈_(kāi)發(fā)。并且，本發(fā)明提供了一種鐵-糖復(fù)合物，該復(fù)合物選自含有蔗糖的氫氧化鐵、含有蔗糖的葡糖酸鐵鈉復(fù)合物和糖酸鐵復(fù)合物，該復(fù)合物基本上沒(méi)有賦形劑。生產(chǎn)后，基本上沒(méi)有賦形劑的復(fù)合物含在腸胃外給藥的組合物中或作為凍干產(chǎn)品，可長(zhǎng)期穩(wěn)定貯藏，例如貯藏5年或更長(zhǎng)。
附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1顯示分離或純化AHS所獲得的層析圖或級(jí)分1中分離的鐵-糖復(fù)合物的主要參考標(biāo)準(zhǔn)。
圖2顯示級(jí)分2中4種分離的賦形劑所獲得的層析圖，包括加入的痕量AHS或主要參考標(biāo)準(zhǔn)。
圖3顯示使用高壓液相色譜(HPLC)將鐵-糖復(fù)合物樣品分離為級(jí)分1(AHS)和級(jí)分2(賦形劑)的折射指數(shù)(RI)和激光散射(LLS)分析的結(jié)果。
圖4顯示基于鐵-糖復(fù)合物市售樣品的HPLC分析的LLS和RI數(shù)據(jù)，以及表明AHS或主要參考標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)差異顯示為補(bǔ)血活性物質(zhì)的集合峰(AHSAP)。
圖5顯示基于鐵-糖復(fù)合物第二種市售樣品的HPLC分析的LLS和RI數(shù)據(jù)，以及表明AHS或主要參考標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)差異顯示為補(bǔ)血活性物質(zhì)的集合峰(AHSAP)。
圖6顯示基于鐵-糖復(fù)合物樣品的HPLC分析的LLS和RI數(shù)據(jù)，以及顯示生產(chǎn)后時(shí)間間隔1時(shí)的鐵聚集體峰(AHSAPTAM1)。
圖7顯示基于鐵-糖復(fù)合物樣品的HPLC分析的LLS和RI數(shù)據(jù)，以及顯示生產(chǎn)后時(shí)間間隔2時(shí)的鐵聚集體峰(AHSAPTAM2)。
圖8顯示基于鐵-糖復(fù)合物樣品的HPLC分析的LLS和RI數(shù)據(jù)，以及顯示生產(chǎn)后時(shí)間間隔3時(shí)的鐵聚集體峰(AHSAPTAM3)。
圖9顯示基于鐵-糖復(fù)合物樣品的HPLC分析的LLS和RI數(shù)據(jù)，以及顯示生產(chǎn)后時(shí)間間隔4時(shí)的鐵聚集體峰(AHSAPTAM4)。
圖10顯示分離為級(jí)分1、凍干重建的鐵-糖復(fù)合物的層析和采用RI和基于LLS的HPLC對(duì)其作的分析。
詳細(xì)描述在本發(fā)明公開(kāi)以前，承擔(dān)腸胃外給藥輸送鐵的AHS沒(méi)能以受控制的可重復(fù)的純度與其賦形劑適當(dāng)?shù)胤蛛x開(kāi)來(lái)。賦形劑與AHS的這種混合對(duì)開(kāi)發(fā)改進(jìn)的補(bǔ)血產(chǎn)品和AHS的特性分析提出了難題。本文公開(kāi)了改進(jìn)的方法，為分析監(jiān)控鐵-糖復(fù)合物是否按照生產(chǎn)規(guī)范生產(chǎn)提供了機(jī)會(huì)，也為使用基準(zhǔn)參考標(biāo)準(zhǔn)品確定貯藏穩(wěn)定性指數(shù)和批間比較提供了機(jī)會(huì)。這種基準(zhǔn)參考標(biāo)準(zhǔn)品先前是得不到的，具體是由于沒(méi)有分離AHS。本發(fā)明的方法使具有治療活性的AHS得以從共存的賦形劑中有效地分離出來(lái)并濃縮，然后如果需要再干燥或凍干。本發(fā)明提供了含有蔗糖的葡糖酸鐵鈉復(fù)合物、SFGCS、氫氧化鐵蔗糖復(fù)合物、FHSC和糖酸鐵的制備、特性和用途的信息、方法和分析細(xì)節(jié)。這些物質(zhì)一般稱作鐵-糖復(fù)合物或補(bǔ)血?jiǎng)?。還提供了方法來(lái)建立迄今還沒(méi)有的這些物質(zhì)的參考標(biāo)準(zhǔn)品。本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容還為這些產(chǎn)品的制造和投入市場(chǎng)后的繼續(xù)監(jiān)視進(jìn)行常規(guī)辨別提供了分析基礎(chǔ)。本文公開(kāi)的分析方法和其它方法通常用于鐵-糖復(fù)合物，包括市售和同屬的鐵-糖復(fù)合物以及當(dāng)前市售的行使補(bǔ)血功能的腸胃外給藥的鐵-糖復(fù)合物。
在本發(fā)明公開(kāi)的方法開(kāi)發(fā)之前，因?yàn)闆](méi)有方法來(lái)分離、純化和特性分析AHS但不過(guò)度影響或破壞AHS，所以得不到鐵-糖復(fù)合物的標(biāo)準(zhǔn)品。然而，使用高壓液相層析聯(lián)合激光散射對(duì)AHS的非破壞性特性分析安全和精確地特性分析這種糖-鐵復(fù)合物提供了分析方法。結(jié)合這里所講的分離和純化的過(guò)程，現(xiàn)在有了方法在指定的產(chǎn)品中具有更多機(jī)會(huì)為使用這種物質(zhì)提供AHS參考標(biāo)準(zhǔn)品。
根據(jù)本發(fā)明，特征分析AHS中是否沒(méi)有賦形劑的方法，包括將AHS和結(jié)合的賦形劑分離成為至少兩個(gè)組分。因?yàn)锳HS通常以非常低的濃度存在，一旦被分離，宜濃縮AHS以進(jìn)行詳細(xì)的分析研究。雖然AHS會(huì)降解，但可被濃縮只要在濃縮前或濃縮時(shí)從該組合物中基本上除去親水性賦形劑。干燥(較佳地是凍干)可引起濃縮，但是也可使用其它的方法。弱電子結(jié)合相互作用如水和賦形劑之間的氫鍵給這種分離和干燥AHS提出了難題。當(dāng)HAS投放市場(chǎng)時(shí)，例如以腸胃外給藥形式，AHS通常存在于比不含溶質(zhì)的水(如純水)具有更低水活度(Aw)的水系統(tǒng)中。通常認(rèn)為不含溶質(zhì)的水具有接近或等于1.0的Aw值。水活度是一種參數(shù)，對(duì)應(yīng)于參與物理、化學(xué)和生物反應(yīng)過(guò)程的物質(zhì)或組合物中存在的水的可利用度。水活度下降是水可溶性或親水性物質(zhì)特別是低分子量物質(zhì)存在的結(jié)果。換句話說(shuō)，相應(yīng)于用于結(jié)合或溶解物質(zhì)的水部分的那部分水的是不可利用的。因此，隨著溶解或結(jié)合物質(zhì)的數(shù)量和/或濃度增加，水活度減少。正如在食品和藥物行業(yè)中最常使用的，提高水活度值將伴有化學(xué)和生物降解，因此可加入水可溶性或親水性物質(zhì)以降低Aw值。在本發(fā)明中，溶質(zhì)和/或膠體，包括懸浮或分散在水性組合物中的物質(zhì)，包括伴隨AHS的糖賦形劑，與水相互作用，例如，它們是親水性物質(zhì)或它們形成氫鍵。這種物質(zhì)降低了存在的水的Aw值，至使該值小于1.0。只要親水性賦形劑存在于含AHS的水中，一部分水保持與這種賦形劑結(jié)合，就不可能滿意地實(shí)現(xiàn)從含AHS的組合物中除去水(伴隨其濃縮)。因此，將親水性賦形劑與AHS分離使含有AHS的相或組分的Aw值提高到1.0，并有利于這些優(yōu)選物質(zhì)的濃縮、干燥和分析。
在含有SFGCS和FHSC的系統(tǒng)中溶質(zhì)對(duì)水的作用直接影響這些物質(zhì)的干燥(包括凍干)行為，因?yàn)樗鼈冡尫诺挠H水性物質(zhì)和賦形劑濃度的降低伴有水蒸氣壓力的增加以及Aw值的相應(yīng)增加。表示為Aw的水活力概念，發(fā)現(xiàn)其在食品科學(xué)領(lǐng)域中有最為重要的用途(見(jiàn)，例如“食品科學(xué)原理”P(pán)rinciple of FoodScience，O.R.Fennema編，“第二部分，食物防腐的物理原理”P(pán)hysical Principle ofFood Preservation，M.Karel等，237-263頁(yè)，Marcel Dekker，Inc.1975，Enclyclopediaof Food Science，M.S.Peterson等編，“關(guān)于食物的水活度”Water Activity in Relationto Food”，D.H.Chou，852-857頁(yè)，Avi Publ.Co.，Inc.，1978，在允許的范圍內(nèi)本文引用作為參考)。前提是在食物貯藏中可能發(fā)生的化學(xué)和物理過(guò)程與食物中水的數(shù)量和狀態(tài)之間存在著一種關(guān)系。相同的原理可用于其中存在著水并可能受水影響的其它物質(zhì)或組合物。水作為一種溶劑、稀釋劑等存在于組合物中，其特征可能是游離的或未結(jié)合的或以各種程度結(jié)合于其它化合物，例如，在本發(fā)明的情況下與賦形劑或AHS結(jié)合?？墒褂酶鞣N方法測(cè)定水結(jié)合的程度，包括測(cè)定在低于0℃時(shí)含有組合物的水中未凍結(jié)水的量，可使用核磁共振測(cè)定，絕緣性能測(cè)定和蒸氣壓力測(cè)定；由于簡(jiǎn)單優(yōu)選后一種方法。該方法中，水活度定義為在給定的溫度下，在有水存在的組合物或化合物中，水的局部壓力與純水的蒸氣壓力的比。這是從Raoult法則得來(lái)的，該法則中將一種溶液中的水蒸氣壓力(P)與純水(不含有溶劑)的蒸氣壓力(P0)相比。當(dāng)比值P/P0逐漸降低小于1.0時(shí)，Aw值變小，該水的熵狀態(tài)下降，其蒸氣壓降低，推側(cè)是水-溶質(zhì)結(jié)合相互作用增加的結(jié)果，除去水的蒸氣相變得更加困難。這些條件會(huì)影響凍干的干燥過(guò)程。并且，換句話說(shuō)，在復(fù)合物混合液中，化學(xué)化合物或復(fù)合物可能不完全溶解或以真正溶液的形式存在，這可能大大地偏離了理性的Roult法則公式，并且，含有組合物的成分的水活度可能不同。在多相組合物中還觀察到水從Aw較高的成分轉(zhuǎn)移或擴(kuò)散到Aw較低的成分，可能與根據(jù)濃度驅(qū)動(dòng)力所預(yù)期的相反而發(fā)生(M.Karel等，251頁(yè))。還應(yīng)理解，當(dāng)干燥一種復(fù)雜的組合物時(shí)，與水有不同程度相互作用(例如不同的氫鍵水平)的溶質(zhì)可被濃縮，可能以復(fù)雜的和變化的方式影響到排除水的能力。這也是補(bǔ)血活性物質(zhì)難以與其賦形劑充分地分離的一個(gè)重要原因，因此可能需要確定和控制適合的干燥加工條件。水可能與化合物上的特異性位點(diǎn)牢固結(jié)合，包括多糖的羥基，以及結(jié)合于羰基和氨基，以及其它的水可通過(guò)氫鍵、離子-偶極鍵或通過(guò)其它強(qiáng)相互作用而結(jié)合的位點(diǎn)。因此，在本發(fā)明中，水可能結(jié)合于AHS和賦形劑的特異性位點(diǎn)，例如作為一個(gè)單分子層。這種水可作為未凍結(jié)的水存在，除非溫度大大低于0℃，此外可作為非溶劑性水存在。在本發(fā)明的組合物中，已知水與蔗糖牢固結(jié)合因此在含蔗糖的組合物中Aw降低。所以，干燥特別是凍干(下面詳細(xì)描述)可能受到不利影響。
不論凍干與否，制備純化的AHS成為一種了離物質(zhì)的能力，提供了為確定這種補(bǔ)血產(chǎn)品的化學(xué)和結(jié)構(gòu)特征的重要能力。通過(guò)為這種補(bǔ)血?jiǎng)┙⒖沈?yàn)證的和可重復(fù)的參數(shù)，可以建立一個(gè)質(zhì)量控制框架，例如，AHS的批間均一性。背離驗(yàn)證的AHS結(jié)構(gòu)均一性可用作貯藏穩(wěn)定性的指標(biāo)和幫助鑒定生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)生變化的原因-結(jié)果關(guān)系。使用現(xiàn)代技術(shù)分離和分析鑒定這些試劑特性的能力，具體說(shuō)是激光散射技術(shù)，可幫助確定這種鐵-糖復(fù)合物的屬性。
對(duì)補(bǔ)血?jiǎng)┑蔫F-糖復(fù)合物的合成知道得很少，因?yàn)檫@種合成通常依賴于專利方法。類似的，對(duì)于這種組合物可得到的分析資料也很少。根據(jù)整個(gè)固體的重量/體積測(cè)定，人們認(rèn)為藥物學(xué)補(bǔ)血活性物質(zhì)或補(bǔ)血?jiǎng)┲械蔫F-遞送載體應(yīng)少于5％并可低至1.0％。因此，通常應(yīng)測(cè)定市售產(chǎn)品中在高百分比的親水性賦形劑存在下釋放的AHS的特征。低濃度的單一三價(jià)鐵-遞送載體伴有相對(duì)大量的賦形劑為AHS的特性測(cè)定提出了難題。另外，由于認(rèn)為AHS不穩(wěn)定不能分離用于分析，所以沒(méi)有建立AHS的參考標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)本發(fā)明描述的方法，可將AHS與其賦形劑有效分離開(kāi)來(lái)，這些方法可擴(kuò)展用于開(kāi)發(fā)改進(jìn)的補(bǔ)血?jiǎng)┍旧砘蚺c其它藥劑的混合物。例如，純化的AHS可與促紅細(xì)胞生成素或其它有用的藥物聯(lián)用。
得到不含賦形劑的AHS允許更密切地分析性監(jiān)測(cè)AHS和它的藥物性能。而且，當(dāng)藥物中賦形劑占整個(gè)固體重量的高百分比時(shí)，單獨(dú)監(jiān)測(cè)這種賦形劑的能力對(duì)質(zhì)量控制、生產(chǎn)和臨床性能等問(wèn)題同樣重要。出乎預(yù)料的臨床效果可能是生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)生的事先沒(méi)注意到的或改動(dòng)了賦形劑的分布和類型的結(jié)果。對(duì)于食品系統(tǒng)，由于溫度對(duì)糖類的影響產(chǎn)生的副產(chǎn)品化合物可提供對(duì)加工生產(chǎn)步驟是否充分和受到控制的重要認(rèn)識(shí)。H.-J.Kim講述了其它產(chǎn)物的這類問(wèn)題美國(guó)專利5,254,474，而其他人注意力集中于加熱產(chǎn)生的乙醛在生物技術(shù)中的運(yùn)用，見(jiàn)C.M.Smales，D.S.Pepper，和D.C.James，2000，“蔗糖存在下β-乳球蛋白變種A在模擬抗病毒熱處理生物加工過(guò)程中蛋白質(zhì)被修飾的機(jī)制”(Mechanisms of protein modificationduring model antiviral heat-treatment bioprocessing of beta-lactoglobulin.variant A inthe presence of sucrose)，Biotechnol.Appl.Biochem.，10月，32(Pt.2)109-119。檢測(cè)藥物生產(chǎn)中與加熱對(duì)糖影響有連系的化合物也是重要的，其中加熱是合成中的一個(gè)因素。的確若鑒定到復(fù)合物如FHSC和SFGCS中僅有微量的賦形劑和分布可以證實(shí)所用的合成條件是適當(dāng)?shù)摹?br> 本發(fā)明提供了將補(bǔ)血?jiǎng)┌⊿FGCS、FHSC和糖酸鐵分離成為至少兩個(gè)不同組分的方法。另外，該方法通常適用于這樣的產(chǎn)物，該產(chǎn)物中，鐵是作為鐵-糖復(fù)合物或鐵遞送載體提供的，其中鐵與碳水化合物的帶負(fù)電荷羧基結(jié)合而存在。補(bǔ)血?jiǎng)┑囊粋€(gè)組分，本文稱作級(jí)分1，含有鐵-糖復(fù)合物或鐵-遞送補(bǔ)血活性物質(zhì)，AHS。另一組分，本文稱作級(jí)分2，含有在最初組合物(如，合成的或投放市場(chǎng)的)中與AHS共存的基本上全部賦形劑的混合物，級(jí)分2中的賦形劑可以是，例如，親水性有機(jī)物或離子化合物。
液體級(jí)分1或2中的溶質(zhì)或懸浮或分散的成分，可用于詳細(xì)的分析研究或特征鑒定目的，并可進(jìn)一步濃縮或在新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)中作為起始物質(zhì)使用。本發(fā)明公開(kāi)說(shuō)明了這些組分的分離方法但相關(guān)的成分可以發(fā)揮分析作用以便于基準(zhǔn)參考標(biāo)準(zhǔn)品的建立，這些標(biāo)準(zhǔn)品的特征是沒(méi)有其賦形劑的含有蔗糖的葡糖酸鐵鈉復(fù)合物SFGCS、和氫氧化鐵蔗糖復(fù)合物FHSC。并且，本發(fā)明公開(kāi)了制備濃縮和凍干的和任選重組的AHS的方法?？蓮暮铣傻幕蚴惺鄣囊栽谒?水)組合物中含有結(jié)合的AHS和賦形劑的補(bǔ)血?jiǎng)╅_(kāi)始，實(shí)現(xiàn)各種成分的分離，然后選擇性地再分配或提取賦形劑，使它們存在于基本上分離的水相中。建立了這兩個(gè)組分后，對(duì)每一組分可進(jìn)行詳細(xì)的分析性特征鑒定，如果需要可作進(jìn)一步純化，并濃縮以滿足分析、合成或生產(chǎn)的目的。
補(bǔ)血?jiǎng)┦且活愒O(shè)計(jì)用于轉(zhuǎn)運(yùn)造血有用的鐵的藥物，級(jí)分1含有至少約75％到100％的AHS；較佳至少約80wt.％到約99.9wt.％；更佳至少約90wt.％到約99.9wt.％；最佳至少約95wt.％到約99.9wt.％的AHS；目的是腸胃道外遞送。級(jí)分2含有相應(yīng)的低水平AHS(例如少于0.1wt.％)和基本上最初在于補(bǔ)血?jiǎng)┙M合物中的所有賦形劑。
1.將AHS與共存的賦形劑充分地分離可將至少一種活性補(bǔ)血?jiǎng)〢HS，與存在于合成的補(bǔ)血?jiǎng)┗蛞澡F-糖復(fù)合物為特征的市售藥物中的賦形劑分離開(kāi)來(lái)或基本分離開(kāi)來(lái)。作為確定含有一種鐵-糖復(fù)合物的補(bǔ)血?jiǎng)┙M合物的幾種重要的特征的結(jié)果，本發(fā)明人完成了這種分離，分離過(guò)程包括(1)需要提高含AHS相或組分的Aw值；(2)AHS顯示至少有一種可檢測(cè)的鐵物質(zhì)，分子量為大約250,000-3,000,000道爾頓或更高；(3)生產(chǎn)和穩(wěn)定性的變化可導(dǎo)致存在一種以上的可檢測(cè)的含鐵物質(zhì)；(4)含F(xiàn)e(III)物質(zhì)可顯示不同的形狀，如激光散射測(cè)定的形狀；(5)含F(xiàn)e(III)的AHS具有電荷，和(6)含F(xiàn)e(III)的AHS可具有可檢測(cè)的氧化-還原(氧化還原作用)電位，表明三價(jià)鐵Fe(III)或二價(jià)鐵Fe(II)的存在。通過(guò)采用一種或多種如下方法可完成AHS與其賦形劑分離成為至少兩個(gè)組分，在約6.0-8.0；較佳的約6.4-7.8，更佳的約6.6-7.6，例如6.8-7.4pH范圍內(nèi)具有或不具有初步的pH穩(wěn)定性。
1.動(dòng)電遷移，其中AHS的濃度取決于引起帶電的AHS沉積于一種帶電收集表面上或一種液體(該液體中存在與其賦形劑分離的帶電表面)之中的直流電。
2.基于動(dòng)電的膜技術(shù)，其中將一個(gè)陰極和一個(gè)陽(yáng)極放入用半透性膜分開(kāi)的水系統(tǒng)中。直流電施加于膜上由于異性電荷相吸導(dǎo)致帶電的AHS濃縮于適當(dāng)?shù)碾姌O上。這種AHS濃縮于一個(gè)區(qū)室內(nèi)的單一電極上使親水性賦形劑碳水化合物可通過(guò)半透性膜透析-介導(dǎo)移動(dòng)到旁邊的區(qū)室中。優(yōu)選的半透性膜包括纖維素、乙酸纖維素、纖維素酯或再生纖維素。為了維持AHS停留在一個(gè)區(qū)室中，該膜優(yōu)選約90,000-300,000的排斥分子量；更佳約150,000-200,000。該方法優(yōu)選的條件包括使用蒸餾水、去離子水，pH為約7.5-9.8；壓力為約1.0大氣壓；溫度約2℃-50℃。親水性賦形劑的透析去除率可通過(guò)不斷更換透析液而得到改善。Ficks法則描述了該過(guò)程，F(xiàn)＝-DA(dc/dx)，其中F＝總通量；D是物質(zhì)在介質(zhì)如水中的擴(kuò)散率；A是可用于擴(kuò)散的表面積和dc/dx是賦形劑通過(guò)膜的濃度梯度。
3.從共存的賦形劑濃縮AHS的毛細(xì)管電泳技術(shù)。毛細(xì)管電泳，有時(shí)稱作毛細(xì)管區(qū)帶電泳，依賴于將帶電分析物導(dǎo)入融合的硅毛細(xì)管中，毛細(xì)管的大小為直徑約50-75微米，長(zhǎng)50-100厘米，并對(duì)其施用約30千伏的電壓。組合物中的帶電物質(zhì)的不同動(dòng)電遷移可通過(guò)本文所描述的各種方法進(jìn)行檢測(cè)和記錄，包括UV-VIS，熒光和質(zhì)譜分析。帶電物質(zhì)在毛細(xì)管中的最終的遷移位置可記錄為電泳圖。由于鐵-糖復(fù)合物中AHS上存在大量電荷這種方法特別有用。
4.柱層析，這是一個(gè)選擇性分離AHS特別優(yōu)選的方法。由于AHS的不連續(xù)分子量、尺寸大小、形狀和所帶的電荷與共存的賦形劑相反，當(dāng)液體載體或洗脫液(如水)運(yùn)送它們?cè)竭^(guò)和/或通過(guò)一個(gè)固體支持物時(shí)，AHS參與不同的固定相的相互作用。這樣，導(dǎo)致這種分離具有不同的擴(kuò)散或遷移率，反映了相對(duì)電荷和/或大小排阻差別，阻礙或促進(jìn)這些物質(zhì)洗脫通過(guò)層析系統(tǒng)。還可通過(guò)改變孔隙率、電荷或固定相表面上的吸附特性調(diào)節(jié)分離效果。這種層析過(guò)程可在約3℃-150℃間進(jìn)行，較佳在約15℃-35℃，通常在25℃，使用水性或非水性溶劑以單一的或多重系列流程表加到柱上?？杉訅旱巫⒘魅牒土鞒鰧游鲋M(jìn)行AHS的層析分離。分析柱的內(nèi)部壓力范圍可以從低于大氣壓力到分析柱和固定相材料可以耐受的任何壓力。高于一個(gè)大氣壓(0.1MPa)的操作壓力是優(yōu)選的，但可使用10,000磅/平方英寸(69Mpa)的壓力。加入分析柱的洗脫液可包括任何溶劑或稀釋劑，只要保持AHS為鐵-糖復(fù)合物。這種洗脫液包括C1-C6烷醇、乙醇胺、二甲亞砜、羰基溶劑、二甲基甲酰胺、水、水性緩沖溶液和含水-糖溶液的各種混合物。使用約2.0-25重量百分比的伯醇有利于控制潛在微生物的生長(zhǎng)。購(gòu)買(mǎi)得到適合的固定相材料包括多孔硅、鑒定為葡聚糖的交聯(lián)聚葡聚糖、交聯(lián)丙烯酸脂聚合物、乙二醇和丙烯酸脂的共聚物、交聯(lián)聚苯乙烯、氧化鋁、瓊脂糖凝膠、環(huán)式糊精和可使用的陽(yáng)離子及陰離子交換填充物。柱層析分離補(bǔ)血?jiǎng)┙M合物中的AHS與其賦形劑的特別優(yōu)選固定相，是商業(yè)購(gòu)得的各種級(jí)別(Sephadex G-10，G-15和G-25(Amersham-PharmaciaBiotech.，Piscataway，NJ)的交聯(lián)聚葡聚糖或葡聚糖；商品化的驗(yàn)明為GMPWXL的分析柱具有13微米的顆粒直徑，孔的大小為100-200埃以及有機(jī)玻璃支柱(TosohBiosep，Montgomeryville，PA)。當(dāng)使用固體固定相填充柱時(shí)，孔的直徑優(yōu)選約30-9000埃，更優(yōu)選100-8000埃。對(duì)于AHS的大量分離特別優(yōu)選的是葡聚糖固定相，如使用低壓層析法；有機(jī)玻璃支柱對(duì)于AHS的分析性特征鑒定是特別優(yōu)選的，如使用HPLC。
本發(fā)明的方法可單獨(dú)或相互結(jié)合用于分離AHS，該AHS主要或基本導(dǎo)致由于FHSC或SFGCS所致的藥物作用。經(jīng)過(guò)充分地分離層，所得純化的AHS可用作建立主要參考標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)。進(jìn)行該主要參考標(biāo)準(zhǔn)可提供用于監(jiān)測(cè)生產(chǎn)和藥物質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)品。如果需要，可使用本文所講授的方法進(jìn)一步純化AHS。例如，當(dāng)使用HPLC聯(lián)合LLS和RI分析補(bǔ)血?jiǎng)┙M合物，顯示在AHS主要參考標(biāo)準(zhǔn)峰上有一個(gè)肩峰，或在AHS主要參考標(biāo)準(zhǔn)峰之前有一個(gè)峰時(shí)，可使用進(jìn)一步的分離方法。如本文所述，這種肩峰或第二個(gè)峰可存在于補(bǔ)血?jiǎng)┙M合物中，是背離優(yōu)選生產(chǎn)條件的結(jié)果或該補(bǔ)血?jiǎng)┙M合物貯存的結(jié)果，特別是親水性賦形劑存在的結(jié)果。進(jìn)一步的分離或純化過(guò)程包括利用HPLC分析結(jié)果或直接從連接于LLS探測(cè)器的制備型層析柱得到的數(shù)據(jù)，進(jìn)一步分離從制備型層析柱首先洗脫的物質(zhì)。照這種方法，大量的或基本上全部不需要的聚集的AHS可與優(yōu)選的AHS分離。當(dāng)前面有一個(gè)非-AHS峰并且明顯與特征性AHS主要參考標(biāo)準(zhǔn)峰分開(kāi)，可將對(duì)應(yīng)于這個(gè)峰的基本上都是聚集的物質(zhì)與所需的AHS分離，例如，在級(jí)分1中，一個(gè)肩峰出現(xiàn)在主要參考標(biāo)準(zhǔn)AHS峰上，像下面所要進(jìn)一步討論的那樣，分離基本上所有不需要的物質(zhì)，如聚集的物質(zhì)時(shí)，可能必然攜帶有一些優(yōu)選的AHS，或者相反，不可能除去所有的聚集物質(zhì)。分離和純化的程度可以參考根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行確定。因此，除了除去基本上所有的低分子量物質(zhì)即本發(fā)明補(bǔ)血?jiǎng)┙M合物中存在的主要親水性賦形劑外，對(duì)于聚集的鐵復(fù)合物而言本文所講授的方法可產(chǎn)生同樣的基本上純化的AHS。
使用本發(fā)明講授的方法，可將離散的補(bǔ)血活性物質(zhì)(AHS)與商業(yè)可得的以鐵-糖復(fù)合物為特征的腸胃外給藥組合物中的賦形劑分開(kāi)；此分離的物質(zhì)可作為“主要參考標(biāo)準(zhǔn)品”。一種從共存的賦形劑分離出AHS的方法采用低壓凝膠滲透層析(GPC)。在本發(fā)明中，低壓指在環(huán)境壓力下操作層析柱，包括用于抽吸液體進(jìn)入的附有閥門(mén)管線的填充柱和任選的其它設(shè)備中的壓力包括一個(gè)或多個(gè)分析儀器或檢測(cè)器中的略高于環(huán)境壓力的壓力。這種技術(shù)不僅可用于分析分離的物質(zhì)，還可用于生產(chǎn)大量的AHS以制備新的腸胃外給藥組合物。較佳的，柱填充物包括具有證實(shí)的分子量或大小排阻特征高于約5,000道爾頓的氯甲代氧丙環(huán)-交聯(lián)聚葡聚糖；更佳的大小排阻特征高于約1,500道爾頓的是優(yōu)選的。從Amersham-PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ.購(gòu)得適當(dāng)?shù)脑O(shè)備。并且，具有GPC特性的離子交換凝膠和親和性層析柱也是適宜的。
該AHS通常存在于級(jí)分1中，其后洗脫的賦形劑在級(jí)分2中。既然物質(zhì)以持續(xù)的方式從分析柱上洗脫，參考品組分是以分析柱洗脫的物質(zhì)部分為基礎(chǔ)，這些部分中存在著基本上所有優(yōu)選的AHS或與其賦形劑充分分離的主要參考品AHS。指示這種分離的洗脫物質(zhì)的一種方法是觀察移動(dòng)相的LLS信號(hào)已緊靠近基線值或回到基線值的位置，隨后出現(xiàn)表明存在AHS和/或聚集AHS的第一峰或幾個(gè)峰(如下文進(jìn)一步討論的)。在一個(gè)優(yōu)選的方法中，一個(gè)溶劑貯罐將水-基稀釋劑或溶劑通過(guò)重力或流量計(jì)加到一選定直徑或長(zhǎng)度的層析柱上，只要該柱的長(zhǎng)度至少為直徑的兩倍。該層析柱可以用玻璃、不銹鋼、聚碳酸酯或與該組合物和使用的稀釋劑或溶劑不發(fā)生反應(yīng)并能裝填固定相層析載體物質(zhì)(也稱作層析床)的其他物質(zhì)構(gòu)成。層析床通常包含適合的多孔性珠粒，但層析床的其它形式也可在層析柱范圍內(nèi)原位制作，例如原位灌入多孔聚合物。在實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程中，被稱作移動(dòng)相的水-基溶劑(或稀釋劑)越過(guò)或穿過(guò)珠粒的間隙即多孔載體層析床。液體或洗脫液流出分析柱，通過(guò)管道流徑一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)器，以分析液流測(cè)定其基線特征。檢測(cè)器放置于適當(dāng)?shù)奈恢靡蕴幚韽囊粋€(gè)檢測(cè)器到下一個(gè)檢測(cè)器的一系列洗脫液流，或液體分流至平行的、多個(gè)檢測(cè)器進(jìn)行監(jiān)測(cè)。這些檢測(cè)器顯示洗脫液流的實(shí)時(shí)流量體積特征。使用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)器測(cè)定和記錄水流的特性，如Ph、導(dǎo)電性、電化學(xué)還原電位、散射指數(shù)(RI)和其它有用的分析特性。UV-VIS吸收和散射指數(shù)是測(cè)定流動(dòng)相基線特性的優(yōu)選檢測(cè)項(xiàng)目。
將鐵-糖復(fù)合物，例如商業(yè)購(gòu)得的腸胃外給藥組合物注入引進(jìn)填充柱床頂端的水流中，確保組合物中的各種組成成分分布并通過(guò)多孔性層析珠粒。不愿受理論所束縛，認(rèn)為此法可對(duì)含有鐵-糖復(fù)合物的大小不同的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行分離，例如可能通過(guò)篩分作用與潛在的氫鍵相互作用。比孔隙大的化學(xué)物質(zhì)受孔隙排斥首先以相對(duì)小的洗脫體積(Ve1)流出分析柱。當(dāng)樣品持續(xù)流動(dòng)通過(guò)層析柱時(shí)，逐漸地較小的分子被夾帶入孔隙中，隨后以相對(duì)較大的洗脫體積(Ve2)流出層析柱。這樣，級(jí)分1補(bǔ)血?jiǎng)┲械拇蠓肿游镔|(zhì)，例如AHS先洗脫(Ve1)，而級(jí)分2中較小的賦形劑化學(xué)物質(zhì)后洗脫(Ve2)。當(dāng)應(yīng)用于包括SFGCS、FHSC等成分的初始腸胃外給藥補(bǔ)血?jiǎng)r(shí)，這樣的層析分離產(chǎn)生至少兩種成分或組分AHS及其賦形劑。如后面將要描述的那樣，較大的副產(chǎn)品或降解物質(zhì)也可能與AHS一起洗脫，或在AHS前洗脫。AHS的分離基本完全，所以它與起初共存的賦形劑分離，具體說(shuō)是與親水性賦形劑，包括具有不同熒光特性的那些賦形劑分離。因此，產(chǎn)生的AHS在高Aw的水性組分中，即級(jí)分1中，基本不含賦形劑；而基本上所有的賦形劑存在于第二級(jí)分2中，即級(jí)分2中具有低Aw狀態(tài)特征。除了賦形劑的大小與層析床起相互作用之外，層析床中酸氫-基結(jié)合(AH-B)動(dòng)力學(xué)可進(jìn)一步提高賦形劑從層析柱洗脫的有效體積(Ve2)。酸氫-基結(jié)合相互反應(yīng)見(jiàn)Hodge，J.E.和E.M.Osman的一般描述，1976，第三章，“食品化學(xué)”Food Chemistry，O.R.Fennema編，Marcel Dekkar，紐約，92-96頁(yè)；和ZapsalisC.和R.A.Beck，1985，“食品化學(xué)和營(yíng)養(yǎng)生化”Food Chemistry and NutritionalBiochemistry，第10章，John Wiley和Sons，588-591頁(yè)(在允許的范圍內(nèi)引入作為參考)。對(duì)于本發(fā)明的目的而言，術(shù)語(yǔ)“基本不含”當(dāng)用于指分離的AHS時(shí)，基本上不含賦形劑意思是指，含有AHS的組分包括自層析柱洗脫的AHS大于約75wt.％；通常大于約85wt.％；較佳大于約95wt.％；更佳大于約98wt.％；更更佳大于約99wt.％和最佳大于約99wt.％直至低于或等于約100wt.％(換句話說(shuō)，可存在痕量的賦形劑，洗脫的AHS的量不包括微量的或痕量的可能滯留于層析柱、管道、檢測(cè)器中的或加工過(guò)程中損失的AHS)。相應(yīng)地，這種賦形劑最初存在于灌注層析柱的組合物中、或可能在加工過(guò)程中產(chǎn)生，包含在后來(lái)的賦形劑組分即級(jí)分2中，其數(shù)量等于從100wt.％減去上述值。例如，如果AHS組分含有大于約99.0wt.％的AHS，存在的賦形劑的量則小于約0.1wt.％。
與賦形劑相比，在層析洗脫液流中存在的AHS可使用激光散射進(jìn)行觀察，如上文所述。另外，AHS和賦形劑的洗脫圖譜可使用一種或多種不同類型的檢測(cè)儀檢測(cè)，該檢測(cè)儀輸出的信號(hào)同時(shí)記錄了洗脫液流。在一個(gè)優(yōu)選的方法中，使用一個(gè)檢測(cè)儀，該檢測(cè)儀對(duì)所用的UV-VIS吸收檢測(cè)器的波長(zhǎng)(λ)敏感，另外一個(gè)檢測(cè)儀是濃度敏感折射指數(shù)(RI)檢測(cè)儀。從這些檢測(cè)儀獨(dú)立輸出的雙重信號(hào)經(jīng)處理并分別記錄為共同橫坐標(biāo)(x-軸)和兩個(gè)獨(dú)立的縱坐標(biāo)(y-軸)以累積的洗脫體積(如毫升)單位或份(i)表示，如前所述。該方法可鑒定那里是含有基本上所有的AHS的所謂的級(jí)分1結(jié)束處，和那里是含有基本上所有的賦形劑的級(jí)分2開(kāi)始處。實(shí)驗(yàn)證據(jù)證明各組分可被及時(shí)地充分分離，因此可得到基本上不含賦形劑的AHS。
根據(jù)Beer-Lambert法則，吸光率與特異性光-吸收物質(zhì)的濃度有關(guān)。一種光吸收物質(zhì)的吸光率(A)表達(dá)為A＝εbc 公式5這里c是光吸收物質(zhì)的濃度(摩爾/升(M/L))；b是通過(guò)光吸收物質(zhì)的光程(厘米(cm))；和ε是稱為摩爾消光系數(shù)的比例常數(shù)。在給定的光波長(zhǎng)下，一種光吸收物質(zhì)的該比例常數(shù)是唯一的。該基本法則解釋了這樣一個(gè)事實(shí)，在一個(gè)特定的波長(zhǎng)(λ)下一種光吸收物質(zhì)的吸光率可轉(zhuǎn)變成其摩爾濃度的定量測(cè)定。因此，一種分析物在指定的波長(zhǎng)下其吸光率的正增長(zhǎng)對(duì)應(yīng)于其摩爾濃度的增長(zhǎng)。為了監(jiān)測(cè)SFGCS或FHSC層析洗脫液中的AHS，435nm是優(yōu)選的，因?yàn)殍F-糖復(fù)合物在此波長(zhǎng)具有高的消光系數(shù)，即6.590log10。對(duì)于使用層析分離制備基本上不含賦形劑的AHS，將A430nm值相對(duì)于層析柱洗脫液體積制表。這可轉(zhuǎn)化為層析洗脫圖譜，其中A430nm縱坐標(biāo)(y軸)值和洗脫液體積(x軸)相互對(duì)應(yīng)作圖。正如所討論的，較大的AHS在較小的賦形劑之前從層析柱洗脫。只要吸光率的變化(ΔA)對(duì)應(yīng)于洗脫液體積(ΔV)的變化或ΔA/ΔV相一致，顯示在不含溶質(zhì)的基線洗脫信號(hào)上方成正比值(+ΔA/ΔV)，洗脫液中AHS的濃度增加。對(duì)于負(fù)比值(-ΔA/ΔV)反之亦然。當(dāng)ΔA/ΔV的比值從(+)轉(zhuǎn)變?yōu)?-)時(shí)，AHS的層析洗脫達(dá)到最大，形成“層析峰”。從上述這一點(diǎn)起，層析圖譜持續(xù)顯示負(fù)比值(-ΔA/ΔV)洗脫液中AHS的濃度下降。只要A430nm逐漸地下降并且A430nm值接近0.0A值，這對(duì)于AHS濃度是真實(shí)的。當(dāng)該測(cè)定信號(hào)顯示AHS洗脫結(jié)束，濃度敏感的RI檢測(cè)器開(kāi)始對(duì)洗脫液中親水性物質(zhì)或其它賦形劑量的增加作出反應(yīng)。如上所述，比值RI的正(+)變化對(duì)應(yīng)于體積的變化(+ΔRI/ΔV)，信號(hào)顯示賦形劑濃度增加。在收集的洗脫液中ΔA/ΔV仍顯示負(fù)比值(-ΔA/ΔV)逐漸地接近0.0A值，RI-檢測(cè)器開(kāi)始顯示+ΔRI/ΔV斜率，這標(biāo)志級(jí)分1基本結(jié)束和級(jí)分2有效開(kāi)始的實(shí)際分界線。級(jí)分1含有在高Aw環(huán)境中的AHS，級(jí)分2含有在低Aw環(huán)境中的親水性或其它賦形劑。以這種方式確定洗脫圖譜。
確定分離時(shí)級(jí)分1基本結(jié)束和級(jí)分2有效開(kāi)始的洗脫分界線，還可通過(guò)在430nm處測(cè)定層析柱洗脫液中AHS的透光百分比來(lái)確定。用于這一目的的合適儀器是由Hunter Associates Laboratory，Inc，Reston，VA生產(chǎn)的“ColorQuest XE”系統(tǒng)。當(dāng)AHS存在于洗脫液中該洗脫液的透光度增加漸漸地接近0百分比，可顯示AHS已充分分離或洗脫結(jié)束。洗脫液水流的RI-反應(yīng)隨后增加，標(biāo)志含有賦形劑的洗脫液開(kāi)始流出。在另一個(gè)實(shí)施例中，級(jí)分1基本結(jié)束和級(jí)分2有效開(kāi)始之間的界線可通過(guò)測(cè)定洗脫液流的A620nm蒽酮基的吸光率確定。既然AHS和賦形劑具有顯著的葡萄糖當(dāng)量(DE)吸光度，可檢測(cè)的A620nmDE-值在級(jí)分1和級(jí)分2之間是極小的。強(qiáng)調(diào)說(shuō)明這種分析概念的原理見(jiàn)R.Dreywood所描述，“碳水化合物材料的定性測(cè)定”Qualitative Teat for Carbohydrate Material，Indus.和Eng.Chem.，Anal.編，18499(1946)；J.E.Hodge和B.T.Hofreiter，“還原糖和碳水化合物的測(cè)定”Determinationof Reducing Suger and Carbohydrates，”Methods Carbohydrate Chem.，1384-394(1962)；以及最近由C.Zapsalis和R.A.Beck，描述的，“食品化學(xué)和營(yíng)養(yǎng)生化”FoodChemistry and Nutritional Biochemistry，第6章，John Wiley和Sons，353-354頁(yè)，(每一公開(kāi)內(nèi)容在允許的范圍內(nèi)本發(fā)明引用作為參考)。
本發(fā)明的方法可允許大批量地制備任何類型的鐵糖復(fù)合物中的AHS(例如，從大于約500毫克到大于或等于1.0克；或者大約1.0克到約10克或更多；大約1.0克到100克或更多；大約1.0克到1千克或更多；例如，如果需要，可使用本方法生產(chǎn)數(shù)百或甚至數(shù)千千克)或少量的AHS分析樣品(大約5.0到500.0毫克)。由于AHS是這些腸胃外給藥組合物中復(fù)合性鐵的優(yōu)選組分，分離AHS的能力形成制備主要參考標(biāo)準(zhǔn)品的基礎(chǔ)。級(jí)分1的分離允許進(jìn)一步進(jìn)行詳細(xì)的化學(xué)和/或結(jié)構(gòu)分析；在本文的其它地方描述了這種方法。然而可進(jìn)一步濃縮分離的AHS級(jí)分1，以及賦形劑級(jí)分2用于詳細(xì)的研究。
本發(fā)明還適合于小量生產(chǎn)AHS(從至少約1.0毫克到少于5毫克)，較佳的使用高壓(或高效)液相層析(HPLC)?？刹捎眠m當(dāng)?shù)膶游龉滔噍d體從其賦形劑分離出AHS。這導(dǎo)致AHS轉(zhuǎn)移到層析柱中顯示高Aw，接近1.0值的液流中。賦形劑時(shí)轉(zhuǎn)移到低Aw的液流中，其Aw值低于含有AHS的液相。該方法的操作原則與上述低壓層析方法類似，但是HPLC方法的固定相柱床材料更精細(xì)，可承受約5,000-10,000磅/平方英寸的壓力(約35-69MPa)。這導(dǎo)致從層析柱流出的洗脫液流速較慢，但可為高水壓所抵消?？刹捎靡蕾囉谖?解吸附分析物分離現(xiàn)象的硅-基固定相相層床從賦形劑分離出AHS。然而這種硅-基分離效果難以控制并需要精確地制備含疊氮化物的水性移動(dòng)相；因此，它們會(huì)遇到較大的分析誤差。另外，從硅-基床上脫落的顆粒使LLS的檢測(cè)器的使用復(fù)雜化或可能妨礙LLS檢測(cè)器的使用效果。因此，聚合的HPLC分析柱，如Tosoh Biosep，Montgomeryville，PA生產(chǎn)的GMPWXL品牌，使用了優(yōu)于硅-基層析柱的優(yōu)選水性移動(dòng)相。這種HPLC分析，例如，商品投放形式的鐵-糖復(fù)合物要求先通過(guò)例如Anotop25品牌的無(wú)機(jī)膜(Whatman，Maidstone)進(jìn)行0.02微米過(guò)濾。
2.特征鑒定AHS主要參考標(biāo)準(zhǔn)品和共存的賦形劑的方法。
鐵的分析揭示用于補(bǔ)血目的的超過(guò)約90％的鐵存在于上述命名為級(jí)分1的高Aw組分中，通常從至少約75wt.％到少于約150wt.％；較佳的大約80wt.％到約99wt.％；例如大約90wt.％到約99.9wt.％；大約95wt.％到約99wt.％；賦形劑存在于命名為級(jí)分2的低Aw組分中。級(jí)分1中的鐵原子可通過(guò)原子吸收光譜(AAS)作定量測(cè)定但僅通過(guò)AAS作鐵定量不能確定本發(fā)明產(chǎn)物的補(bǔ)血功能。
本發(fā)明的非葡聚糖補(bǔ)血?jiǎng)┑南嚓P(guān)特征鑒定是基于它遞送生理上可耐受的或良性來(lái)源的三價(jià)鐵Fe(III)的能力，較佳的是通過(guò)腸胃外方式遞送。該三價(jià)鐵組合物是腸胃外可接受的，它類似締合膠體的特性。締合膠體是由于弱化學(xué)結(jié)合力形成的可逆性化學(xué)結(jié)合，其中數(shù)百個(gè)分子或離子聚集形成大小約1-2000納米或更大的膠體結(jié)構(gòu)。這種三價(jià)鐵離子膠體與糖化合物相互反應(yīng)，除了由激光散射(LLS)鑒定的光活性外，在電場(chǎng)中顯示定向移動(dòng)。本文中相關(guān)的LLS特性與Tyndall作用有關(guān)，其中入射光束(I0)通過(guò)膠體，從對(duì)應(yīng)于其原來(lái)途徑的90°角穿出。如果光與淀粉、蛋白質(zhì)或其它膠體等大分子相互作用當(dāng)入射光的波長(zhǎng)接近分子的大小時(shí)才發(fā)生光散射。當(dāng)散射的波長(zhǎng)相互作用互相抵消，兩個(gè)波長(zhǎng)的光相互加強(qiáng)或者產(chǎn)生結(jié)構(gòu)性干擾時(shí)，光散射可發(fā)生破壞性干擾。LLS數(shù)據(jù)的數(shù)學(xué)評(píng)價(jià)使各種膠體的大小和形狀得到評(píng)價(jià)。例如，大小可按照單分子的分子量或多分子或離子聚集物的分子量進(jìn)行估計(jì)。在兩種情況下分子量的表達(dá)代表了這種結(jié)構(gòu)中所有原子的原子量之和。大多數(shù)聚集物或分子(如聚合物)的結(jié)構(gòu)差異是這樣的，它們以不同分子重量的頻數(shù)分布存在，典型地表達(dá)為平均分子量分布(MWD)。除了大小，膠體的形狀可能具有重要的意義。例如，如果它的形狀為細(xì)桿狀結(jié)構(gòu)、隨機(jī)盤(pán)繞結(jié)構(gòu)或球形結(jié)構(gòu)，它與其它分子或結(jié)構(gòu)的相互作用可能不同?？刹捎肔LS，包括多角度激光散射(MALLS)或低角度激光散射(LALLS)，-HPLC集成檢測(cè)儀分析與一種或多種方法聯(lián)用，來(lái)評(píng)價(jià)鐵-糖復(fù)合物。對(duì)于本發(fā)明的目的，應(yīng)理解涉及的LLS包括MALLS，后者是一種優(yōu)選的檢測(cè)器類型。本文使用LLS測(cè)定提供了一種特征鑒定正常的鐵-糖復(fù)合物的優(yōu)越的和較佳的分析方法，換句話說(shuō)，提供經(jīng)適當(dāng)控制合成產(chǎn)生的優(yōu)選的AHS，或者顯示衰退或降解產(chǎn)物的證據(jù)的方法。已經(jīng)報(bào)道了用于特征鑒定大分子結(jié)構(gòu)和締合膠體的基本數(shù)學(xué)關(guān)系式和聯(lián)有激光散射和拆射指數(shù)檢測(cè)器的HPLC的操作方法(見(jiàn)P.Wyatt，大分子的光散射和獨(dú)立特征，Light scattering and absolutecharacterization of macromolecules，Analytica Chimica Acta.(1993)2721-40；在允許的范圍內(nèi)引用作為參考)。如本文所討論的，這種技術(shù)可用于含有AHS的鐵-糖復(fù)合物。
LLS數(shù)據(jù)的獲得對(duì)于鑒定糖-鐵復(fù)合物中的AHS特別有用，特別是當(dāng)需要基準(zhǔn)分析參考標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)。LLS數(shù)據(jù)可從一批分離的樣品獲得或者LLS數(shù)據(jù)可使用持續(xù)加工含有AHS的材料隨后進(jìn)行層析分離的洗脫液流的在線分析得到。換言之，一旦產(chǎn)生糖結(jié)合三價(jià)鐵復(fù)合物并僅用LLS或聯(lián)合本文公開(kāi)的其它方法進(jìn)行檢測(cè)，可對(duì)該類藥物的分子量和形態(tài)常規(guī)驗(yàn)證生產(chǎn)連續(xù)性作批與批比較。通過(guò)使用與LLS加強(qiáng)HPLC的操作軟件整合的LLS算法，可利用AHS的粒子大小和形狀特點(diǎn)監(jiān)視AHS的生產(chǎn)過(guò)程、AHS產(chǎn)品的質(zhì)量和AHS的穩(wěn)定性。具體地說(shuō)，如本文所講授的，所謂的正常AHS(如，初級(jí)參考標(biāo)準(zhǔn)品材料或優(yōu)選的AHS)的粒子大小和空間特征和所謂的異常AHS(如降解或聚集的AHS)的結(jié)構(gòu)可由ASTRA(Wyatt TechnologyCorp.，Santa Barbara，CA)操作軟件產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)Debye圖測(cè)定。這種應(yīng)用的詳細(xì)描述見(jiàn)P.Wyatt，大分子的光散射和獨(dú)立特征，Light scattering and absolute characterizationof macromolecules，Analytica Chimica Acta.(1993)2721-40；在允許的范圍內(nèi)引用作為參考。觀察到優(yōu)選的AHS具有通常的球形并且大小為約10納米或更小，而降解的或聚集的AHS，如在優(yōu)選的AHS前從層析柱洗脫的物質(zhì)，傾向于大小超過(guò)約10納米，例如大約10到約30納米或更大，例如大約20到約30納米或更大。大小和空間形狀對(duì)于補(bǔ)血?jiǎng)┑纳砗痛x耐受性以及它們的組織分布可能是有關(guān)的因素。因此，LLS方法的應(yīng)用對(duì)于常規(guī)特征鑒定(包括生產(chǎn)后和貯藏過(guò)程中)和監(jiān)視本發(fā)明補(bǔ)血?jiǎng)┑纳a(chǎn)是優(yōu)選的。
AHS的激光散射在絕對(duì)分子量方面提供了特征性參數(shù)。然而，由于AHS不是一種單分子物質(zhì)，其行為表現(xiàn)為一種締合膠體，采用絕對(duì)分子量是特別優(yōu)選的。這種基于LLS-的分子量測(cè)定優(yōu)于其它提供所謂相對(duì)分子量的分子量評(píng)估方法。AHS的相對(duì)分子量測(cè)定不依賴于由大小和形狀決定的光與AHS的物理相互作用作基礎(chǔ)琮估計(jì)其分子量。而是，相對(duì)分子量測(cè)定依賴于大小排阻層析(SEC)(有時(shí)稱為凝膠滲透層析GPC)的標(biāo)準(zhǔn)方法。下面互換使用SEC和GPC。在GPC分析中，大分子或聚集物如AHS的有效大小(不是其分子量)決定了其洗脫體積以及何時(shí)從校準(zhǔn)的層析柱中流出。因此，將AHS通過(guò)GPC柱的洗脫和轉(zhuǎn)移，的相對(duì)位置與預(yù)期的AHS分子量的上方或下方的窄帶中的一系列校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品相比較，提供了確定含鐵復(fù)合物相對(duì)分子量的基礎(chǔ)。運(yùn)用這一概念，當(dāng)AHS從柱上洗脫時(shí)可使用濃度敏感檢測(cè)器如散射指數(shù)(RI)檢測(cè)器檢測(cè)AHS和它的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品。作為濃度敏感檢測(cè)器，RI-測(cè)定依賴于濃度(c)增加或減少的分析物(例如溶質(zhì))當(dāng)分別流經(jīng)RI-檢測(cè)器小室時(shí)光折射指數(shù)(n)的變化。在均等的時(shí)間間隔中，這種折射和濃度變化的比值記錄為dn/dc值。每個(gè)dn/dc值對(duì)于一具體的分析物或溶質(zhì)是唯一的，并且一種物質(zhì)的特征性dn/dc值不是可普遍用于任何其它具體物質(zhì)的推理值。對(duì)于已知校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品和未知分析物的洗脫可得到記錄的這種dn/dc值，并可在精確的時(shí)間間隔中記錄。在一次液相層析的總洗脫圖譜中每個(gè)dn/dc的測(cè)定被稱作一份(i)。份的數(shù)目，其洗脫時(shí)間或洗脫體積可用于說(shuō)明該份。一份的洗脫時(shí)間乘以層析柱洗脫液流速得到洗脫體積。關(guān)于體積或數(shù)量的份數(shù)記錄與這種數(shù)據(jù)記錄概念的通常意義不同。因此，對(duì)整個(gè)GPC測(cè)定過(guò)程的dn/dc(縱坐標(biāo))對(duì)份數(shù)(橫坐標(biāo))作圖，得到未知物質(zhì)和校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫圖譜，這些物質(zhì)可能相互完全無(wú)關(guān)，它們還具有適用于儀器監(jiān)測(cè)的可檢測(cè)的dn/dc質(zhì)量。
因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)GPC步驟不識(shí)別所有的大分子或膠體結(jié)構(gòu)共有的顯著的物理相互作用，存在于SFGCS、FHSC或其它類似的補(bǔ)血?jiǎng)┲械腁HS的GPC分子量評(píng)估可能易于產(chǎn)生分析誤差。而且，以RI為基礎(chǔ)的GPC方法不能特征鑒定AHS的形狀和拓?fù)涮卣鳎ɡ缃Y(jié)構(gòu)性分支。而且，使用RI-依賴的GPC方法作相對(duì)分子量評(píng)估也易遭遇數(shù)據(jù)變化，對(duì)微小的分析誤差敏感和對(duì)高密度締合膠體中物質(zhì)的尺寸變化完全不敏感。對(duì)于締合膠體，特別是FHSC和SFGCS，這些特征是重要的，因?yàn)闊o(wú)糖聚集的鐵原子可與所需的含AHS的鐵-糖復(fù)合物共存。因此，認(rèn)識(shí)到RI-為基礎(chǔ)的GPC可以合理的精確性和合理的精密度提供AHS分析物的相對(duì)分子量值是重要的，但是，該方法忽略了AHS結(jié)構(gòu)的其它重要特征。
根據(jù)熟知的光散射物理學(xué)原理，具有小尺寸的各向同性顆粒如大分子和膠體，可與光相互作用從而得以計(jì)算它們的絕對(duì)分子量和形狀。這對(duì)于包含于FHSC和SFGCS中的AHS是真實(shí)的。不象以GPC-RI為基礎(chǔ)的分析，一種膠體物質(zhì)的絕對(duì)分子量可不依賴于任何校準(zhǔn)曲線進(jìn)行測(cè)定，而該曲線卻依賴于事先建立的分級(jí)分子量標(biāo)準(zhǔn)品(M.J.Vold和R.D.Vold，1964，“膠體化學(xué)”Colloid Chemistry，Reinhold，NY；和Zapsalis，C和R.A.Beck，1985，““食品化學(xué)和營(yíng)養(yǎng)生化”(“FoodChemistry and Nutritional Biochemistry”)，第8章，John Wiley和Sons，第507-547頁(yè)，Zapsalis和Beck，1985)(在允許的范圍內(nèi)本文引用作為參考)。使一個(gè)粒子通過(guò)依賴于入射光束的強(qiáng)度(Io)的角度θ，通過(guò)光散射體積的光程距離(γs)以及該顆粒的極化度(α)建立了光散射強(qiáng)度(Iθ)。對(duì)于非極化，其光方程如下Rθ(1+cos2θ)＝Iθγs2/Io＝8π4/(1+cos2θ)方程(1)術(shù)語(yǔ)Rθ(1+cos2θ)是Rayleigh比率的基礎(chǔ)。對(duì)于顆粒大小比入射光波長(zhǎng)(IO)小的非常稀的溶液該光散射測(cè)定的延伸給出如下表達(dá)式Rθ＝2π2η02[(η-η0)/C]2/Lλ4·CM＝K*CM 方程(2)其中Rθ成為Rayleigh比率(R)；η是含有微粒物質(zhì)的溶液的折射率，η0是不含微粒物質(zhì)的溶劑的折射率；C是溶質(zhì)的每單位體積質(zhì)量濃度；M分別是分子或微粒物質(zhì)的分子量；L是Avagadro的編號(hào)；λ是光的波長(zhǎng)；K*＝2π2η02[(η-η0)/C]2/Lλ4是光常數(shù)。該表達(dá)式提供了建立Rayleigh比率(R)的基礎(chǔ)，或當(dāng)入射光的波長(zhǎng)(λ)相當(dāng)于或大于一些微粒物質(zhì)的尺寸時(shí)受到微粒散射的入射光部分。因此，通過(guò)光散射現(xiàn)象的物理學(xué)和與基于無(wú)關(guān)物質(zhì)的GPC校準(zhǔn)曲線的非相對(duì)比較，R與諸如SFGCS、FHSC和其它鐵-糖復(fù)合物中的AHS等分析物的分子量相關(guān)。不依賴于用于檢測(cè)Rayleigh比率(R)的儀器檢測(cè)器幾何學(xué)，當(dāng)入射光(IO)與微粒相互作用，一種關(guān)系成立R＝K*CM方程(3)與上文詳述的流動(dòng)洗脫液測(cè)定概念相一致，這里獲得以GPC-RI為基礎(chǔ)的系統(tǒng)的dn/dc值，對(duì)于每份，換言之“i”獲得Rayleigh比率(R)的測(cè)定值Ri，和Rayleigh比率僅僅是每份濃度(Ci)、分子量(Mi)和光常數(shù)(K*)的乘積或，Ri＝K*CiMI方程(4)光散射還使得能特征鑒定鐵-糖復(fù)合物中AHS的結(jié)構(gòu)一致性，其基礎(chǔ)是一些前向角θ的散射光和在其補(bǔ)角180-θ(Iθ/I180-θ)的散射光之間的不對(duì)稱比率。在所有可能的光散射角中，約45°和135°知道指導(dǎo)性參考點(diǎn)的作用。當(dāng)建立了Iθ/I180-θ(縱坐標(biāo))對(duì)L/λ(橫坐標(biāo))的圖時(shí)，球形、桿形和隨機(jī)盤(pán)繞的結(jié)構(gòu)不對(duì)稱性不難通過(guò)參考Zapsalis和Beck，1985，535頁(yè)的方法測(cè)定。
如果AHS是基本分離的，例如上述的級(jí)分1，它可(a)批量生產(chǎn)獲得或(b)以小的分析量獲得，通常小的分析量見(jiàn)于液相層析洗脫液流中。在兩種情況下，LLS方法提供了用于在該類藥物中建立鐵-糖復(fù)合物的常規(guī)參考標(biāo)準(zhǔn)品的優(yōu)選分析方法。
使用本公開(kāi)講授的方法生產(chǎn)純化的AHS或鐵-糖復(fù)合物的能力，使之可以全面地分析和特征鑒定，包括確定其膠體和分子特性。用于AHS，具體是SFGCS和FHSC的適合的分析和特征鑒定方法包括紫外(UV)分光光度術(shù)、可見(jiàn)光(VIS)分光光度術(shù)和聯(lián)合的UV-VIS分光光度術(shù)，包括光電二極管陣列(PDA)方法、紅外光譜學(xué)(IR)、電子自旋共振(ESR)、脈沖極譜法、能量分散X-射線分析(EDS)、圓二色性(CD)和旋光色散(ORD)、熒光分光光度術(shù)、旋光測(cè)定、熱分解和熱分解質(zhì)譜分析、核磁共振分光術(shù)、差示掃描熱量測(cè)定(DSC)、液相色譜結(jié)合質(zhì)譜分析(LG-GC)、基質(zhì)輔助的激光解吸/電離質(zhì)譜測(cè)定(MALDI-MS)技術(shù)，分析使用放射性同位素包括放射性鐵、補(bǔ)血物質(zhì)的抗體、毛細(xì)管電泳和誘導(dǎo)-偶聯(lián)的等離子體光譜測(cè)定、原子吸收分析、電化學(xué)分析，以及特異性pH貯藏和穩(wěn)定性研究和含糖類產(chǎn)品AHS的靶向糖苷-降解分析。在MALDI-MS中，激光用于電離大分子分析物并釋放樣品基質(zhì)中的離子進(jìn)入真空系統(tǒng)。該方法結(jié)合質(zhì)譜分析用于測(cè)定多種大分子的質(zhì)量。
另外，分離AHS成為至少兩個(gè)部分，級(jí)分1(高Aw部分)，和級(jí)分2(低Aw組分)的能力，還允許對(duì)濃縮于級(jí)分2中的賦形劑作獨(dú)立分析。有差別的賦形劑指紋可用于特征鑒定AHS并用于產(chǎn)品鑒定和監(jiān)測(cè)質(zhì)量控制及保險(xiǎn)。典型的或期望的賦形劑的產(chǎn)生和驗(yàn)證支持生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化和鑒控。這改善了給予補(bǔ)血?jiǎng)┯糜谂R床有利于患者的可能性。因?yàn)橘x形劑與典型商品化腸胃外給藥組合物總固體的75％以上，賦形劑的驗(yàn)證和分析可能是一件重要的事情。而且，因?yàn)橐阎訜崽幚硖穷悤?huì)產(chǎn)生可鑒定識(shí)別的化學(xué)標(biāo)記，反映它們的加工歷程，這些以及補(bǔ)血?jiǎng)┥a(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的剩余反應(yīng)物和副產(chǎn)物(為了本發(fā)明的目的，所有這些物質(zhì)通常都包括于術(shù)語(yǔ)“賦形劑”中)可用于監(jiān)測(cè)和特征鑒定補(bǔ)血?jiǎng)┖蜕a(chǎn)它們的方法。
三價(jià)鐵相互作用或存在于補(bǔ)血?jiǎng)╄F-糖復(fù)合物中至少有3種可能的表現(xiàn)形式。首先，優(yōu)選的主要藥劑，即AHS，表現(xiàn)為一種締合膠體并且是所需的鐵-糖遞送載體。其次，高分子量聚集物可由AHS產(chǎn)生并且它們也可被檢測(cè)。第三，鐵可能與合成反應(yīng)步驟的剩余糖類反應(yīng)物和/或副產(chǎn)物形成復(fù)合物而存在。這種形式的鐵可見(jiàn)于級(jí)分2中的親水性賦形劑。監(jiān)測(cè)腸胃外給藥的組合物以及級(jí)分2的(a)鐵含量，(b)糖類反應(yīng)物的剩余量，和(c)熱依賴性合成反應(yīng)副產(chǎn)物的證據(jù)是特別優(yōu)選的。監(jiān)測(cè)這類分析物特別優(yōu)選的方法包括使用附有折射指數(shù)(RI)測(cè)定的液和在線洗脫液流檢測(cè)相色譜分析，使用至少一種如下方法激光散射(LLS)、電化學(xué)檢測(cè)(ECD)、光電二極管陣列(PDA)為基礎(chǔ)的UV-VIS分光光度術(shù)、紅外(IR)分光術(shù)和液相色譜結(jié)合質(zhì)譜分析(LC-MS)、以及任選的，上述一種或多種分析和特征鑒定方法。而RI是一種允許定量測(cè)定賦形劑糖類的濃度敏感檢測(cè)儀，EDC檢測(cè)器能對(duì)含金屬和不含金屬的具有特征性電化學(xué)氧化-還原電勢(shì)的化合物反應(yīng)以及，基于PDA的UV-VIS分析除低分子量復(fù)合性物質(zhì)外可對(duì)加熱產(chǎn)生的糖類衍生物進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明的方法還包括特征鑒定AHS及其共存的賦形劑的方法。對(duì)使用上述聚合的層析柱預(yù)先制備的含有AHS的級(jí)分1的樣品使用HPLC，與HPLC洗脫液水流RI和LLS雙重檢測(cè)器相連，產(chǎn)生的結(jié)果描述于圖1中。該圖顯示了存在于級(jí)分1中AHS(它不含賦形劑)的分離和純化的層析特征。這種HPLC洗脫液特征對(duì)于生產(chǎn)含有AHS的補(bǔ)血?jiǎng)┦莾?yōu)選的結(jié)果，例如，一個(gè)產(chǎn)品以密封的玻璃安瓿中釋放。圖2描述了從提供級(jí)分1的同一樣品中得到的級(jí)分2中4種賦形劑的層析特征。在這一實(shí)驗(yàn)中，將級(jí)分1的少量AHS有目的地加入級(jí)分2中，這樣可觀察到賦形劑對(duì)于AHS的相對(duì)位置。在圖2和圖3中值得注意的是RI檢測(cè)器可更好地監(jiān)測(cè)賦形劑，因?yàn)镽I具有濃度敏感特性而LLS檢測(cè)器是質(zhì)量敏感的并對(duì)AHS的反應(yīng)比率對(duì)賦形劑碳水化合物好。這些結(jié)果清晰地顯示于圖2中，其中加入了痕量的純化AHS作為內(nèi)部基準(zhǔn)用于賦形劑洗脫過(guò)程的相對(duì)測(cè)定。在這種情況下RI沒(méi)有感覺(jué)到任何純化的AHS出現(xiàn)，而LLS的信號(hào)記錄到作為一個(gè)分析物質(zhì)AHS的存在。圖3進(jìn)一步描述了使用聚合的層析柱，LLS和RI-為基礎(chǔ)的HPLC方法可用于從其賦形劑分析地分離出AHS。也就是，將AHS成分分離進(jìn)入一個(gè)高Aw的流體動(dòng)力體積中，而同時(shí)最初伴隨AHS的共存的賦形劑基本上全部分離進(jìn)入液體動(dòng)力層析柱體積中，洗脫于AHS洗脫之后。這些結(jié)果與圖1中的結(jié)果相一致，初級(jí)參考標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)先被分離成為一個(gè)分開(kāi)的實(shí)體，而圖3顯示了初始的多成分組合物(AHS和賦形劑)的分離結(jié)果。這證實(shí)本發(fā)明的方法可用于監(jiān)測(cè)補(bǔ)血?jiǎng)┙M合物如那些商品化生產(chǎn)的含有AHS和賦形劑的組合物。
可使用至少裝配有LLS作為一種監(jiān)測(cè)器模式的HPLC分析來(lái)監(jiān)測(cè)鐵糖復(fù)合物中AHS的不穩(wěn)定和老化以及生產(chǎn)的變化性等狀。另外，LLS-為基礎(chǔ)的HPLC與一種濃度敏感檢測(cè)器(如RI)連接，可用于監(jiān)測(cè)AHS的標(biāo)稱層析峰特征中的結(jié)構(gòu)性變化。這種變化可在圖4中的層析圖案中看到，特別是當(dāng)與圖1初級(jí)參考標(biāo)準(zhǔn)品或圖3分離的混合物產(chǎn)生的變化作比較時(shí)類似的，圖5顯示了在另一個(gè)生產(chǎn)商的補(bǔ)血?jiǎng)┊a(chǎn)品中存在一個(gè)改變的AHS峰。應(yīng)注意不同的檢測(cè)器可提供不同的信息，例如，LLS-層析檢測(cè)器和濃度敏感的RI檢測(cè)器。濃度敏感的RI-檢測(cè)器能感覺(jué)和記錄分析物濃度而不是它的質(zhì)量，質(zhì)量是由LLS-檢測(cè)器獨(dú)立記錄的。這樣，LLS-為基礎(chǔ)的檢測(cè)器可感覺(jué)到由于AHS的復(fù)合或交聯(lián)而形成的質(zhì)量增加的物質(zhì)，它洗脫在AHS初級(jí)參考標(biāo)準(zhǔn)品之前。如圖1所描述由于AHS是所需要的補(bǔ)血物質(zhì)，而圖4和圖5中顯示的物質(zhì)代表甚至更高的分子量的副產(chǎn)物，該副產(chǎn)物被認(rèn)為是由AHS產(chǎn)生。此新峰的出現(xiàn)是優(yōu)選的AHS的定量消費(fèi)而致。
本發(fā)明的方法可用于監(jiān)測(cè)含AHS補(bǔ)血?jiǎng)┑馁A藏穩(wěn)定性。與大多數(shù)有機(jī)分子相似，AHS是遭遇結(jié)構(gòu)性不穩(wěn)定，因此它可降解或轉(zhuǎn)化(即使在用于補(bǔ)血?jiǎng)┑拿芊獾牟Ａнf送安瓿中)產(chǎn)生新的物質(zhì)。AHS的這種結(jié)構(gòu)性轉(zhuǎn)化是依賴于時(shí)間的，也可為溫度所促進(jìn)。隨時(shí)間的變化AHS結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的證據(jù)在一系列的LLS和RI-為基礎(chǔ)的HPLC圖譜中是明顯的，該圖譜是糖鐵復(fù)合物生產(chǎn)后，在室溫黑暗環(huán)境中于密封的玻璃遞送安瓿中貯存6，12，22和25個(gè)月的監(jiān)測(cè)圖譜。這些產(chǎn)物有關(guān)的層析圖譜分別對(duì)應(yīng)于圖6、7、8和9。當(dāng)比較這些圖中不對(duì)稱的AHS峰與優(yōu)選的和圖1中AHS顯示的對(duì)稱的主要參考標(biāo)準(zhǔn)峰時(shí)，結(jié)構(gòu)變化的證據(jù)是顯然的。AHS降解顯示的并由LLS檢測(cè)到的新的實(shí)體，在主要參考標(biāo)準(zhǔn)或AHS之前從層析柱洗脫，這也可在圖中看到。此新的實(shí)體具有非常致密的高分子量結(jié)構(gòu)、概念上類似于“BBot”的特性。根據(jù)采用ASTRA-品牌軟件和LLS設(shè)備通過(guò)處理光散射數(shù)據(jù)產(chǎn)生的Debye圖可確定這些特征，參考前面所述(Wyatt Technology Corp.，SantaBarbara，CA)，和1993 Analytica Chimica Acta雜志參考資料所描述的方法和計(jì)算，也參考上文。Debye圖使我們得到了特異性LLS數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)與均方根(rms)或回轉(zhuǎn)半徑(Rg)測(cè)定值結(jié)合，使得能測(cè)定分子種類或膠體的大小。對(duì)于圖6-9，表示微粒直徑大小rms-值給出一個(gè)等于或大于20nm的平均值。圖1中AHS層析特征相應(yīng)的rms-值小于或等于10nm；恰好低于LLS的實(shí)際測(cè)定限度。因此，本發(fā)明的方法可用于監(jiān)測(cè)含有AHS補(bǔ)血?jiǎng)┙M合物的質(zhì)量和貯藏穩(wěn)定性。
可監(jiān)控商品化生產(chǎn)補(bǔ)血?jiǎng)〢HS和賦形劑的生產(chǎn)的過(guò)程；在生產(chǎn)結(jié)束時(shí)，如包裝時(shí)；和生產(chǎn)后，如該產(chǎn)品被貯存。類似的，對(duì)賦形劑分離后的含AHS的鐵-糖復(fù)合物組合物，這種組合物的水性組合物形式，或凍干干燥后，也可以相同的方式進(jìn)行監(jiān)控。對(duì)含AHS的鐵-糖復(fù)合物的監(jiān)測(cè)，不僅在生產(chǎn)過(guò)程中，而且在生產(chǎn)后的貯存期，例如大約1周后，中等貯存期在生產(chǎn)后約6個(gè)月的到長(zhǎng)至約5年或更長(zhǎng)的時(shí)間；延長(zhǎng)貯存可大約1年到約5年；或大約1年到約3年。在每一個(gè)例子中，可通過(guò)其特性與主要參考標(biāo)準(zhǔn)的比較來(lái)監(jiān)控AHS，作比較的特性包括上述各種分析特性，如使用HPLC聯(lián)合LLS和RI得到的層析特征。
如上所述，由于最初存在的極高分子量的AHS的降解或改變產(chǎn)生了較小的LLS-可檢測(cè)的峰，在圖6-9中鑒定為AHS聚集峰(AHSAP)。根據(jù)光散射，導(dǎo)致這一特征性AHSAP的該物質(zhì)分子量范圍大約350,000到約3,000,000道爾頓或更多，但是也可用超速離心和其它方法確定該物質(zhì)的高分子量。據(jù)認(rèn)為AHSAP與AHS合成或生產(chǎn)過(guò)程中正常產(chǎn)生的賦形劑無(wú)關(guān)。而是AHSAP出現(xiàn)與一種老化的現(xiàn)象有關(guān)，但它也可能是顯著背離優(yōu)選生產(chǎn)條件的結(jié)果。本發(fā)明的方法可用于鑒定腸胃外給藥的補(bǔ)血產(chǎn)物中AHSAP的數(shù)量耐受水平?？赦^鐵-糖復(fù)合物生產(chǎn)(AHSAPTAM)后任何時(shí)間發(fā)生和檢測(cè)到的AHSAP，與暴露于確定條件的補(bǔ)血?jiǎng)┵A藏后檢測(cè)到的AHSAP總量HPLC信號(hào)(AHSAPTOTAL)進(jìn)行比較。通過(guò)實(shí)施例可知，貯藏期可包括任何方便的時(shí)間期限，例如約6個(gè)月到約10年或更長(zhǎng)；或者約1年到約8年；或者約1-5年。例如，如果采用5年期限，在第五年時(shí)AHSAP5yr TOTAL將提供一種基礎(chǔ)以確定補(bǔ)血?jiǎng)┽尫藕?通過(guò)其特征的測(cè)定)可接受的降解或改變的最大限度。換言之，5年過(guò)去后，AHS可能已衰變?yōu)樗幬飳W(xué)無(wú)用的鐵聚集體，并且其殘余成分與用于腸胃外使用的最初投放市場(chǎng)的鐵-糖復(fù)合物的實(shí)施例明顯不同。因此，定量測(cè)定任何時(shí)間的AHSAPTAM直到AHSAP5yr TOTAL，表達(dá)為發(fā)生率，[AHSAPTAM]/[AHSAP5yr TOTAL]，可提供一個(gè)時(shí)間依賴性穩(wěn)定性比值或指數(shù)，用于測(cè)量補(bǔ)血?jiǎng)┑馁|(zhì)量和補(bǔ)血?jiǎng)┊a(chǎn)品中保持完整的AHS的實(shí)際百分比率組成。目前沒(méi)有這類標(biāo)準(zhǔn)化方法來(lái)定量說(shuō)明鐵糖復(fù)合物的老化和降解，一旦它們投放進(jìn)入市場(chǎng)。應(yīng)當(dāng)理解該發(fā)生率不僅限于5年時(shí)間間隔，而是上文提及的，可采用所選擇的任何便利的時(shí)間間隔。它可用于測(cè)定確定條件下鐵-糖復(fù)合物的老化和穩(wěn)定性，例如，當(dāng)與鐵而不是鐵-糖復(fù)合物，例如游離的或未結(jié)合的鐵或鐵聚集體相比較時(shí)，50％的鐵-糖復(fù)合物保持了生產(chǎn)時(shí)或投放進(jìn)入市場(chǎng)時(shí)它的最初形式，因此可以測(cè)定鐵-糖復(fù)合物的半衰期。當(dāng)[AHSAPTAM]/[AHSAP5yr TOTAL]比值接近約0.5時(shí)，該0.5的比值可作為藥物動(dòng)力學(xué)指數(shù)和保證確保制品具有最初投放市場(chǎng)時(shí)，完整的鐵-糖復(fù)合物的50％量。雖然這里用于定量測(cè)量補(bǔ)血?jiǎng)┵A存期的基礎(chǔ)引用了含AHS的鐵絡(luò)合物殘存量50％值，但高于50％的實(shí)用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)更需要；作為實(shí)際應(yīng)用，大約0.5到約0.98；較佳為約0.75到約0.95；更佳為約0.80到約0.99；例如，任何介于約0.5到小于或等于約1.0的單一值(并且相應(yīng)的，對(duì)于鐵而不是非鐵-糖復(fù)合物，AHS，該值從0.02到小于約0.5；大約0.05到約0.25；和大約0.01到約0.20；例如，任何從等于或大于約0到小于或等于約0.5的單一值)可由標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定機(jī)構(gòu)或生產(chǎn)商建立。這種建立的[AHSAPTAM]/[AHSAP5yr TOTAL]比值對(duì)于指導(dǎo)、保證或標(biāo)準(zhǔn)化這種補(bǔ)血?jiǎng)┑呐R床功效、性能和安全性特別有用。在本發(fā)明之前，通過(guò)使用通常應(yīng)用于藥物的標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)指定鐵-糖復(fù)合物的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)品，尚沒(méi)有物質(zhì)基礎(chǔ)。如本文所描述，HPLC層析方法，優(yōu)選包括LLS和RI-為基礎(chǔ)的檢測(cè)器的使用使這種指標(biāo)得以實(shí)施。而且，分離存在于這些鐵-復(fù)合物中的AHS的分離能力，加強(qiáng)了該方法的實(shí)際應(yīng)用。
由于被稱做鐵-糖復(fù)合物的主要參考標(biāo)準(zhǔn)的AHS，在合成或生產(chǎn)后馬上可能開(kāi)始降解，它也可用于建立次要參考標(biāo)準(zhǔn)品。在實(shí)際應(yīng)用中，次要參考標(biāo)準(zhǔn)品是基于補(bǔ)血活性物質(zhì)衍生的鐵聚集體的相對(duì)產(chǎn)生量與在設(shè)定條件下隨著時(shí)間可能由補(bǔ)血活性物質(zhì)釋放的鐵聚集體的總量作比較。校正鐵聚集體的測(cè)定數(shù)據(jù)以建立這種補(bǔ)血活性物質(zhì)完整性和穩(wěn)定性的基準(zhǔn)，因?yàn)榭蓹z測(cè)的鐵聚集體的水平是消耗初級(jí)參考標(biāo)準(zhǔn)品形成的。鐵-糖復(fù)合物生產(chǎn)后或商品投放后的[AHSAPTAM]/[AHSAP5yr TOTAL]比值對(duì)時(shí)間作圖，提供了產(chǎn)品貯藏穩(wěn)定性的指標(biāo)。達(dá)到任意的或性能相關(guān)的比值，如0.5所需要的時(shí)間，基于[AHSAPTAM]/[AHSAP5yr TOTAL]的HPLC信號(hào)系數(shù)，可能是特別有用的，雖然可選擇任一比值作為系數(shù)以確保補(bǔ)血活性物質(zhì)產(chǎn)品的質(zhì)量。不論選擇怎樣的比值作為最低限度的可接受的標(biāo)準(zhǔn)以監(jiān)測(cè)臨床功效，基于應(yīng)用歷史的功用和安全性將為次級(jí)參考標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)定組成將標(biāo)準(zhǔn)。可制備這樣的主要參考標(biāo)準(zhǔn)和次要參考標(biāo)準(zhǔn)品作為實(shí)用的分析標(biāo)準(zhǔn)品用于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部和實(shí)驗(yàn)室之間的監(jiān)控或生產(chǎn)行為的監(jiān)控，以及作為產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)和產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化的工具。
包含初級(jí)參考標(biāo)準(zhǔn)品的分離的含AHS組合物級(jí)分1，可將其干燥用于延期貯存和重建用于腸胃外使用和進(jìn)一步的研究。
為了改進(jìn)分析性特征鑒定的目的而干燥和/或重建的AHS可被貯存，例如，為了建立更加明確的化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，以及保存AHS樣品用于將來(lái)的參考。分離和凍干的AHS的貯存是重要的因?yàn)殍F-糖復(fù)合物合成后易于不穩(wěn)定并分解，特別是當(dāng)這種復(fù)合物存在于稀釋液或液體特別是水性載體中時(shí)。相反，干燥的AHS可貯存一段長(zhǎng)時(shí)間，較佳的在沒(méi)有濕度的環(huán)境中，包括密封的容器中。另外，當(dāng)需要使用時(shí)，干燥而穩(wěn)定的復(fù)合物可方便地運(yùn)輸和重建，因此進(jìn)一步延長(zhǎng)其穩(wěn)定性直到使用前。例如，干燥的AHS可密封在防潮的容器中如金屬箔袋或玻璃容器中，和貯存于環(huán)境溫度(約20℃到約25℃)或低于環(huán)境溫度一段長(zhǎng)時(shí)間。例如，生產(chǎn)后立即貯存干燥的復(fù)合物，例如大約1周，以及生產(chǎn)后約6個(gè)月的中度貯存期到長(zhǎng)達(dá)約5年或更長(zhǎng)的時(shí)間；延長(zhǎng)貯存可大約1年到約5年；或大約1年到約3年。在這種生產(chǎn)后貯藏的過(guò)程中，可通過(guò)重建的樣品與初級(jí)參考標(biāo)準(zhǔn)品的分析性特性(如使用HPLC結(jié)合LLS和RI得到的層析特征)的比較，監(jiān)測(cè)AHS的穩(wěn)定性。
分離的AHS(級(jí)分1)，當(dāng)最初制成時(shí)或在制成后任何具體的時(shí)間，可將其凍干和重建以易于貯存和運(yùn)輸以及用于進(jìn)一步的研究。作為凍干的一個(gè)先決條件，需要如前所述，宜將作為鐵-糖復(fù)合物存在的鐵-遞送載體或AHS，從其共存的親水性或其它賦形劑分離。這些賦形劑包括過(guò)量的合成反應(yīng)物、反應(yīng)副產(chǎn)物、多余的葡聚糖、聚葡聚糖、糖內(nèi)酯、降解的副產(chǎn)物和其它物質(zhì)。在一個(gè)較佳的實(shí)施例中，AHS包括級(jí)分1被分離成主要參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)形式。由于從共存的親水性物質(zhì)分離出AHS，其中存在AHS的組分或組合物的Aw值提高；換言之，含AHS組分的Aw值接近1.0。
凍干技術(shù)在食品加工工業(yè)中是熟知的并也用于藥物的干燥。該技術(shù)通常應(yīng)用于干燥潮濕的組合物，雖然干燥單獨(dú)或混有水的分散或溶解于其它的稀釋液或溶液中的物質(zhì)或溶質(zhì)是可行的，它們是易于凍干的。通常，將組合物冷凍到明顯低于0℃的溫度并受經(jīng)受低的絕對(duì)壓力，換言之，高真空環(huán)境。小心加熱以使冰生華。該過(guò)程用于保護(hù)熱敏物質(zhì)不受熱的破壞以及防止干燥過(guò)程中多孔材料的收縮，這樣它們可以快速而充分地復(fù)水。本發(fā)明提供了用于分離和凍干或凍干濃縮用作腸胃外鐵遞送載體而生產(chǎn)的補(bǔ)血活性物質(zhì)的方法。
在凍干過(guò)程中，存在于凍結(jié)組合物中的冰之間的不平衡變化狀態(tài)稱為產(chǎn)物冰，和系統(tǒng)壓力以及溫度條件。水蒸氣從產(chǎn)物冰的分界面移去僅發(fā)生在若該不平衡狀態(tài)存在和產(chǎn)物冰比該系統(tǒng)其它部分處于更高的能量水平時(shí)。設(shè)計(jì)的凍干設(shè)備應(yīng)提供用于給定產(chǎn)物的影響和保持較佳的溫度和壓力差的一組控制條件，從而使產(chǎn)物在最短的時(shí)間內(nèi)干燥。
通過(guò)最大限度的加熱(可加熱產(chǎn)品而不會(huì)導(dǎo)致固體變成液體)，確定不平衡的限度(稱做融化-反饋)。由于產(chǎn)品干燥從最接近于最低壓力區(qū)域的表面開(kāi)始，即使在凍干室壓力低時(shí)也可發(fā)生這種不平衡，這個(gè)表面被稱做冰分界面。該分界面上待干燥的固體組合物或微粒的排列，對(duì)蒸氣從下面釋放產(chǎn)生阻力，因此提高了生產(chǎn)壓力和溫度。為了避免融化-反饋，施加于產(chǎn)品的熱能應(yīng)密切接近，較佳地不超過(guò)蒸氣離開(kāi)產(chǎn)品的速率。影響該方法的另一個(gè)因素是施加于產(chǎn)物冰的熱能的速度(和通過(guò)移去蒸氣帶走熱能的速度)，蒸氣通過(guò)冷凝器冷卻系統(tǒng)除去。通過(guò)保持低的冷凝溫度，水蒸氣變成冰粒被捕獲并有效地從系統(tǒng)中除去，因此減少和簡(jiǎn)化了真空抽吸的需要。凍干室中的空氣和其它不能冷凝的分子，以及位于產(chǎn)物冰和冷凝器之間的機(jī)械性障礙，對(duì)蒸氣向冷凝器的移動(dòng)提供了額外的阻力。
通常認(rèn)為4種條件對(duì)凍干是必須的。這些加工條件如下(1)將產(chǎn)品在低于其低共溶點(diǎn)或玻璃轉(zhuǎn)變溫度下凍結(jié)成固體；(2)提供能夠達(dá)到比冰分界面溫度低約20℃的冷凝表面，通常低于約-40℃；(3)真空系統(tǒng)能夠抽真空達(dá)到5到約65毫米汞柱的絕對(duì)壓力(約0.5到約10Pa；較佳的1到約8Pa)；和，(4)將熱源輸入到產(chǎn)品中，控制在約-60℃到約+65℃，較佳約-40℃到約+65℃；更佳約-30℃到約+55℃；最佳約-25℃到約+25℃；通常使用約20℃的溫度提供驅(qū)使水從固體轉(zhuǎn)變?yōu)闅怏w狀態(tài)所需的熱量(即，汽化熱)。設(shè)計(jì)用于滿足這四個(gè)條件的儀器的物理排列有很大不同，包括單個(gè)燒瓶冷凍干燥器和批量處理冷凍干燥裝置。當(dāng)需要精確控制凍干過(guò)程時(shí)凍干加工通常以批為基礎(chǔ)在凍干室中進(jìn)行，例如在化學(xué)和制藥工業(yè)中那樣。這使操作者能更加精確地控制產(chǎn)品升華過(guò)程中發(fā)生的事情。適當(dāng)?shù)膬x器描述見(jiàn)，例如，U.S.6,122,836(轉(zhuǎn)讓給Virtis Division of S.P.Industries，Inc.，N.Y.)和本文引用的參考文獻(xiàn)，以及Zapsalis和Beck，“食品化學(xué)和營(yíng)養(yǎng)生化”(“Food Chemistry and NutritionalBiochemistry”)，1985，第1章，23-26頁(yè)(本發(fā)明在允許的范圍將其全部引用作為參考)。其它適合的商業(yè)儀器和加工條件詳細(xì)描述見(jiàn)題目為“凍干”(Freeze Drying)的章節(jié)，van Nostrand’s Scientific Encyclopedia，第8版，1338-1342頁(yè)，1995(本發(fā)明在允許的范圍引用作為參考)。
凍干加工的效果部分由水的三點(diǎn)曲線所顯示，其中在溫度低于0℃、壓力小于4.58Torr(610.5帕斯卡)時(shí)，冰形式的固體水直接轉(zhuǎn)化為氣相水。有效凍干可在約10毫米到約200毫米汞柱；較佳約40到100毫米；更佳約40到80毫米的壓力(空真)下進(jìn)行，通常使用的壓力約為60毫米除去。以(a)存在于水合物理基質(zhì)中的冰或(b)冰凍單純水溶液產(chǎn)生的冰存在的水分子，理想地得到一種不含水的干燥物理基質(zhì)剩余物或一些所需的不含水的溶質(zhì)剩余物。然而，其中存在于冰系統(tǒng)中的親水性溶質(zhì)、膠體、混懸物或分散的物質(zhì)，如糖類賦形劑，隨著冰的凍干加工它們可在冰結(jié)構(gòu)中濃縮，并且溶劑和稀釋劑水的體積下降。由于隨著凍干加工這些物質(zhì)變得更濃，這逐漸降低了結(jié)凍水系統(tǒng)的冰凍溫度。隨著該狀況的繼續(xù)，溶質(zhì)與水相互作用的綜合特性也可能提高超過(guò)共熔點(diǎn)，導(dǎo)致或引起融化-反饋現(xiàn)象。這與本發(fā)明的較佳的凍干方法相反，在本發(fā)明的方法中冰伴隨著需要的溶質(zhì)AHS保存于凝固狀態(tài)，基本上不會(huì)受到含有難以去除的水的親水性溶質(zhì)所破壞，直到基本上所有的與AHS結(jié)合的水通過(guò)升華除去。
完成了優(yōu)選的AHS的凍干加工后，作為其有效部分得到了高Aw組分(級(jí)分1)其含有最初存在于樣品中的基本上全部的鐵-糖復(fù)合物，這有利于它在平板上、容器壁或某些其它三維支架(對(duì)凍結(jié)組分保證有高的表面積與體積比)上快速形成凍結(jié)殼。凍結(jié)殼的出現(xiàn)越有效，凍干產(chǎn)品的質(zhì)量越好。通常在約-160℃到約-10℃的溫度下進(jìn)行冰凍；較佳約-80℃到約-20℃；例如約-60℃。當(dāng)AHS存在于冰結(jié)的組合物中時(shí)，其中水顯示的Aw值接近1.0、壓力低于約4.58Torr(610.5Pa)如所述這種導(dǎo)致水蒸氣壓力和溫度增加的條件，可能導(dǎo)致的水蒸氣壓力增加和有效的升華。通過(guò)保持凍結(jié)的AHS周圍的壓力低于剩余的冰表面上的蒸汽壓力，從冰除去水，用真空泵除去水蒸氣并在冷卻的表面凝縮，表面溫度保持為約-120℃到約-25℃；較佳的約-80℃到約-50℃；通常為-60℃。特別是，預(yù)先分離的AHS的高Aw值有利于整個(gè)凍結(jié)產(chǎn)品升華前沿的遷移率。當(dāng)AHS或鐵-糖復(fù)合物不除去賦形劑特別是親水性賦形劑時(shí)，凍干過(guò)程中AHS易遭受融化-反饋。換言之，親水性物質(zhì)的存在，導(dǎo)致水被AHS組合物中這種親水性物質(zhì)充分地結(jié)合或保留。如果使用較高的溫度增加蒸氣壓以努力除去這種結(jié)合水，這還可能產(chǎn)生引起冰相溶解的不良結(jié)果，從而破壞了凍干。因此，宜在凍干前從AHS除去或分離所有的或基本上所有的親水性賦形劑較佳除去95％以上的最初存在的賦形劑；更佳的除去約98％；；更更佳的除去約99％；最佳除去約99.9％以上；例如，凍干前將AHS與親水性賦形劑分離至這些賦形劑以痕量存在的程度。
為了本發(fā)明的目的，干燥的AHS剩余物含有藥學(xué)上有用的鐵-糖復(fù)合物。因此，分離和干燥的AHS適用于進(jìn)一步的分析研究，或任選地用于重建，以滿足其它研究分析和藥物用途。本發(fā)明的方法通常適用于干燥AHS，將AHS中的賦形劑基本上除去，即除去約85％到至少約99％；較佳的除去約90％到至少約97％；最佳的除去約92％到至少約95％的水。應(yīng)該理解最初存在于分離的AHS中的少量水可結(jié)合或強(qiáng)有力地結(jié)合于AHS，試圖除去這些結(jié)合水可能引起降解AHS的不必要的危險(xiǎn)。凍干后和重建的AHS樣品可用于LLS和RI為基礎(chǔ)的HPLC分析，見(jiàn)圖10說(shuō)明。該圖顯示的層析特征基本上與圖1中的特征一致，圖1中其用作初級(jí)參考標(biāo)準(zhǔn)品。而且，圖1和圖10中描述的分析物與圖3中見(jiàn)到的保留有賦形劑的AHS基本上相同。
一種具有HPLC圖譜的補(bǔ)血?jiǎng)┎牧?，該材料與圖1或圖10中的初級(jí)參考標(biāo)準(zhǔn)品不同的，是一種在具有罕見(jiàn)形態(tài)的凍干產(chǎn)品中還顯示AHSAP的證據(jù)的補(bǔ)血?jiǎng)．?dāng)在HPLC研究的過(guò)程中觀察到AHSAP作為AHS的一部分存在時(shí)，凍干的AHS經(jīng)100倍放大和更大放大的顯微鏡外觀可能直觀地描述為燈芯絨型(corduroy-type)結(jié)構(gòu)。它均勻的顯示三價(jià)鐵的紅-棕色的平行帶或條痕，其間隙為窄的碳水化合物平板的透明帶所填充。該三價(jià)鐵紅棕色的平行帶具有獨(dú)特的圓柱形狀、相互平行、直徑至少是長(zhǎng)的平面性透明碳水化合物平板的顯示厚度的2倍，這種平板反復(fù)填充于它們之間。當(dāng)層析圖譜的表現(xiàn)如同圖4-9中所見(jiàn)，該觀察到的顯微鏡形式具有結(jié)構(gòu)分析的重要性，與HPLC光散射數(shù)據(jù)相符。當(dāng)所需的新鮮制備的AHS符合鐵-糖復(fù)合物的初級(jí)參考標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，其凍干產(chǎn)物的形態(tài)特征性不同在于缺少圓柱形結(jié)構(gòu)。
凍干產(chǎn)品在重建用于分析或應(yīng)用前，其附腐可保存于真空或任何惰性氣體中，包括，例如氮、氬和氦(以及不與凍干產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)的任何氣體)中。并且，因?yàn)閱为?dú)的凍干加工不損害鐵-糖復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，使用該方法對(duì)于保存這些補(bǔ)血制劑不同時(shí)間是有價(jià)值的，使得當(dāng)進(jìn)行凍干時(shí)在給定的時(shí)間點(diǎn)可以文件記錄補(bǔ)血?jiǎng)┪镔|(zhì)的存在。這提供了一種用于貯存和證明產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程和質(zhì)量的方法。在其它情況下，凍干可特異性地用于穩(wěn)定和貯存這些補(bǔ)血?jiǎng)┙M合物的主要和/或次要參考標(biāo)準(zhǔn)品。并且，適當(dāng)?shù)刂苽浜捅４娴膬龈葾HS可安全地貯存直到需要時(shí)，幾乎沒(méi)有產(chǎn)品明顯降解的風(fēng)險(xiǎn)。而且，這種形式的產(chǎn)品可便利地運(yùn)輸?shù)降乩砦恢眠b遠(yuǎn)的地區(qū)和便于貯存直至需要，在需要時(shí)重建補(bǔ)血?jiǎng)┯糜谀c胃外使用不難完成。例如，根據(jù)本發(fā)明制備的凍干產(chǎn)品可貯存在密封的玻璃或適當(dāng)保護(hù)的金屬容器中，較佳地頂部復(fù)蓋以基本不含濕氣的惰性氣體。或者，這種產(chǎn)品可以適合重建為一個(gè)腸胃外劑量的數(shù)量密封于金屬箔囊中。制備鐵-糖復(fù)合物以生產(chǎn)腸胃外給藥的補(bǔ)血?jiǎng)?fù)合物用于遞送鐵給需要的人或動(dòng)物。這些鐵-糖復(fù)合物的生產(chǎn)通常以鐵的形式，可腸胃外或溫和地給予，以在需要的動(dòng)物中，特別是人類中促進(jìn)治療許多臨床疾病所需的造血機(jī)制。
術(shù)語(yǔ)“約”當(dāng)用作一個(gè)變量的修飾語(yǔ)，或結(jié)合一個(gè)變量，其目的是表達(dá)本文公開(kāi)的數(shù)字和范圍是靈活的，本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明使用溫度、濃度、含量、碳的數(shù)目、特性如分子量、粘度、溶解度等，它們?cè)诜秶饣虿煌趩我恢祵⒌玫剿璧慕Y(jié)果，也就是說(shuō)，補(bǔ)血鐵-糖復(fù)合物制品適合于凍干，從而產(chǎn)生高度純化的補(bǔ)血鐵-糖復(fù)合物以及其使用方法。而且，當(dāng)表達(dá)一個(gè)值的范圍，應(yīng)理解，除非另外說(shuō)明，本發(fā)明計(jì)劃使用的其它范圍包含在最廣泛的范圍中。
實(shí)施例為了本發(fā)明的目的，涉及未干燥的物質(zhì)或組合物中的水含量，換言之，在干燥前，以百分比給出未干燥物質(zhì)或組合物的總重量。干燥物質(zhì)或組合物的水含量以百分比只給出干燥物質(zhì)的總重，除外所有水分。
以下是制備樣品中使用的低壓凝膠滲透層析的步驟，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1，2和10，包括制備純化的、基本上不含賦形劑的AHS。用于AHS制備的低壓凝膠滲透層析(GPC)的具體應(yīng)用，采用顯示分子量排阻特征大于約5,000和較佳的大于約1,500道爾頓的交聯(lián)聚葡聚糖或葡聚糖。GPS的固定相是“Sephadex G-10”(Amersham-Pharmacia Biotech.，Piscataway，NJ)。一個(gè)溶劑貯罐提供HPLC級(jí)水的流動(dòng)相，通過(guò)重力或流量計(jì)流入裝有固定相葡聚糖的GPC柱。該柱由玻璃制成，具有2.0cm的直徑和25cm的長(zhǎng)度。根據(jù)生產(chǎn)商的建議制備固定相，包括葡聚糖的水合和使用前真空脫氣。400ml補(bǔ)血?jiǎng)┤芤簶悠罚ㄨF-糖復(fù)合物，例如，當(dāng)生產(chǎn)者將樣品從密封的玻璃安瓿中取出后，灌注到GPC柱的頂端并使之滲透進(jìn)入固定相。一旦高度著色的補(bǔ)血?jiǎng)┤芤簼B透進(jìn)入固定相，將HPLC級(jí)水手工加入或以1-4ml/min泵入以確保它以清晰的色帶洗脫通過(guò)此柱。當(dāng)特征性著色的AHS從柱上洗脫時(shí)，隨著測(cè)到430mm處最小的分光光度吸收值，即標(biāo)志級(jí)分1洗脫結(jié)束。尋找級(jí)分1結(jié)束和隨后的組分(本文稱做級(jí)分2)開(kāi)始的分離點(diǎn)的更精細(xì)分析方法，使用蒽酮反應(yīng)(Dreywood，1946前面已引用)。可確定兩組分之間的洗脫分界線，因?yàn)樵诜蛛x過(guò)程的整個(gè)洗脫液流中產(chǎn)生糖醛的碳水化合物的最低濃度出現(xiàn)在AHS及其吸水性賦形劑之間。實(shí)際上，采集洗脫液流的100ml樣品，與蒽酮試劑反應(yīng)，記錄620nm的吸光度。含AHS的紅-棕著色級(jí)分1基本不含親水性和高度吸水的賦形劑，該賦形劑先前在取出時(shí)與AHS共存。從柱上洗脫的余下的液體被認(rèn)作級(jí)分2。
如上所述，例如從級(jí)分1得到AHS，或從直接取自臨床應(yīng)用的補(bǔ)血?jiǎng)┙M合物的玻璃安瓿的樣品，或者從級(jí)分1的濃縮液制備的樣品，包括凍干用途的重建組合物得到AHS，可通過(guò)使用HPLC-為基礎(chǔ)的折射指數(shù)(RI)和激光散射(LLS)分析進(jìn)行進(jìn)一步的分析。具體說(shuō)，該方法使用Waters 590泵(Waters Corporation，Milford MA)將水移動(dòng)相加到7.8mm直徑×30cm長(zhǎng)的GMPWXL柱中(TosohBiosep，Montgomeryville，PA)。層析柱內(nèi)載體材料由有機(jī)玻璃骨架組成，除去13微米直徑大小的顆粒的聚合物珠，具有低于約100埃到約2000埃范圍的各種大小孔徑。層析柱洗脫液流由Wyatt miniDawn多角度光散射檢測(cè)器聯(lián)合Opeilab DSP干涉測(cè)量的折射儀監(jiān)測(cè)(二者都購(gòu)自Wyatt Technology Inc.，Santa Barbara，CA)。操縱溫度將柱加熱器和折射儀保持在35℃。水移動(dòng)相包括200ppm疊氮鈉，pH調(diào)整到6.0并在使用前進(jìn)行0.02微米真空過(guò)濾和沸騰的氦噴霧。將該移動(dòng)水相以1.0mL/min的流速、150磅/平方英寸的壓力加入到系統(tǒng)中。用于測(cè)試的樣品的制備需要通過(guò)一個(gè)膜過(guò)濾器進(jìn)行0.02微米過(guò)濾(例如“Anotop”過(guò)濾器，Whatman，Maidstone，英格蘭)。如果是補(bǔ)血?jiǎng)┙M合物、鐵-糖復(fù)合物或其老化成分，為了除去較大的顆粒而不阻塞，需使用0.45微米的膜過(guò)濾。如果在注入HPLC系統(tǒng)前顆粒沒(méi)有從分析物樣品中除去，HPLC的分析能力將遭到嚴(yán)重地破壞。樣品稀釋到所需的2.5％(w/w)并將80-200毫升的樣品液注入HPLC系統(tǒng)用于分析。對(duì)于多個(gè)樣品的分析，使用“Water’sautosample”，717型(Milford，MA)有利于自動(dòng)化。
RI和LLS檢測(cè)與HPLC聯(lián)合建立了分析物的絕對(duì)分子量，該分析物產(chǎn)生了層析峰以及平均平方根(rms)半徑值也稱做回轉(zhuǎn)半徑(Rg)。Rms值結(jié)合絕對(duì)分子量測(cè)定提供了對(duì)光散射物質(zhì)如桿狀、線圈狀、球型或圓盤(pán)狀的了解，。AHS的分子量和特異性鐵-糖復(fù)合物的形狀可用于各種監(jiān)測(cè)目的。
用于本發(fā)明實(shí)施例的凍干方法如下上述鑒定的級(jí)分1作為凍干的起始物質(zhì)。使用下文描述的方法，體積小至10mL或大至100mL并含有AHS的液體不難凍干，如果樣品基本上不含傾向于降低水熵及其蒸氣壓的糖類物質(zhì)。這些液體可裝在任何可承受殼冰凍的物理壓力的玻璃容器中，該方法用于促進(jìn)AHS的全面脫水和濃縮。對(duì)于殼冰凍優(yōu)選的液體體積對(duì)容器體積之比是大約1到5，但其它比例也是可行的。當(dāng)含有基本上不含賦形劑的AHS液體引入容器后，該容器以約50轉(zhuǎn)/分鐘的速度在低溫水浴中旋轉(zhuǎn)。該水浴可混合干冰和丙酮制成，或者，可使用液氮，只要溫度保持至少約為-50℃或更低。容器浸沒(méi)和旋轉(zhuǎn)使含AHS的液體凍結(jié)在容器的壁上。這增加了表面積與含AHS的液體體積之比，從而促進(jìn)水的升華。采用這一步驟的其它方法和設(shè)備變化可得到相同或類似的結(jié)果。
將含水的殼-冰凍組合物的一個(gè)或多個(gè)容器放置于凍干機(jī)的架子上。儀器如“Virtis Unitop 600L”連接于“Freezemobile 12 ES”(Gardiner，NY)可用于這一目的。該系統(tǒng)中保持60毫米汞柱(7.5Pa)的真空并且冷凝器的溫度保持在至少約-60℃或更冷。優(yōu)選的凍干循環(huán)如下最初容器架保持在-50℃的溫度2小時(shí)；溫度升到25℃應(yīng)超過(guò)12小時(shí)；樣品在25℃再浸泡24小時(shí)。較佳的干燥產(chǎn)品應(yīng)貯存在干燥的貯存條件下，例如在干燥的惰性氣體如氬或氮的條件下。干燥的AHS可用所需的液體進(jìn)行重建，于是它可方便地進(jìn)入溶液并不難通過(guò)上述0.02微米膜過(guò)濾。
使用RI和LLS檢測(cè)作HPLC分析顯示于以下使用鐵-糖復(fù)合物的10個(gè)實(shí)施例中。從1到10的各個(gè)實(shí)施例的結(jié)果對(duì)應(yīng)于圖1到圖10。補(bǔ)血?jiǎng)悠?-4和6-10被鑒定為含有蔗糖的葡糖酸鐵鈉復(fù)合物(SFGCS)的鐵-糖復(fù)合物，以Ferrlecit品牌名稱銷售(Rhone-Poulenc Rorer，Dagenham，Essex，England生產(chǎn))。實(shí)施例5及其相應(yīng)的圖5是氫氧化鐵蔗糖復(fù)合物(FHSC)，以Venofer品牌名稱銷售(LuitpoldPharmaceuticals，Shirley，NY生產(chǎn))。用于HPLC分析的樣品取自新開(kāi)啟的保存于室溫的玻璃安瓿。另外，樣品6，7，8和9在生產(chǎn)投放產(chǎn)品后6，12，22和25個(gè)月后進(jìn)行分析。本文中稱這些時(shí)期為“投放市場(chǎng)后的時(shí)間”TAM，在實(shí)施例中對(duì)應(yīng)于TAM#1、TAM#2、TAM#3和TAM#4。進(jìn)行1-20倍稀釋制備樣品，取這些稀釋液的200毫升樣品使用上述HPLC方法進(jìn)行分析。
實(shí)施例1的測(cè)試結(jié)果顯示在圖1中。該結(jié)果基于使用帶有RI及LLS檢測(cè)的HPLC，評(píng)價(jià)級(jí)分1洗脫液中分離的AHS級(jí)分1洗脫液采用制備型低壓GPC獲得，并從玻璃分裝安瓿中得到鐵-糖復(fù)合物的樣品。LLS信號(hào)和RI信號(hào)的單一清晰層析圖與AHS洗脫相一致，但是在純化的材料中沒(méi)有其它的賦形劑出現(xiàn)。
實(shí)施例2的結(jié)果顯示在圖2中。該結(jié)果是基于使用帶有RI和LLS檢測(cè)的HPLC，用于評(píng)價(jià)級(jí)分2洗脫液中分離的AHS，該級(jí)分2洗脫液采用制備型低壓GPC和實(shí)施例1中的鐵糖復(fù)合物而獲得。從這兩個(gè)結(jié)果可以清楚地看到賦形劑和AHS被分開(kāi)或分離到不同的組分中。將實(shí)施例1級(jí)分1的15毫升AHS加入到級(jí)分2的洗脫液中作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品以鑒定相對(duì)于賦形劑洗脫位置AHS的洗脫位置出現(xiàn)在哪里。
實(shí)施例3的結(jié)果顯示在圖3中。該結(jié)果是基于使用帶有RI和LLS檢測(cè)的HPLC，應(yīng)用于實(shí)施例1中的相同補(bǔ)血?jiǎng)悠?，以使具有其特征性AHS的級(jí)分1與通常在級(jí)分2中的賦形劑充分地分開(kāi)。在單一層析圖上，HPLC方法可鑒別補(bǔ)血?jiǎng)┙M合物的各種鐵-糖復(fù)合物成分。HPLC特別適用于快速分析試驗(yàn)，而低壓層析特別適合于作為優(yōu)選的AHS的制備方法。AHS的LLS信號(hào)與觀察到的RI信號(hào)相符合。
實(shí)施例4的結(jié)果顯示在圖4中。該結(jié)果是基于使用優(yōu)選的HPLC方法檢測(cè)與初始的AHS的結(jié)構(gòu)偏差。以其未降解的形式，AHS作為質(zhì)量基準(zhǔn)也以“主要參考標(biāo)準(zhǔn)”表示于這些圖中。使用RI和LLS的HPLC對(duì)一種補(bǔ)血?jiǎng)┙M合物進(jìn)行分析，該組合物直接獲自其遞送安瓿并含有鐵-糖復(fù)合物。圖示在預(yù)期的或理想的AHS峰中有不一致性。注意到出現(xiàn)一個(gè)新的、可觀察到的層析次級(jí)峰，毗鄰于AHS的主要參考標(biāo)準(zhǔn)峰。這一特征表明鐵聚集體質(zhì)是AHS降解的結(jié)果。使用LLS檢測(cè)，層析圖鑒定到第二個(gè)峰為補(bǔ)血活性物質(zhì)聚集峰(AHSAP)。特別值得注意單獨(dú)使用RI檢測(cè)觀察不到這個(gè)峰。
實(shí)施例5的結(jié)果顯示在圖5中。該結(jié)果是基于安裝了RI和LLS檢測(cè)器的HPLC的使用。該圖形也顯示了AHS中的結(jié)構(gòu)性變化，或含有FHSC的補(bǔ)血?jiǎng)┲饕獏⒖紭?biāo)準(zhǔn)峰。該產(chǎn)品的樣品包括安瓿上標(biāo)記生產(chǎn)日期為1999年12月和失效期為2002年12月。在這一實(shí)施例中，AHSAP顯示在AHS峰上有一肩峰，提示與實(shí)施例4研究的樣品比較有不同程度的變化。而LLS和RI層析圖通常是重疊的，只有LLS信號(hào)檢測(cè)到腸胃外給藥的補(bǔ)血?jiǎng)┲杏需F聚集體的證據(jù)。如前面的各個(gè)實(shí)施例，用于這一研究的樣品直接獲自臨床適用的密封玻璃安瓿。
實(shí)施例6-9。對(duì)于一種AHS，不難檢測(cè)到HPLC為基礎(chǔ)的RI和LLS的洗脫圖和預(yù)期的層析圖的偏差，這反映了背離優(yōu)選的生產(chǎn)條件或由于老化和不穩(wěn)定AHS的降解，盡管它密封在玻璃遞送安瓿中。不穩(wěn)定本身反映了通常體現(xiàn)為理想的AHS結(jié)構(gòu)一個(gè)組分的鐵的聚集。
雖然帶有RI檢測(cè)的HPLC沒(méi)能檢測(cè)到鐵-糖復(fù)合物的改變，但LLS檢測(cè)清楚地提供了這種產(chǎn)品不穩(wěn)定的證據(jù)。說(shuō)明了作為監(jiān)測(cè)含鐵-糖復(fù)合物的補(bǔ)血產(chǎn)品狀態(tài)的方法，本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)，此方法中為了測(cè)到鐵聚集體形成所顯示的AHS降解證據(jù)，使用了HPLC聯(lián)合RI和LLS檢測(cè)器。觀察到HPLC層析峰，為形成的鐵聚集體，表示為AHSAP。鐵-糖復(fù)合物的個(gè)別樣品，特別是生產(chǎn)超過(guò)幾個(gè)月的SFGCS，貯存在室溫、無(wú)光并避免已知對(duì)產(chǎn)品的穩(wěn)定性有壓力的任何移動(dòng)(盡管它們密封于玻璃安瓿中)。在室溫、黑暗的條件下樣品老化，并且生產(chǎn)后6、12、22和25個(gè)月，如所描述的，打開(kāi)各個(gè)安瓿，用帶有RI和LLS的HPLC分析含量。沒(méi)有一個(gè)貯存產(chǎn)品的樣品達(dá)到包裝材料上標(biāo)明的規(guī)定有效期。具有6個(gè)月的最短的TAM值的樣品被稱做TAM#1，具有25個(gè)月的最長(zhǎng)的TAM值的樣品稱作TAM#A。將HPLC研究的結(jié)果應(yīng)用于逐漸老化的補(bǔ)血?jiǎng)┑睦拥姆秶@示于圖6-9中。圖6-9層析圖中具有分析興趣的關(guān)鍵區(qū)域是AHS特征出現(xiàn)的區(qū)域，因此只顯示了與RI和LLS分析圖有關(guān)的特異性洗脫范圍。
把從TAM#1(圖6)到TAM#A(圖9)視為序列中的一組，顯然這些樣品的RI信號(hào)顯示AHS分解和鐵聚集對(duì)樣品的老化沒(méi)有什么影響。另一方面，伴有鐵聚集的AHS不穩(wěn)定證據(jù)通過(guò)AHSAP肩峰或次級(jí)峰明顯可見(jiàn)，使用LLS在所有4個(gè)實(shí)施例中都檢測(cè)到。
通過(guò)這些實(shí)施例，證明優(yōu)選的HPLC為基礎(chǔ)的RI和LLS方法提供了一種能力，來(lái)驗(yàn)證投放市場(chǎng)供腸胃道外給藥適用的補(bǔ)血?jiǎng)┊a(chǎn)品中AHS的存在或通常與其共存的賦形劑的存在。除此外，該方法提供了監(jiān)測(cè)、以及研究和開(kāi)發(fā)基于鐵-糖復(fù)合物類型的補(bǔ)血?jiǎng)┑闹匾哪芰??？梢悦靼走@一類補(bǔ)血?jiǎng)┮子诓环€(wěn)定，產(chǎn)生與優(yōu)選的或正常的AHS結(jié)合的鐵聚集體。除非使用至少帶有LLS監(jiān)測(cè)和RI監(jiān)測(cè)的HPLC，產(chǎn)生的鐵聚集體可能不被注意地進(jìn)入這些補(bǔ)血?jiǎng)┲小?br> 如上所述，當(dāng)實(shí)施本發(fā)明優(yōu)選的方法時(shí)，在樣品注入HPLC前，應(yīng)使它通過(guò)0.02微米的Anotop牌膜濾器進(jìn)行常規(guī)過(guò)濾，以避免與樣品有關(guān)的操作問(wèn)題。在供研究的制品中，沒(méi)有證據(jù)顯示AHSAP出現(xiàn)的鐵-糖樣品可能不難過(guò)濾，但是時(shí)間較長(zhǎng)的樣品即使使用0.45微米的過(guò)濾器也非常難以過(guò)濾或根本不能過(guò)濾。已觀察到根據(jù)具體的和優(yōu)選的方法，用于HPLC研究的樣品的制備型過(guò)濾很困難，這與出現(xiàn)最高水平的AHSAP相一致。測(cè)定的和定量以霧沫狀?yuàn)A帶通過(guò)膜過(guò)濾器表面的鐵聚集體可提供另一種(盡管是粗略的)評(píng)價(jià)補(bǔ)血?jiǎng)┓纸獬潭鹊姆椒āＨ欢?，腸胃外給藥前對(duì)補(bǔ)血?jiǎng)?yīng)用這種過(guò)濾方法是不實(shí)際的，并且，過(guò)濾法對(duì)于尚未進(jìn)展到可過(guò)濾的鐵聚集體階段的降解的AHS沒(méi)有任何效果。當(dāng)樣品中產(chǎn)生大量的鐵聚集體和必須進(jìn)行補(bǔ)血?jiǎng)┓治鰰r(shí)，為了HPLC儀器的性能和保養(yǎng)樣品過(guò)濾是必須的。而且，應(yīng)該注意到如果為了HPLC分析而制備AHS，導(dǎo)致鐵聚集體殘?jiān)蚱渌w粒物質(zhì)以霧沫狀?yuàn)A帶在膜過(guò)濾器上，過(guò)濾器上聚集的定量應(yīng)與HPLC分析一起考慮作為產(chǎn)品衰變的補(bǔ)充指標(biāo)。當(dāng)補(bǔ)血?jiǎng)┲写嬖诤苌倩驔](méi)有可濾過(guò)的物質(zhì)而且顆粒直徑小于10nm時(shí)，HPLC方法作為監(jiān)測(cè)補(bǔ)血?jiǎng)┵|(zhì)量的優(yōu)選的方法更為精確。
實(shí)施例10的結(jié)果顯示于圖10中。該實(shí)施例涉及對(duì)由凍干狀態(tài)重建的AHS應(yīng)用HPLC為基礎(chǔ)的RI和LLS分析的優(yōu)選方法。雖然以前從未報(bào)道過(guò)從鐵-糖復(fù)合物分離AHC，它被凍干和重建而不分解、降解或形成鐵聚集體的能力是特別不確定的。根據(jù)制備基本上不含賦形劑的AHS的低壓層析方法，將取自密封玻璃安瓿的起始為2.5mL的鐵-糖復(fù)合物樣品液，它SFGCS分離成級(jí)分1和級(jí)分2。將含有AHS的級(jí)分1如上所述凍干。凍干一周后用HPLC級(jí)水重建為起始的體積(2.5mL)。然后從2.5mL的重建溶液中取500微升稀釋到20.0mL，并將200微升的稀釋液如所述注入層析柱進(jìn)行HPLC為基礎(chǔ)的RI和LLS分析。得到的層析圖顯示于圖10中。注意到LLS和RI信號(hào)不僅重疊，與圖1中觀察到的層析圖一致，而且還沒(méi)有如圖6-9中觀察到的任何鐵聚集體形成或AHSAP的跡象。通過(guò)這個(gè)實(shí)施例，還顯示帶有RI和LLS檢測(cè)的HPLC可用于監(jiān)測(cè)凍干AHS的質(zhì)量。
實(shí)施例11進(jìn)行比較對(duì)未處理和處理的補(bǔ)血?jiǎng)┑膬龈傻姆磻?yīng)。將鐵-糖復(fù)合物的三個(gè)樣品生產(chǎn)的并含有AHS的SFGCS、蔗糖和剩余的賦形劑進(jìn)行凍干。所有三個(gè)樣品取自投放市場(chǎng)的不同玻璃安瓿的同一生產(chǎn)批次。使用的凍干方法與實(shí)施例10中應(yīng)用于補(bǔ)血?jiǎng)┑南嗤?，但與該實(shí)施例相反，在凍干過(guò)程中使AHS保留其賦形劑。試驗(yàn)的目的是觀察由于親水性賦形劑的存在最終凍干產(chǎn)品重量是否不一致，與缺乏這種親水性賦形劑的同一凍干產(chǎn)物作比較。含賦形劑的干燥的補(bǔ)血?jiǎng)┑慕Y(jié)果小結(jié)于表A中。
表A
★表達(dá)為初始樣品重量的百分比表A中使用的來(lái)自同一來(lái)源的同批次補(bǔ)血?jiǎng)┑娜齻€(gè)額外的樣品獲自不同的未開(kāi)啟安瓿并如上述在低壓層析柱中進(jìn)行處理。然后每個(gè)樣品的的級(jí)分1(含有AHS，但沒(méi)有結(jié)合的親水性賦形劑，包括蔗糖)如上所述進(jìn)行凍干，結(jié)果小結(jié)于表B中。
表B
★表達(dá)為初始樣品重量的百分比試驗(yàn)結(jié)果清楚顯示非常高的百分含量的水從樣品中除去，該樣品進(jìn)行了層析柱分離和相同條件的凍干。
盡管描述本發(fā)明參考了具體的實(shí)施例，應(yīng)理解這些實(shí)施例僅說(shuō)明本發(fā)明的原理和應(yīng)用。因此應(yīng)理解對(duì)于說(shuō)明的實(shí)施例可進(jìn)行大量的改變并且在不背離如附加的權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神和范圍的情況下可設(shè)想其它的安排。
權(quán)利要求
1.一種用于監(jiān)測(cè)鐵-糖復(fù)合物產(chǎn)品的方法，所述復(fù)合物含有至少一種補(bǔ)血活性物質(zhì)，其特征在于，所述監(jiān)測(cè)在選自如下的時(shí)間中進(jìn)行(a)在所述復(fù)合物的生產(chǎn)過(guò)程中；(b)所述復(fù)合物生產(chǎn)過(guò)程完成時(shí)；和(c)所述復(fù)合物生產(chǎn)后，所述方法包括將所述至少一種補(bǔ)血活性物質(zhì)的分析性反應(yīng)對(duì)應(yīng)于所述至少一種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品作比較。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述復(fù)合物生產(chǎn)后的所述時(shí)間是大約1周到5年。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述分析性反應(yīng)采用選自以下至少一種分析方法獲得，所述方法包括光散射增強(qiáng)的液相色譜、紫外分光光度術(shù)、可見(jiàn)光分光光度術(shù)、聯(lián)合的紫外和可見(jiàn)光分光光度術(shù)，所述紫外和可見(jiàn)光分光光度法任選的包括使用光電二極管陣列、紅外光譜學(xué)、電子自旋共振、脈沖極譜法、能量分散X射線分析、圓二色性和旋光色散、熒光分光光度術(shù)、旋光測(cè)定、熱分解質(zhì)譜分析、核磁共振分光術(shù)、差示掃描熱量測(cè)定、液相色譜質(zhì)譜分析、基質(zhì)輔助的激光解吸/電離質(zhì)譜測(cè)定；毛細(xì)管電泳；誘導(dǎo)-偶聯(lián)的等離子體光譜測(cè)定、原子吸收分析、電化學(xué)分析、使用包括放射性鐵的放射性同位素的分析、抗補(bǔ)血物質(zhì)的抗體、通過(guò)約0.02至0.45微米的多孔膜過(guò)濾器過(guò)濾后保留固體以及連接光散射和任選的質(zhì)量敏感檢測(cè)器的高壓液相色譜。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述分析方法是光散射增強(qiáng)液相色譜。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一種補(bǔ)血活性物質(zhì)采用結(jié)合光散射分析和任選的包括濃度敏感檢測(cè)器的高壓液相色譜進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
6.權(quán)利要求1所述的方法包括分離所述的至少一種補(bǔ)血活性物質(zhì)的步驟，其特征在于，所述至少一種補(bǔ)血活性物質(zhì)選自含有蔗糖的葡糖酸鐵鈉復(fù)合物、氫氧化鐵蔗糖復(fù)合物和糖酸鐵復(fù)合物。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述監(jiān)測(cè)使用選自以下的至少一種方法進(jìn)行光散射分析結(jié)合濃度敏感檢測(cè)器、原子吸收、X-射線分析、電化學(xué)分析、電子自旋共振、質(zhì)譜分析和超離心，所述監(jiān)測(cè)能夠顯示鐵聚集體的存在。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述鐵聚集體實(shí)質(zhì)上由鐵組成而不是鐵-糖復(fù)合物。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述鐵聚集體具有大約200,000到3,000,000道爾頓的平均分子量。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，鐵而不是鐵-糖復(fù)合物的產(chǎn)生比率小于或等于約0.5。
11.一種純化含有鐵-糖復(fù)合物和稀釋劑的組合物的方法，所述復(fù)合物含有至少一種活性補(bǔ)血物質(zhì)和至少一種賦形劑，其特征在于，該方法包括(1)將所述至少一種補(bǔ)血活性物質(zhì)與所述至少一種賦形劑充分分離；和任選的，(2)凍干所述的至少一種補(bǔ)血活性物質(zhì)。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述至少一種賦形劑含有非-補(bǔ)血活性成分。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述至少一種非-補(bǔ)血活性成分選自鐵-糖復(fù)合物合成反應(yīng)副產(chǎn)物、未反應(yīng)的鐵-糖復(fù)合物合成起始材料、鐵-糖復(fù)合物降解副產(chǎn)物、殘余的葡聚糖、聚葡聚糖、糖內(nèi)酯、溶劑和稀釋劑。
14.如權(quán)利要求11所述的方法還包括步驟(2)。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，凍干包括如下步驟(1)所述組合物被凍至選自低于其低共熔點(diǎn)和低于其玻璃變遷溫度的溫度。(2)冰冷凝表面能夠達(dá)到的溫度比所提供的所述冰分界面溫度至少低大約20℃。(3)所述凍結(jié)的組合物存放于一個(gè)封閉的容器中，該容器中提供能夠?qū)⒔^對(duì)壓力抽至約0.5到10Pa的真空；以及(4)所述凍結(jié)的組合物暴露于足以使存在于所述組合物中的凍結(jié)水水升華為蒸氣并凍結(jié)在所述冰冷凝表面的熱源。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于(1)所述組合物在低于其低共熔點(diǎn)凍結(jié)；(2)所述冰冷凝表面的溫度低于約-40℃；(3)所述真空的絕對(duì)壓力大約1Pa到8Pa；(4)所述熱源被控制在大約-60℃到約+65℃。
17.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述充分分離的步驟包括使所述組合物通過(guò)一個(gè)層析柱處理所述的組合物并將層析柱洗脫液分離為不同的組分。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述層析柱選自高壓液相層析柱和大小排阻層析柱。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述大小排阻層析柱中的固定相含有交聯(lián)的葡聚糖。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述組合物還含有高分子量的鐵聚集體且所述的分離還包括(1)鑒定所述組合物的洗脫物組成圖譜，所述洗脫物圖譜包括至少含有所述鐵聚集體的第一洗脫成分，含有至少一種補(bǔ)血活性物質(zhì)的所述鐵-糖復(fù)合物的第二洗脫成分以及含有低分子量賦形劑的第三洗脫成分；和(2)將所述第一和第三洗脫成分與第二洗脫成分分離。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述洗脫組成圖譜采用至少一種檢測(cè)器來(lái)確定，該檢測(cè)器選自激光散射檢測(cè)器、紫外-可見(jiàn)光傳導(dǎo)檢測(cè)器、用于檢測(cè)一種或多種確定波長(zhǎng)的可見(jiàn)光檢測(cè)器和折射指數(shù)檢測(cè)器。
22.一種使用權(quán)利要求11或權(quán)利要求16所述方法生產(chǎn)具有改良的貯存穩(wěn)定性的補(bǔ)血?jiǎng)┙M合物的方法。
23.一種選自含有蔗糖的氫氧化鐵復(fù)合物、含有蔗糖的葡糖酸鐵鈉復(fù)合物和糖酸鐵復(fù)合物的鐵-糖復(fù)合物，其中所述的復(fù)合物大體上不含賦形劑。
24.如權(quán)利要求23所述的復(fù)合物，其特征在于，所述賦形劑以低于約5％的重量百分比存在。
25.如權(quán)利要求24所述的復(fù)合物，其特征在于，所述賦形劑以低于約2％的重量百分比存在。
26.如權(quán)利要求23所述的復(fù)合物還含有一種液體，該液體選自所述復(fù)合物的溶劑和稀釋劑以及所述溶劑和稀釋劑的混合物。
27.如權(quán)利要求26所述的復(fù)合物，其特征在于，所述液體包括水。
28.如權(quán)利要求27所述的復(fù)合物適用于腸胃外給藥。
29.一種選自含有蔗糖的氫氧化鐵復(fù)合物、含有蔗糖的葡糖酸鐵鈉復(fù)合物和糖酸鐵復(fù)合物的貯存穩(wěn)定的鐵-糖復(fù)合物，其中所述的復(fù)合物大體上不含賦形劑和水。
30.如權(quán)利要求29所述的復(fù)合物，其特征在于，所述賦形劑以低于約5％的重量百分比存在。
31.如權(quán)利要求30所述的復(fù)合物，其特征在于，所述賦形劑以低于約2％的重量百分比存在。
32.一種將如權(quán)利要求29所述的貯存穩(wěn)定的復(fù)合物和水結(jié)合而制得的重建的補(bǔ)血復(fù)合物。
33.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在生產(chǎn)所述組合物的過(guò)程中和在含有所述制造組合物的補(bǔ)血組合物釋放時(shí)，以及任選地在此后的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間，使用至少一種所述的分析試驗(yàn)方法以確定含有純化的鐵-糖復(fù)合物的組合物的至少一個(gè)特征，以驗(yàn)證在所述釋放時(shí)，與所述特征的值或外觀相比所述釋放的補(bǔ)血組合物的至少一個(gè)特征基本上沒(méi)有改變。
全文摘要
一種分離和純化存在于鐵－糖復(fù)合物中的補(bǔ)血活性物質(zhì)的方法，該鐵－糖復(fù)合物包含有蔗糖的葡糖酸鐵鈉復(fù)合物、氫氧化鐵蔗糖復(fù)合物、和糖酸鐵復(fù)合物以及其它具有類似形式和功能的復(fù)合物，該方法基于鐵－糖復(fù)合物與一種或多種賦形劑的分離，較佳的，凍干。鐵－糖復(fù)合物的分離允許對(duì)它作分析性定量測(cè)定；進(jìn)一步濃縮和純化成為一種新的和有用的產(chǎn)品；重新設(shè)計(jì)配方制備新的和有用的藥物制劑；和/或凍干。分離具有補(bǔ)血功能的鐵－糖復(fù)合物包括其凍干形式的能力，還提供了制備分析性物質(zhì)的方法以檢驗(yàn)和驗(yàn)證其藥物完整性、患者的安全性和臨床功效，以及分析性監(jiān)測(cè)整個(gè)補(bǔ)血?jiǎng)┥a(chǎn)過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制視察以及監(jiān)測(cè)中所用標(biāo)準(zhǔn)品的建立。
文檔編號(hào)G01N30/84GK1473265SQ01818400
公開(kāi)日2004年2月4日 申請(qǐng)日期2001年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月2日
發(fā)明者R·A·貝克, R·A·馬蒂爾, R A 貝克, 馬蒂爾 申請(qǐng)人:色品先進(jìn)技術(shù)股份有限公司