專利名稱：植物愈傷組織顆粒懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紅景天甙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用植物細(xì)胞或愈傷組織顆粒懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物領(lǐng)域，尤其涉及利用一種結(jié)構(gòu)緊實的高山紅景天愈傷組織顆粒的懸浮培養(yǎng)體系生產(chǎn)紅景天甙的方法。
紅景天甙(salidroside)是一種紅景天屬植物，其地下部分含有甙類化合物-紅景天甙，分子結(jié)構(gòu)式如下。分子結(jié)構(gòu)式具有抗疲勞、抗缺氧、抗微波輻射和抗衰老等功能，能增強(qiáng)肌體抵抗外界不良刺激的能力，是一種很有開發(fā)前景的環(huán)境適應(yīng)元藥物。目前利用這一化合物開發(fā)的藥物主要是依靠從天然的紅景天屬植物的根和根莖中提取(平均含量為0.5％)，需要消耗大量的天然植物資源，致使這一珍貴植物的自然資源正在大幅度減少(明海泉等，1988；丁樹利等，1992；姜明蘭等，1994，1995)。為了保護(hù)這一珍貴植物，近年來嘗試著對紅景天屬植物進(jìn)行人工栽培和組織培養(yǎng)。但是，人工栽培條件下的紅景天甙含量低(低于0.2％)，幼苗根腐病嚴(yán)重，而且需要占用大面積耕地，限制這一技術(shù)的推廣(姜希強(qiáng)等，1994；秦佳梅等，1994；許建峰等，1996)。Xu等(1997，1998)曾誘導(dǎo)并建立了一種高山紅景天的愈傷組織顆粒懸浮培養(yǎng)體系，得到的紅景天甙產(chǎn)量為70-105mg/L。
本發(fā)明的目的在于提供一種紅景天甙產(chǎn)量更高的愈傷組織顆粒懸浮培養(yǎng)體系。同時，采用這種方法既不消耗紅景天植物的自然資源，又不占用耕地，減少了對生態(tài)環(huán)境的破壞，實現(xiàn)了資源的可持續(xù)利用。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是將接種量為15％(v/v)的高山紅景天愈傷組織顆粒于液體Murashige-Skoog(MS)基本培養(yǎng)基附加5mg/L 6-芐氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine，BA)和2.5mg/L吲哆丁酸(Indole-3-butyric acid，IBA)、4.5％蔗糖、pH為5.7、光照強(qiáng)度150μE/m2/s、光照時間16小時/天和攪拌速度為100rpm/min的生長培養(yǎng)條件下培養(yǎng)15-20天，再轉(zhuǎn)到總氮含量為基本MS培養(yǎng)基的一半的液體MS培養(yǎng)基附加4mg/L的2，4-D、((2，4-Dichlorophenoxy)acetic acid)、1.5％蔗糖、pH為4.2、光照強(qiáng)度150μE/m2/s、光照時間16小時/天和攪拌速度為150rpm/min的生產(chǎn)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)6-9天，收集愈傷組織顆粒，提取紅景天甙。
本發(fā)明的優(yōu)點是1、以高山紅景天的結(jié)構(gòu)緊實的顆粒狀愈傷組織為原料生產(chǎn)紅景天甙。原料依靠植物組織培養(yǎng)技術(shù)獲得，對高山紅景天自然資源無破壞，且節(jié)約耕地，實現(xiàn)了自然資源的保護(hù)和可持續(xù)利用。
2、以該種高山紅景天的愈傷組織顆粒為材料進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，愈傷組織顆粒結(jié)構(gòu)緊實，大小均一，懸浮培養(yǎng)時不散碎，不產(chǎn)生泡沫，粘滯性小，減小培養(yǎng)難度。
3、針對該高山紅景天的愈傷組織顆粒懸浮培養(yǎng)的生長規(guī)律和紅景天甙積累特征，本培養(yǎng)方法有效的提高了紅景天甙產(chǎn)量。
4、采用添加甙元酪醇的措施顯著地提高了紅景天甙產(chǎn)量。
5、本發(fā)明適用于大規(guī)模生產(chǎn)。
下面對本發(fā)明的實施例作進(jìn)一步詳細(xì)描述將接種量為15％(v/v)的高山紅景天愈傷組織顆粒于液體Murashige-Skoog(MS)基本培養(yǎng)基附加5mg/L 6-芐氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine，BA)和2.5mg/L吲哆丁酸(Indole-3-butyric acid，IBA)、4.5％蔗糖、pH為5.7、光照強(qiáng)度150μE/m2/s、光照時間16小時/天和攪拌速度為100rpm/min的生長培養(yǎng)條件下培養(yǎng)15-20天，再轉(zhuǎn)到總氮含量為基本MS培養(yǎng)基的一半的液體MS培養(yǎng)基附加4mg/L的2，4-D、((2，4-Dichlorophenoxy)acetic acid)、1.5％蔗糖、pH為4.2、光照強(qiáng)度150μE/m2/S、光照時間16小時/天和攪拌速度為150rpm/min的生產(chǎn)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)6-9天，收集愈傷組織顆粒，提取紅景天甙。
所述的還可以將接種量為15％(v/v)的高山紅景天愈傷組織顆粒于液體Murashi ge-Skoog(MS)基本培養(yǎng)基附加5mg/L 6-芐氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine，BA)和2.5mg/L吲哆丁酸(Indole-3-butyricacid，IBA)、4.5％蔗糖中添加4mM的甙元酪醇(tyrosol)，培養(yǎng)基pH為5.7、光照強(qiáng)度為150μE/m2/s，光照時間16小時/天和攪拌速度為100rpm/min的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)15-20天，收集愈傷組織顆粒，提取紅景天甙。
所述的高山紅景天愈傷組織顆粒是由高山紅景天的子葉在固體MS基本培養(yǎng)基附加3-6mg/L BA和1-3mg/L IBA且BA/IBA比值為1/3-1/2的條件下誘導(dǎo)得到的一種綠色或有紅色斑點、直徑在2-5毫米的愈傷組織顆粒。高山紅景天愈傷組織顆粒懸浮培養(yǎng)的生長周期為20-25天，其生物量積累和紅景天甙積累不同步，最大生物量積累在繼代后的15-20天，紅景天甙的最高積累量在繼代后的3-5天。
所述的高山紅景天愈傷組織顆粒的接種量為15％，先置于生長培養(yǎng)條件下培養(yǎng)15-20天，立即更換到生產(chǎn)培養(yǎng)條件下再培養(yǎng)6-9天，收集愈傷組織顆粒，提取紅景天甙。
本發(fā)明以一種由高山紅景天的子葉誘導(dǎo)產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)緊實的愈傷組織顆粒為原料，對其分別在生長培養(yǎng)條件和生產(chǎn)培養(yǎng)條件下進(jìn)行液體懸浮培養(yǎng)。還可以利用添加甙元酪醇的措施提高紅景天甙產(chǎn)量。
所述的一種由高山紅景天的子葉誘導(dǎo)產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)緊實的愈傷組織顆粒為綠色或有紅色斑點，結(jié)構(gòu)緊實，直徑在2-5毫米的顆粒。其懸浮培養(yǎng)的生長周期為20-25天，其生物量積累和紅景天甙積累不同步最大生物量積累在繼代后的15-20天，紅景天甙的最高積累量在繼代后的3-5天。
所述的生長培養(yǎng)條件，指液體MS基本培養(yǎng)基附加5mg/L BA和、2.5mg/LIBA、4.5％蔗糖；pH為5.7；光照強(qiáng)度為150μE/m2/s、光照時間16小時/天；攪動速度為100rpm/min。
所述的生產(chǎn)培養(yǎng)條件，指液體MS基本培養(yǎng)基附加4mg/L的2，4-D、1.5％蔗糖；pH為4.2；光照強(qiáng)度為150μE/m2/s，光照時間16小時/天；攪動速度為150rpm/min。
所述的培養(yǎng)模式指接種量為15％(v/v)的愈傷組織顆粒先置于生長培養(yǎng)條件下培養(yǎng)15-20天，傾倒掉液體培養(yǎng)基，立即更換到生產(chǎn)培養(yǎng)條下再培養(yǎng)6-9天，收獲集愈傷組織顆粒，提取紅景天甙。
所述的利用添加甙元酪醇(tyrosol)的措施提高紅景天甙產(chǎn)量，方法是在生長培養(yǎng)條件下的液體MS培養(yǎng)基中添加4mM的甙元酪醇(tyrosol)，培養(yǎng)15-20天，收集愈傷組織顆粒，提取紅景天甙，可使產(chǎn)量提高29倍。
權(quán)利要求
1.一種植物愈傷組織顆粒懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紅景天甙，其特征在于將接種量為15％(v/v)的高山紅景天愈傷組織顆粒于液體Murashige-Skoog(MS)基本培養(yǎng)基附加5mg/L 6-芐氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine，BA)和2.5mg/L吲哆丁酸(lndole-3-butyric acid，IBA)、4.5％蔗糖、pH為5.7、光照強(qiáng)度150μE/m2/s、光照時間16小時/天和攪拌速度為100rpm/min的生長培養(yǎng)條件下培養(yǎng)15-20天，再轉(zhuǎn)到總氮含量為基本MS培養(yǎng)基的一半的液體MS培養(yǎng)基附加4mg/L的2，4-D、((2，4-Dichlorophenoxy)aceticacid)、1.5％蔗糖、pH為4.2、光照強(qiáng)度150μE/m2/S、光照時間16小時/天和攪拌速度為150rpm/min的生產(chǎn)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)6-9天，收集愈傷組織顆粒，提取紅景天甙。
2.按照權(quán)利要求1所述植物愈傷組織顆粒懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紅景天甙，其特征在于還可以將接種量為15％(v/v)的高山紅景天愈傷組織顆粒于液體Murashige-Skoog(MS)基本培養(yǎng)基附加5mg/L 6-芐氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine，BA)和2.5mg/L吲哆丁酸(Indole-3-butyricacid，IBA)、4.5％蔗糖中添加4mM的甙元酪醇(tyrosol)，培養(yǎng)基pH為5.7、光照強(qiáng)度為150μE/m2/s，光照時間16小時/天和攪拌速度為100rpm/min的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)15-20天，收集愈傷組織顆粒，提取紅景天甙。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的植物愈傷組織顆粒懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紅景天甙，其特征在于高山紅景天愈傷組織顆粒是由高山紅景天的子葉在固體MS基本培養(yǎng)基附加3-6mg/L BA和1-3mg/L IBA且BA/IBA比值為1/3-1/2的條件下誘導(dǎo)得到的一種綠色或有紅色斑點、直徑在2-5毫米的愈傷組織顆粒。高山紅景天愈傷組織顆粒懸浮培養(yǎng)的生長周期為20-25天，其生物量積累和紅景天甙積累不同步，最大生物量積累在繼代后的15-20天，紅景天甙的最高積累量在繼代后的3-5天。
4.按照權(quán)利要求1所述的植物愈傷組織顆粒懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紅景天甙，其特征在于高山紅景天愈傷組織顆粒的接種量為15％，先置于生長培養(yǎng)條件下培養(yǎng)15-20天，立即更換到生產(chǎn)培養(yǎng)條件下再培養(yǎng)6-9天，收集愈傷組織顆粒，提取紅景天甙。
全文摘要
一種植物愈傷組織顆粒懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紅景天甙，它是將接種量15％的高山紅景天愈傷組織顆粒于液體MS基本培養(yǎng)基附加6－芐氨基嘌呤和吲哆丁酸，調(diào)整蔗糖含量、pH值和攪拌速度等培養(yǎng)條件，培養(yǎng)15－20天，再轉(zhuǎn)到總氮含量為基本MS培養(yǎng)基的一半的液體MS培養(yǎng)養(yǎng)基附加2，4－D及調(diào)整蔗糖含量、pH值和攪拌速度等培養(yǎng)條件，培養(yǎng)6－9天，收集高山紅景天愈傷組織顆粒，提取紅景天甙，提高了紅景天甙含量。
文檔編號C12P19/44GK1417343SQ0113339
公開日2003年5月14日 申請日期2001年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月31日
發(fā)明者吳雙秀, 吳汪黔生, 祖元剛 申請人:東北林業(yè)大學(xué), 祖元剛