專利名稱：用于構建t載體的dna序列及用該序列制備t載體的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于構建T載體的DNA序列、含有該序列的載體以及用該序列制備T載體的方法。
背景技術：
“T/A”克隆法(Clark 1988；Holtonh and Graham 1991；Marchuk et al.1991；Mead et al.1991；Hu1993；Zhou et al.1995)是伴隨著PCR技術而發(fā)展起來的一種克隆方法。由于許多耐熱性DNA聚合酶如Taq酶等的非模板依賴的末端轉移酶活性可以在幾乎任何雙鏈DNA分子的3’端加上一個突出的“A”(Clark 1988；Zhou et al.1995)，因此人們開發(fā)出一種3’端帶一突出“T”的特殊載——T載體，以用于克隆Taq酶擴增的PCR產物或其它以Taq酶做A-tailing操作的線性DNA片段。目前用到的T載體一般是商品化的載體，其構建策略不同廠商各有不同(Holton and Graham 1991；Marchuk etal 1991)，主要分為兩類1.在高濃度的dTTP的存在下，被產平末端的內切酶消化后的載體與Taq酶溫育，由于Taq酶在不存在dATP的情況下有相對良好的3’末端加“T”能力，因此可以在線性化載體的平滑末端的3’端添加一個“T”，制成T載體。
2.在ddTTP的存在下，具平滑末端的的載體與末端轉移酶溫育，由于ddTTP不含3’-OH，因此末端轉移酶只能在載體的3’端加上一個“T”，構成T載體。
以上方法制得的T載體由于有生產廠商的嚴格質量控制，其效率可達70％或更高(PromegaCatalog&Technical Reference 2000-01)，可以滿足常規(guī)的克隆操作。但由于其操作步驟較多，質量不易控制，因此只應用于幾種常見載體如pUC18，pGEM等，而且由專業(yè)的公司來生產。
限制性內切酶HphI、XcmI的識別序列和切割位點分別是GGTGA(N8/N7)和CCA(N5/N4)TGG，它們的一個共同特點是其切割位點附近的堿基是簡并的，并且靶序列被切開后產生3’末端的單個核苷酸突出，這一特性為T載體的開發(fā)提供了素材(Mead et al.1991)。將兩個靶序列反向重復的插入載體，并且將切割位點上游的第一個堿基設為T，便得到一前T載體，相應的酶切處理前T載體可得到含3’末端突出一個T的成熟T載體。已嘗試過用這一方法得到T載體以用于克隆PCR產物的限制性內切酶有XcmI、HphI、Eam11051或其同裂酶AspEI等(Mead et al.1991；Ichihara andKurosawa 1993；Testori et al.1994；Cha et al.1993；Ido and Hayami 1997；Arashi-Heese et al.1999；Schutte et al.1997；de Vries 1998；Borovkov and Rivkin 1997；Testori and Sollitti 1997)。但值得指出的是，目前用這一方法制作T載體其應用效果都不甚理想，一個主要的原因是這類產末端單核苷酸突出的限制性內切酶其切--連--切(cut-ligate-recut)指標較差，尤其是連接的效率很低，如XcmI的切--連--切指標為95％--20％--95％(NEB Catalog&Technical Reference 2000-01)，這就使得克隆的效率過低而在實際應用中不被接受。HphI是這類酶中的一個例外，其切--連--切指標為95％--75％--95％(NEB catalog&Technical Reference 2000-01)，基本可以滿足常規(guī)的克隆操作的需要，因此理論上是生產這種T載體的首選(Mead et al.1991)，但由于其識別序列只有五個核苷酸，幾乎所有的載體自身都帶有一個或多個它的識別序列，因此它的實際應用就不具普遍意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種能兼顧上述切--連--切指標和識別序列長度的用于構建T載體的DNA序列及含有該序列的載體和采用該序列構建T載體的方法。
產末端單核苷酸突出的限制性內切酶的切--連--切指標中連接的效率普遍很差，究其原因，一般認為是連接酶不適合以這種單核苷酸突出分子為底物(Mead et al.1991)。HphI作為眾多中的一個例外，其最好的解釋就是其切點上游的那段識別序列可以起到調節(jié)分子局部空間結構、穩(wěn)定連接酶-DNA復合物從而促進連接的作用?；诖?，在分析了HphI和XcmI的識別序列和切割位點后，我們發(fā)現(xiàn)，將HphI和XcmI的識別序列串聯(lián)，可得到序列GGTGACCA(N5/N4)TGG，該序列中的XcmI的切割位點正好也是HphI的切割位點，也就是說，理論上用XcmI處理該序列可能得到用HphI處理該序列同樣的連接指標。
本發(fā)明所提供的用于構建T載體的DNA序列，是限制性內切酶HphI和XcmI的識別序列串聯(lián)體，具體序列如下GGTGACCANNNNT/NNNNTGG，其中N代表任意堿基。該序列具體如序列表1所示(以下簡稱為DNA序列1)。
兩個如上所述的DNA序列1以反向重復方式排列，即構成如序列表2所示的序列。
本發(fā)明所提供的含有如上所述DNA序列1的載體，其特征是該載體含有兩個以反向重復方式排列的上述DNA序列1。特別是由兩個該DNA序列1以反向重復方式插入于自身不含XcmI識別位點的載體的多克隆位點區(qū)，再經內切酶XcmI過消化所得到的T載體。
用本發(fā)明上面所述的DNA序列1制備T載體的方法是將兩個如上所述DNA序列1以反向重復方式插入自身不含XcmI識別位點的載體的多克隆位點區(qū)，得到前T載體；在超過前T載體10倍摩爾濃度的外切酶競爭性底物(Exonuclease Competitive Substrate，簡稱ECS)的存在下，用內切酶XcmI消化前T載體，得到成熟T載體。加入ECS可以有效抑制市售內切酶所含殘余外切酶活性對所得T載體的影響。
上述方法中所說的外切酶競爭性底物通常為線性單鏈或雙鏈寡DNA。最好是長度為5～50個核苷酸的線性單鏈或雙鏈寡DNA，以使得在不過度增加酶切消化體系中總DNA濃度的條件下，提供足夠的DNA末端以抑制殘余外切酶活性對所得T載體的影響。
如上所述，我們合成了-60bp的DNA接頭HphI-XcmI，該接頭含兩個以反向重復方式排列的序列GGTGACCANNNNT/NNNNTGG，接頭兩端分別是內切酶EcoRI和SalI所對應的粘性末端。該接頭插入質粒pUC18的EcoRI+SalI窗口得到一前T載體pUC-HX，在比載體pUC-HX高＞10倍摩爾濃度的外切酶競爭性底物的存在下，內切酶XcmI消化pUC-HX得到成熟T載體pUC-HX-T。以四種經A-tailing操作后的線性DNA片段為外源片段對載體pUC-HX-T進行了克隆效率測試，結果顯示其克隆效率可達95％或更高，與商品化的T載體質量相當甚至更好，足夠滿足常規(guī)的克隆要求。利用上述方法構建T載體操作簡便，所得載體質量上乘。另外，由于HphI-XcmI接頭只有60bp，且接頭兩端的粘性末端可任意設定，因此它(或其衍生物)可以方便的插入到各種自身不含XcmI識別位點的載體中構成前T載體，XcmI處理后即成為成熟T載體，這使得利用這一方法構建T載體操作簡單而且具有普遍應用意義，這一優(yōu)勢是傳統(tǒng)T載體制作方法所無法相比的。


圖1是HphI-XcmI接頭序列(Sequence of the HphI-XcmI linker)結構示意圖。該接頭含兩個以反向重復排列的HphI、XcmI識別序列串聯(lián)體GGTGACCANNNNTNNNNTGG(N示A、T、C、G四種堿基中的任意堿基)；接頭兩末端分別是EcoRI和SalI所對應的粘性末端，為克隆入相應載體提供方便；接頭中間還有一EcoRV識別位點，為以后的重組克隆篩選提供方便。
圖2是重組質粒pUC-HX(前T載體)的EcoRV酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖。M示分子量Marker；泳道1為未消化的質粒pUC-HX；泳道2為EcoRV消化后的pUC-HX；泳道3為EcoRV消化后的質粒pUC18。
圖3是重組質粒pUC-HX(前T載體)的構建過程示意圖。質粒pUC18經內切酶EcoRI+SalI雙酶切消化后，在T4 DNA連接酶的催化下與HphI-XcmI接頭連接，連接產物轉化后便可得到重組質粒pUC-HX。
圖4是內切酶XcmI消化前T載體pUC-HX得到的成熟T載體pUC-HX-T的結構示意圖。
具體實施例方式
以下通過具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例1。HphI-XcmI接頭的合成按照圖1所示的序列用常規(guī)方法合成HphI-XcmI接頭序列。接頭的兩條鏈分別合成，再將兩鏈分別溶于雙蒸水后，等摩爾混合，37℃退火15分鐘，即可得到全長為60bp的雙鏈HphI-XcmI接頭(如圖1所示)。該接頭序列是屬于序列表2所示序列的一個具體序列。實施例2。外切酶競爭性底物(ECS)的合成本實施例以一11nt的寡DNA為外切酶競爭性底物，用以抑制XcmI殘余外切酶活性對目的T載體的影響。該競爭性底物可按常規(guī)方法合成，具體序列為5’p-CCAGCGCTGGT。合成后溶于ddH2O中至終濃度為0.5μg/μl。實施例3。載體pUC-HX(前T載體)的構建如圖3所示，通過常規(guī)的分子克隆方法，將實施例1的退火后得到的HphI-XcmI接頭與用EcoRI+SalI雙酶切切開的質粒pUC18連接，轉化，得到重組質粒pUC-HX。由于質粒pUC18自身不含EcoRV識別位點，而HphI-XcmI接頭中間含有一EcoRV識別位點，因此用EcoRV對重組質粒做酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳顯示得到一條大小與預期的2.7kb相符的片段(如圖2所示)，同時測序結果也表明HphI-XcmI接頭得到正確插入。實施例4。載體pUC-HX-T(T載體)的獲得用限制性內切酶XcmI消化載體pUC-HX得到載體pUC-HX-T(結構如圖4所示)。
酶切反應體系如下pUC-HX 2μg外切酶競爭性底物(ECS)2.5μgXcmI 15UBuffer2(NEB) 10μlddH2O 至終體積100μl37C反應2個小時，酚抽使酶失活。酶切產物跑1.0％的瓊脂糖凝膠電泳，膠回收大小約為2.7kb的DNA片段(參照QIAGEN膠回收試劑盒說明書)，即為載體pUC-HX-T。實施例5。載體pUC-HX-T的克隆效率測試1.外源片段的A-tailing反應1～10μg的鈍末端或5’末端突出的DNA分子在100μl含0.2M each dNTP、1U Taq酶、1x buffer和25mM MgCl2的體系里72℃反應30分鐘(3’末端突出DNA分子可先用綠豆芽核酸酶處理使之鈍端化)，得到A-tailed外源片段。
2.連接反應載體pUC-HX-T和A-tailed外源片段按摩爾比1∶5的量加入連接反應體系，以TaKaRa公司提供的連接試劑盒DNA Ligation Kit Ver.2作連接，16℃反應過夜。
3.克隆效率測定參照《分子克隆》第二版。以E.coli Top10為受體菌用氯化鈣法制備感受態(tài)細胞；連接產物轉化感受態(tài)細胞，復蘇后涂布與LB(Amp+)瓊脂板，37℃培養(yǎng)過夜；從平板上隨機挑選一定數(shù)量克隆做擴大培養(yǎng)，提取其中質粒做酶切分析，鑒定是否含目的插入片段。
分別以長為1.3kb和0.5kb的A-tailed酶切消化片段(含5’磷酸基團)及長為1.3kb和0.5kb的PCR產物(不含5’磷酸基團)為外源片段對載體pUC-HX-T做克隆效率測試，并以商品化的T載體pMD18-T(購自TaKaRa公司)為對照。詳細結果如表1至表4所示。
從表1至表4可見載體pUC-HX-T對以上四種外源片段的克隆效率均可達到95％以上，完全足夠滿足常規(guī)的克隆要求。而且與商品化T載體pMD18-T相比，pUC-HX-T的克隆效率還要略高于pMD18-T。這些都說明用上述方法制備T載體切實可行。
為了確定外源片段是否通過精確的“T/A”克隆插入到載體pUC-HX-T中，我們每組隨機挑選了10個克隆進行測序，測序結果證明外源片段都是通過精確的“T/A”克隆接入載體pUC-HX-T中。表1.載體pUC-HX-T和pMD18-T對外源片段為1.3kb的A-tailed SalI-SalI片段的克隆效率比較

表2.載體pUC-HX-T和pMD18-T對外源片段為0.5kb的A-tailed SalI-SalI片段的克隆效率比較

表3.載體pUC-HX-T和pMD18-T對外源片段為1.3kb的A-tailed PCR產物的克隆效率比較

表4.載體pUC-HX-T和pMD18-T對外源片段為0.5kb的A-tailed PCR產物的克隆效率比較

序列表11.序列特征長度20bp，類型核酸，鏈數(shù)雙鏈，幾何結構線性；2.分子類型DNA3.來源人工合成4.序列描述SEQ ID NO.15’--GGTGACCANNNNTNNNNTGG --3’說明序列SEQ ID NO.1中N代表A，T，C，G四種堿基中的任意堿基。
序列表21.序列特征長度40+n bp，類型核酸，鏈數(shù)雙鏈，幾何結構線性；2.分子類型DNA3.來源人工合成4.序列描述SEQ ID NO.25’--GGTGACCANNNNTNNNNTGGN(0～n)CCANNNNANNNNTGGTCACC--3’說明序列SEQ ID NO.2中N代表A，T，C，G四種堿基中的任意堿基，n為自然數(shù)(n＝1，2，3…)。
權利要求
1. 一種用于構建T載體的DNA序列，其特征在于該序列是限制性內切酶HphI和XcmI的識別序列串聯(lián)體，具體序列如下GGTGACCANNNNT/NNNNTGG，其中N代表任意堿基。
2. 含有權利要求1所述DNA序列的載體，其特征是該載體含有兩個以反向重復方式排列的權利要求1所述的DNA序列。
3. 按照權利要求2所述的載體，其特征是該載體是由兩個權利要求1所述的DNA序列以反向重復方式插入于自身不含XcmI識別位點的載體的多克隆位點區(qū)，再經內切酶XcmI過消化而成的T載體。
4. 用權利要求1所述的DNA序列制備T載體的方法，其特征是將兩個權利要求1所述DNA序列以反向重復方式插入自身不含XcmI識別位點的載體的多克隆位點區(qū)，得到前T載體，在超過前T載體10倍摩爾濃度的外切酶競爭性底物的存在下，用內切酶XcmI消化前T載體，得到成熟T載體。
5. 按照權利要求4所述的方法，其特征是所說的外切酶競爭性底物為線性單鏈或雙鏈寡DNA。
6. 按照權利要求5所述的方法，其特征是所說的線性單鏈或雙鏈寡DNA的長度為5--50個核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于構建T載體的DNA序列、含有該序列的載體及其轉化為T載體的方法。該DNA序列
文檔編號C12N15/11GK1344795SQ0112985
公開日2002年4月17日 申請日期2001年11月2日 優(yōu)先權日2001年11月2日
發(fā)明者王珣章, 賀雄雷, 付捷, 龍綮新 申請人:中山大學