專利名稱：活性雙歧聯(lián)菌株耐酸腸溶微囊及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，更詳細(xì)地是活性雙歧聯(lián)菌株耐酸腸溶微囊及其制備方法。
雙歧桿菌是人體腸道的主要有益菌群。這些有益菌不僅在防治腸道菌群失調(diào)癥和其它老年病上有獨(dú)特作用，而且在抑制致病菌的生長與入侵、改善消化功能、提供營養(yǎng)、降低血清膽固醇、提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤等作用都是公認(rèn)的。雙歧桿菌制品，正是利用雙歧桿菌這種人體自身優(yōu)勢生理細(xì)菌制成活菌制劑，再經(jīng)口服回歸人體原來的生境(腸道)中，達(dá)到調(diào)節(jié)或維持機(jī)體正常生理功能的制品，又稱為微生態(tài)制劑。醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為，通過微生態(tài)制劑來調(diào)節(jié)人體消化道的功能，是發(fā)展保健功能性食品中最重要最有前景的部分。隨著對雙歧桿菌有益于人體健康研究的不斷積累，隨著現(xiàn)代人追求健康飲食需求的不斷擴(kuò)大，各種利用活性雙歧桿菌的功能性食品或醫(yī)用微生態(tài)制劑相繼推出并日漸普及。目前國外已有70種以上的產(chǎn)品問世，其中大多數(shù)為乳制品。在日本，雙歧桿菌制品占總酸乳量的三分之一。日本健康食品協(xié)會(huì)將含雙歧桿菌的功能食品列為健康食品，并指明雙歧桿菌可用于產(chǎn)婦食品及幼兒特殊營養(yǎng)食品中。在歐洲，雙歧桿菌制品也已成為發(fā)酵乳制品中發(fā)展最快的部分。我國從90年代初開始將雙歧桿菌用于各種健康食品中，如三株口服液、雙歧天寶口服液等，也將雙歧凍干菌粉作為藥用微生態(tài)制劑用于治療腸道疾病，如麗珠腸樂等。
醫(yī)用或保健用微生態(tài)制劑所使用的雙歧桿菌菌種有；嬰兒雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、長雙歧桿菌等。國內(nèi)現(xiàn)有微生態(tài)制劑均采用單一種雙歧桿菌，如“回春生”、“麗珠腸樂”是使用單一的青春雙歧桿菌，也有用單一種雙歧桿菌再與其它乳酸桿菌配合的制劑，如“培菲康”(兩歧雙歧桿菌、糞鏈球菌和乳酸桿菌)、“三株口服液”等。
現(xiàn)有微生態(tài)制劑的一般生產(chǎn)工藝過程包括——種子培養(yǎng)將經(jīng)過選育純化的雙歧桿菌菌種，按其生長條件要求(營養(yǎng)、pH、溫度、厭氧等)，進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，先制成種子液；——發(fā)酵培養(yǎng)將種子液接入經(jīng)滅菌冷卻的發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，進(jìn)行厭氧發(fā)酵培養(yǎng)，使雙歧桿菌大量增殖；——離心集菌待發(fā)酵液中的菌體生長量達(dá)高峰時(shí)(對數(shù)生長期未期)，在無雜菌感染條件下，高速離心收集濕菌體；——菌體凍干在濕菌體中加入凍干保護(hù)劑，移入凍干機(jī)中進(jìn)行冷凍真空干燥，成為凍干菌粉(含活性菌)；
——制成制劑凍干菌粉可添加入大量輔料，壓成片劑或分裝入硬膠囊中，成為治療型或保健型微生態(tài)制劑。
液態(tài)微生態(tài)制劑則是在發(fā)酵培養(yǎng)后，不離心收集活菌體，而直接進(jìn)行灌裝，成為瓶裝或杯裝活菌制劑，需低溫貯存銷售。
雙歧桿菌雖具有前述獨(dú)特的保健功效，但它最突出的缺點(diǎn)是1、對營養(yǎng)條件要求高，對氧極為敏感，對低pH值耐性差，容易失活。雙歧桿菌液體制劑在幾天內(nèi)活菌數(shù)就會(huì)下降一個(gè)數(shù)量級(jí)，凍干菌粉在一般貯存溫度下也只能保存幾個(gè)月。有人分析了國內(nèi)外15種徵生態(tài)制劑中的活菌存活數(shù)，在屬于凍干粉(粉劑、片劑、硬膠囊劑)的樣品中，有的存放6個(gè)月后存活率已低至0.4％，水劑型產(chǎn)品存放2個(gè)月，存活率則降到0.2％，最低為0.01％。
2、此外，雙歧桿菌要能夠?qū)θ梭w產(chǎn)生有益作用，首先它必需安全通過胃環(huán)境(pH1.5-3.0)，以大量的存活菌數(shù)到達(dá)腸道并定殖于腸粘膜上，但由于胃酸的殺菌作用，雙歧桿菌的活菌數(shù)在此過程中也會(huì)大幅度下降。據(jù)報(bào)道，口服凍干雙歧菌粉，在胃中的存活率僅為百萬分之一左右，存活率極低。由于雙歧桿菌不耐受強(qiáng)酸性環(huán)境，在經(jīng)口服通過人體消化道時(shí)，絕大部分受胃酸、膽汁酸的作用而失活，僅剩下極少量活性菌到達(dá)腸道。因此，雖持續(xù)超量服用活菌制劑，也難以對人體起到理想的療效和保健作用。
3、另一方面，現(xiàn)有的微生態(tài)制劑，一般均要求在低溫下保存和銷售，常溫下貨架期太短，產(chǎn)品在常溫下銷售和消費(fèi)過程中活菌含量迅速下降，商品貨架期短，極大地影響該類產(chǎn)品的生產(chǎn)、銷售和應(yīng)用。
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)，提供一種活性雙歧聯(lián)菌株耐酸腸溶微囊，使其能耐受強(qiáng)胃酸環(huán)境，并能在常溫下長時(shí)間儲(chǔ)存，有效地保護(hù)雙歧桿菌的活性。
本發(fā)明的目的還在于提供一種活性雙歧聯(lián)菌株耐酸腸溶微囊的制備方法。
本發(fā)明的活性雙歧聯(lián)菌株耐酸腸溶微囊包括囊心物和囊衣液，囊心物是短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)、青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)三種雙歧桿菌(簡稱雙歧聯(lián)株菌，下同)的活菌粉微粒，囊衣液是復(fù)合腸溶性材料，通過流化噴霧法制得；短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)、青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)三種雙歧桿菌的活菌數(shù)比例為1～3∶1～2∶1～2；復(fù)合腸溶性材料是(按重量/體積計(jì))漂白蟲膠10～30％
羧甲基纖維素鈉 1～3％硬酯酸鎂 1～5％溶劑是80～85％乙醇；或者是((按重量/體積計(jì))鄰苯二甲酸醋酸纖維素(CAP)5～20％鄰苯二甲酸二乙酯 2～5％、司盤(Span)80 1～3％，采用酒精∶丙酮=50％∶50％混合溶劑；或者是鄰苯二甲酸醋酸纖維素(CAP)5～20％鄰苯二甲酸二甲酯 1～5％司盤(Span)80 0.5～2％硬脂酸 0.5～3％采用酒精∶丙酮=70％∶30％為混合溶劑；囊心物和囊衣液的用量比例為2～3∶1～1.5(重量/體積)。
流化噴霧法微型包囊技術(shù)的原理是作為囊心的微粒(活性菌粉微粒)，在通入壓縮無菌熱空氣的流化床中，呈翻滾流體狀態(tài)。由噴嘴噴射出的囊衣液呈細(xì)霧狀，與菌粉微粒接觸，在表面均勻成膜并迅速被熱氣流所干燥。經(jīng)一定時(shí)間后，逐漸形成一定厚度的囊衣，從而完成菌粉心材微粒的包囊。
流化噴霧微型包囊法一般在囊心物不耐受較強(qiáng)烈的理化因素的情況下應(yīng)用，如當(dāng)囊心物為微生物細(xì)胞或生物大分子(如酶類、活性蛋白質(zhì)等)時(shí)應(yīng)用。
本發(fā)明的活性雙歧聯(lián)菌株耐酸腸溶微囊的制備方法包括(1)雙歧桿菌二級(jí)種子培養(yǎng)將短雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、青春雙歧桿菌一級(jí)種子液分別接種于培養(yǎng)基中，在厭氧條件下靜置于36℃～39℃下培養(yǎng)14～18小時(shí)，分別得到三種菌的二級(jí)種子液。
所用培養(yǎng)基可以是現(xiàn)有的和通用的培養(yǎng)基，發(fā)明人提供一種特別適合本發(fā)明的培養(yǎng)基，其組成如下(重量/體積)酵母浸出膏0.3～0.8％胰蛋白胨 0.3～0.8％蛋白胨0.8～1.2％大豆蛋白胨0.2～0.5％L-半胱氨酸0.02～0.1％
可溶性淀粉 0.03～0.08％無水葡萄糖 0.8～1.2％牛肝浸液10～20％低聚果糖0.5～1.2％乳糖0.2～0.5％吐溫80 0.1～0.2％溶液A 0.5～1.0％溶液B 0.3～0.6％PH 7.0～7.5其中溶液A的組成(重量/體積)是K2HPO48～12％、KH2PO48～12％溶液B的組成(重量/體積)是FeSO40.1～0.4％、MgSO4·7H2O、0.2～0.5％MnSO4·H2O 0.1～0.2％、NaCl 0.1～0.3％；(2)雙歧聯(lián)菌株發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH為7.0～7.6，先接入兩歧雙歧桿菌和青春雙歧桿菌二級(jí)種子液，2-3小時(shí)后再接入短雙歧桿菌二級(jí)種子液，發(fā)酵溫度36℃～39℃，發(fā)酵時(shí)間14～20小時(shí)，發(fā)酵過程緩慢通入混合氣體(氮?dú)狻枚趸肌脷錃?85∶10∶5)，維持罐壓0.1kg/cm2以上，得成熟發(fā)酵液；所用發(fā)酵培養(yǎng)基配方可以是現(xiàn)有的或通用的培養(yǎng)基，本發(fā)明人提供特別適合本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下(重量/體積)酵母抽提液0.8～1.2％胰蛋白胨 0.4～0.8％大豆酶解液1.5～2.5％葡萄糖1.5～2.5％低聚果糖 0.3～0.7％牛肝浸出液4～6％牛肉膏0.3～0.6％NaCl 0.2～0.4％K2HPO40.1～0.2％PH7.2～7.4(3)離心集菌與凍干發(fā)酵液于管式高速(4000轉(zhuǎn)/分)離心機(jī)離心收集濕菌體，加入復(fù)合凍干保護(hù)劑，于凍干機(jī)冷凍(-40℃～-50℃)干燥約48～60小時(shí)，得凍干菌塊；凍干保護(hù)劑是現(xiàn)有技術(shù)在制備活性凍干菌粉時(shí)通用的，發(fā)明人經(jīng)過探索性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以下配方的凍干保護(hù)劑特別適合本發(fā)明(重量份)
海藻糖 0.1～0.15脫脂奶粉 2～2.5乳糖 3～4低聚果糖 1～1.5麥芽糊精 4～5可溶淀粉 4～5維生素C鈉 0.05～0.06(4)流化噴霧微型包囊上述凍干菌塊磨成細(xì)粉后，先于包衣鍋中以30％～50％低聚果糖液嘖霧造粒(60～100目)，50℃～55℃熱風(fēng)干燥。再以菌粉微粒為囊心物，以復(fù)合腸溶性材料為囊衣液，在下列條件下進(jìn)行微型包囊菌粉粒(囊心)量100～500克，無菌空氣壓力2～6kg/cm2，熱空氣溫度40～60℃，空氣流量流化床為0.8～1.5m3/min，噴嘴為0.1～0.5m3/min，囊衣液流量50～100ml/h，包囊時(shí)間1～3小時(shí)，制成40～100目的活性雙歧聯(lián)菌株耐酸腸溶微囊。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)1、采用三種不同的雙歧桿菌組成聯(lián)菌株，使制劑更適合于不同年齡的人服用，擴(kuò)大了產(chǎn)品的適應(yīng)范圍并增加其有效性；2、凍干菌粉經(jīng)流化嘖霧的微型包囊法制成耐酸腸溶性微囊，使微囊中的活性菌能順利通過胃酸進(jìn)入腸道發(fā)揮其保健功效；3、由于活性菌包封于微囊中，受外界環(huán)境因子(氧氣、溫度)的影響小，故存活時(shí)間較長，使產(chǎn)品在常溫下保存期大大延長。
下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例11．雙歧聯(lián)菌株混合培養(yǎng)以50升發(fā)酵罐(定容40升)中試為例(1)二級(jí)種子培養(yǎng)培養(yǎng)基配方酵母浸出膏20g、胰蛋白胨20g、蛋白胨40g、大豆蛋白胨12g、L-半胱氨酸2g、可溶性淀粉4g、無水葡萄糖40g、牛肝浸液600g、低聚果糖40g、乳糖12g、吐溫80 4g、溶液A 40g、溶液B 20g、加水定容4升，調(diào)pH 7.2～7.5，于120℃下滅菌15分鐘。
其中溶液A配方K2HPO410g、KH2PO410g、加純水至100g；溶液B配方FeSO40.2g、MgSO4·7H2O 0.4g、MnSO4·H2O 0.15g、NaCl0.2g、加純水至100g；培養(yǎng)條件短雙歧桿菌和青春雙歧桿菌各1升，分別接入100mL一級(jí)種子；兩歧雙歧桿菌1.5升，接入150mL一級(jí)種子，置于38℃厭氧條件下培養(yǎng)16小時(shí)。
(2)混合發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基(40升)組成酵母抽提液0.4kg、胰蛋白胨0.2kg、大豆酶解液0.8kg、葡萄糖0.8kg、低聚果糖0.2kg、牛肝浸出液2kg、牛肉膏0.2kg、NaCl 0.12kg、K2HPO40.08kg、調(diào)PH7.2～7.4，1kg/cm2滅菌10分鐘。
發(fā)酵條件控制培養(yǎng)基起始pH7.4，先接入兩歧雙歧桿菌二級(jí)種子液1.5升、青春雙歧桿菌二級(jí)種子液1.0升，培養(yǎng)兩小時(shí)后再接入短雙歧桿菌二級(jí)種子液1.0升，總接種量約10％。發(fā)酵溫度37℃～38℃，發(fā)酵時(shí)間18小時(shí)，發(fā)酵過程緩慢通入混合氣體(氮?dú)狻枚趸肌脷錃?85∶10∶5)，維持罐壓0.1kg/cm2以上。發(fā)酵培養(yǎng)變化過程列于表1表1
2．離心集菌與凍干發(fā)酵液于管式高速(4000轉(zhuǎn)/分)離心機(jī)離心收集菌體，得濕菌體為250克，加入復(fù)合凍干保護(hù)劑2Kg(配方為海藻糖100g、脫脂奶粉2Kg、乳糖3Kg、低聚果糖1Kg、麥芽糊精4Kg、可溶淀粉4Kg、維生素C鈉50g)，直接于凍干機(jī)冷凍(-40℃)干燥50小時(shí)，得凍干菌塊2.1公斤3．流化噴霧法微型包囊上述凍干菌塊磨成細(xì)粉后，先于包衣鍋中以40％低聚果糖液嘖霧造粒(60～100目)，50℃～55℃熱風(fēng)干燥。再以菌粉微粒為囊心物，以復(fù)合腸溶性材料為囊衣液，采用流化噴霧的徵型包囊法，在瑞典NIRO-AEROMATIC LTD生產(chǎn)的微囊化裝置上進(jìn)行微型包囊。
復(fù)合腸溶性囊衣液的配方為漂白蟲膠200g、羧甲基纖維素鈉20g、硬酯酸鎂20g，溶于80％乙醇并定容至1000mL。
流化噴霧的徵型包囊法控制條件為；菌粉微粒(囊心)量300克，無菌空氣壓力3～4kg/cm2，熱空氣溫度50～55℃，空氣流量流化床為1.0m3/min，嘖嘴為0.2m3/min，囊衣液流量70～80ml/h，包囊時(shí)間2小時(shí)，制成40～80目的活性雙歧聯(lián)菌株微囊。
4．微生態(tài)制劑的制備(1)乳片劑以乳粉300g、白糖400g、麥芽糊精100g、低聚果糖和低聚異麥芽糖(雙歧促生因子)各50g、硬酯酸鎂10g為原料，加入100g的活性雙歧聯(lián)菌株耐酸腸溶微囊，壓制成異型乳片劑，成為新型高效的微生態(tài)制劑。
(2)軟膠囊劑將微囊100g與兩種低聚糖各50g混入1升無菌植物油中，制成混懸液(濃度為20％)。以活菌微囊混懸液為心材，在自動(dòng)旋轉(zhuǎn)軋囊機(jī)中采用模壓制法制成軟膠囊微生態(tài)制劑。
(3)硬膠囊劑將微囊與兩種低聚糖按1∶1∶1混合后，灌注于硬膠囊中即成為硬膠囊微生態(tài)制劑。
(4)混飲口服液；發(fā)酵液于管式高速離心機(jī)離心，分別收集菌體和離心清液。菌體按上述方法制成微囊，再壓成速溶片或裝入硬膠囊中。取離心清液1升，加入糖類(白糖100g、低聚果糖100g)調(diào)配成口服液，灌裝(50mL/瓶)滅菌。飲用時(shí)，即時(shí)混入活菌微囊(速溶片或硬膠囊)則成為微生態(tài)混飲口服液。
下面用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明本發(fā)明創(chuàng)造與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的優(yōu)點(diǎn)和效果(1)含活性菌微囊的耐酸腸溶試驗(yàn)雙歧桿菌的最大缺點(diǎn)是不耐氧不耐酸，在較大的酸性條件下很容易失活。據(jù)報(bào)導(dǎo)，口服凍干菌粉，在胃中的存活率僅為百萬分之一左右，存活率極低。采用微型包囊的目的，一方面是隔絕氧氣，延長活菌存活期，另一方面是保護(hù)活性菌免受胃酸的殺害而順利進(jìn)入腸道發(fā)揮作用。故必須對活性微囊進(jìn)行耐酸腸溶的考察試驗(yàn)。
將上述制備的微囊和末經(jīng)包囊的凍干菌粉在人工胃液(pH1.5～1.8、37℃、攪拌)中分別處理2小時(shí)和4小時(shí)，結(jié)果列于表2表2
凍干菌粉在人工胃液中處理2小時(shí)和4小時(shí)后存活率極低，分別不到千萬分之二和億分之三。而囊衣較厚的微囊A，在人工胃液中處理2小時(shí)后，存活率仍高達(dá)92％。微囊B由于包囊衣較薄，或有的包得不夠均勻，故偏低些，但實(shí)際存活的菌數(shù)仍在同一數(shù)量級(jí)(109)，意味著每口服1克微囊，大約有十億個(gè)活菌可安全通過胃酸進(jìn)入腸道。
上述微囊同時(shí)用人工腸液(pH6.8、37℃、攪拌)處理，結(jié)果列于下表3
表3
微囊B在15分鐘內(nèi)崩解完全，崩解率為95％，腸溶性良好；而微囊A因囊衣較厚，崩解時(shí)間也僅約為20分鐘。
(2)含活性雙歧聯(lián)菌株耐酸腸溶微囊的保存穩(wěn)定性試驗(yàn)按常規(guī)加速試驗(yàn)法，若將產(chǎn)品置37℃～40℃、相對濕度75％條件下放置3個(gè)月后，所測得的考察項(xiàng)目指標(biāo)仍在所要求的范圍內(nèi)，則此產(chǎn)品可暫定有效期為2年。珠海麗珠集團(tuán)規(guī)定，將麗珠腸樂硬膠囊在恒溫37℃、相對濕度60～65％條件下儲(chǔ)存3個(gè)月，若存活率在10％以上，則相當(dāng)于在室溫下可儲(chǔ)存1年以上。
參照麗珠腸樂的指標(biāo)，將樣品置37℃、內(nèi)盛飽和NaCl溶液的密閉容器中(相對濕度約70％)，對上述微囊進(jìn)行保存穩(wěn)定性考察，結(jié)果如表4表4
經(jīng)37℃、RH70％的常規(guī)加速試驗(yàn)和常溫留樣觀察，結(jié)果表明含活性菌微分裝3瓶(2瓶1升，1瓶1.5升)，于120℃，1kg/cm2壓力下滅菌10分鐘，冷卻后依次接入短雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、青春雙歧桿菌1升、1.5升、1升三種雙歧桿菌一級(jí)種液，接種量約10％，于38℃厭氧條件下培養(yǎng)16小時(shí)。
配制發(fā)酵培養(yǎng)基40L，配方為酵母抽提液0.48kg、胰蛋白胨0.32Kg、大豆酶解液1kg、葡萄糖1kg、低聚果糖0.28kg、牛肝浸出液2.4kg、牛肉膏0.24kg、NaCl 0.16kg、K2HPO40.08kg、調(diào)PH7.4。
移入50升發(fā)酵罐中，夾層通汽升溫至100℃，直沖至120℃，保持5分鐘，降溫至約40℃，先接入上述兩歧雙歧桿菌、青春雙歧桿菌二級(jí)種子液，兩小時(shí)后再接入短雙歧桿菌二級(jí)種液，發(fā)酵溫度控制在37～38℃，發(fā)酵過程緩慢通入混合氣體(氮?dú)狻枚趸肌脷錃?85∶10∶5)，維持罐壓0.1kg/cm2以上。發(fā)酵時(shí)間18小時(shí)。
發(fā)酵液于管式高速離心機(jī)離心收集菌體，得濕菌體為250克、加入復(fù)合凍干保護(hù)劑2公斤后，直接于凍干機(jī)冷凍真空干燥48小時(shí)，得凍干菌塊2.3公斤。凍干保護(hù)劑的配方為海藻糖150g、脫脂奶粉2.5Kg、乳糖4Kg、低聚果糖1.5Kg、麥芽糊精5Kg、可溶淀粉5Kg、維生素C鈉60g。
凍干菌塊磨成細(xì)粉后，于包衣鍋中以40％低聚果糖液嘖霧造粒，熱風(fēng)干燥。以菌粉顆粒為囊心物，以復(fù)合囊材(漂白蟲膠150g、羧甲基纖維素鈉15g、硬酯酸20g，85％乙醇1升)做為包衣液，采用流化噴霧的徵型包囊法，在瑞典NIRO-AEROMATIC LTD生產(chǎn)的微囊化裝置上進(jìn)行微型包囊?？刂茥l件為；菌粒(囊心)量400克，無菌空氣壓力4kg/cm2，熱空氣溫度45～50℃，空氣流量流化床為1.5m3/min，嘖嘴為0.4m3/min，囊衣液流量100mL/h，包囊時(shí)間2小時(shí)，制成60～80目的活性雙歧聯(lián)菌株微囊。
以乳粉3kg、白糖4kg、麥芽糊精1kg、低聚果糖和低聚異麥芽糖各0.5kg、硬酯酸鎂0.1kg為原料，加入1kg的活性雙歧聯(lián)菌株耐酸腸溶微囊，壓制成異型乳片劑，成為新型高效的微生態(tài)制劑。
實(shí)施例3制備活性雙歧聯(lián)菌株耐酸腸溶微囊制劑(混飲口服液)種子培養(yǎng)與實(shí)施例1同。發(fā)酵培養(yǎng)基(40升)配方改為干酵母抽提液0.4kg、大豆蛋白胨0.2Kg、大豆酶解液1kg、口服葡萄糖1Kg、低聚果糖0.4Kg、牛肝浸出液1kg、NaCl0.12Kg、K2HPO480g、調(diào)PH7.5，其他發(fā)酵條件同實(shí)施例1。
發(fā)酵液于管式高速離心機(jī)離心，分別收集菌體和離心清液，得濕菌體200克、離心清液30L。菌體加入復(fù)合活菌保護(hù)劑1.6Kg(配方為海藻糖100g、脫脂奶粉2Kg、乳糖3Kg、低聚果糖1Kg、麥芽糊精4Kg、可溶淀粉4Kg、維生素C鈉50g)，冷凍真空干燥52小時(shí)，得凍干菌塊1.7kg，按實(shí)施例1所述方法制成微囊，再壓成速溶片或裝入硬膠囊中。離心清液則加入糖類(白糖3kg、低聚果糖3kg)調(diào)配成口服液，灌裝(50mL/瓶)滅菌。飲用時(shí)，即時(shí)混入活菌微囊，則成微生態(tài)混飲口服液。
實(shí)施例4制備活性雙歧聯(lián)菌株耐酸腸溶微囊制劑(硬膠囊劑)。
按實(shí)施例1的方法進(jìn)行二級(jí)種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、離心集菌并制成凍干菌粉。
以菌粉微粒為囊心物，以復(fù)合囊材為包衣液，采用流化噴霧的微型包囊法，在微囊化裝置上進(jìn)行微型包囊。微囊化控制條件與實(shí)施例1同。復(fù)合囊材包衣液的配方改為鄰苯二甲酸醋酸纖維素(CAP)100g、鄰苯二甲酸二乙酯20g、Span 80 10g，酒精∶丙酮=1∶1混合溶劑1升。制得60～100目的耐酸腸溶微囊，將微囊與兩種低聚糖(低聚果糖和低聚異麥芽糖)按1∶1∶1混合后，灌注于硬膠囊中，即成為硬膠囊微生態(tài)制劑。
實(shí)施例5制備活性雙歧聯(lián)菌株耐酸腸溶微囊制劑(軟膠囊劑)按實(shí)施例1的方法進(jìn)行二級(jí)種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、離心集菌并制成凍干菌粉。
以菌粉微粒為囊心物，以復(fù)合囊材為包衣液，采用流化噴霧的微型包囊法，在微囊化裝置上進(jìn)行微型包囊。復(fù)合囊材包衣液的配方改為鄰苯二甲酸醋酸纖維素(CAP)120g、鄰苯二甲酸二甲酯15g、Span 80 8g，硬脂酸20g，酒精∶丙酮=70％∶30％混合溶劑1升；微囊化控制條件與實(shí)施例1同。制得80～100目的耐酸腸溶微囊，將微囊1kg與兩種低聚糖各5kg混入10升無菌植物油中，制成混懸液(濃度約20％)。以活菌微囊混懸液為心材，在自動(dòng)旋轉(zhuǎn)軋囊機(jī)中采用模壓制法制成軟膠囊微生態(tài)制劑。
權(quán)利要求
1.一種活性雙歧聯(lián)菌株耐酸腸溶微囊，其特征在于包括囊心物和囊衣液，囊心物是短雙歧桿菌(Bifidobacteriumbreve)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)、青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)三種雙歧桿菌的活菌粉微粒，囊衣液是復(fù)合腸溶性材料，通過流化噴霧法制得；短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)、青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)三種雙歧桿菌的活菌數(shù)比例為1～3∶1～2∶1～2；囊心物和囊衣液的用量比例為2～3∶1～1.5(重量/體積)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活性雙歧聯(lián)菌株耐酸腸溶微囊，其特征在于復(fù)合腸溶性材料是(按重量/體積計(jì))漂白蟲膠10～30％，羧甲基纖維素鈉1～3％，硬酯酸鎂1～5％，溶劑是80～85％乙醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活性雙歧聯(lián)菌株耐酸腸溶微囊，其特征在于復(fù)合腸溶性材料是(按重量/體積計(jì))鄰苯二甲酸醋酸纖維素(CAP)5～20％，鄰苯二甲酸二乙酯2～5％，司盤(Span)80 1～3％，采用酒精∶丙酮=50％∶50％混合溶劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活性雙歧聯(lián)菌株耐酸腸溶微囊，其特征在于復(fù)合腸溶性材料是(按重量/體積計(jì))鄰苯二甲酸醋酸纖維素(CAP)5～20％，鄰苯二甲酸二甲酯1～5％，司盤(Span)80 0.5～2％，硬脂酸0.5～3％，采用酒精∶丙酮=70％∶30％為混合溶劑。
5.一種活性雙歧聯(lián)菌株耐酸腸溶微囊的制備方法，其特征在于包括下列步驟(1)雙歧桿菌二級(jí)種子培養(yǎng)將短雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、青春雙歧桿菌一級(jí)種子液分別接種于培養(yǎng)基中，在厭氧條件下靜置于36℃～39℃下培養(yǎng)14～18小時(shí)，分別得到三種菌的二級(jí)種子液；(2)雙歧聯(lián)菌株發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH為7.0～7.6，先接入兩歧雙歧桿菌和青春雙歧桿菌二級(jí)種子液，2-3小時(shí)后再接入短雙歧桿菌二級(jí)種子液，發(fā)酵溫度36℃～39℃，發(fā)酵時(shí)間14～20小時(shí)，發(fā)酵過程緩慢通入混合氣體(氮?dú)狻枚趸肌脷錃?85∶10∶5)，維持罐壓0.1kg/cm2以上，得成熟發(fā)酵液；(3)離心集菌與凍干發(fā)酵液于管式高速(4000轉(zhuǎn)/分)離心機(jī)離心收集濕菌體，加入復(fù)合凍干保護(hù)劑，于凍干機(jī)冷凍(-40℃～-50℃)干燥約48～60小時(shí)，得凍干菌塊；(4)流化噴霧微型包囊上述凍干菌塊磨成細(xì)粉后，先于包衣鍋中以30％～50％低聚果糖液嘖霧造粒(60～100目)，50℃～55℃熱風(fēng)干燥。再以菌粉微粒為囊心物，以復(fù)合腸溶性材料為囊衣液，在下列條件下進(jìn)行微型包囊菌粉粒(囊心)量100～500克，無菌空氣壓力2～6kg/cm2，熱空氣溫度40～60℃，空氣流量流化床為0.8～1.5m3/min，噴嘴為0.1～0.5m3/min，囊衣液流量50～100ml/h，包囊時(shí)間1～3小時(shí)，制成40～100目的活性雙歧聯(lián)菌株耐酸腸溶微囊。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的活性雙歧聯(lián)菌株耐酸腸溶微囊的制備方法，其特征在于步驟(1)的培養(yǎng)基組成如下(重量/體積)酵母浸出膏0.3～0.8％，胰蛋白胨0.3～0.8％，蛋白胨0.8～1.2％，大豆蛋白胨0.2～0.5％,L-半胱氨酸0.02～0.1％，可溶性淀粉0.03～0.08％，無水葡萄糖0.8～1.2％，牛肝浸液10～20％，低聚果糖0.5～1.2％，乳糖0.2～0.5％，吐溫80 0.1～0.2％，溶液A 0.5～1.0％，溶液B 0.3～0.6％，PH 7.0～7.5；其中溶液A的組成(重量/體積)是K2HPO48～12％、KH2PO48～12％；溶液B的組成(重量/體積)是FeSO40.1～0.4％、MgSO4·7H2O、0.2～0.5％MnSO4·H2O 0.1～0.2％、NaCl 0.1～0.3％。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的活性雙歧聯(lián)菌株耐酸腸溶微囊的制備方法，其特征在于步驟(2)的培養(yǎng)基組成如下(重量/體積)酵母抽提液0.8～1.2％，胰蛋白胨0.4～0.8％，大豆酶解液1.5～2.5％，葡萄糖1.5～2.5％，低聚果糖0.3～0.7％，牛肝浸出液4～6％，牛肉膏0.3～0.6％，NaCl 0.2～0.4％，K2HPO40.1～0.2％，PH7.2～7.4。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的活性雙歧聯(lián)菌株耐酸腸溶微囊的制備方法，其特征在于步驟(3)的凍干保護(hù)劑(重量份)海藻糖0.1～0.15，脫脂奶粉2～2.5，乳糖3～4，低聚果糖1～1.5，麥芽糊精4～5，可溶淀粉4～5，維生素C鈉0.05～0.06。
全文摘要
一種活性雙歧聯(lián)菌株耐酸腸溶微囊包括囊心物和囊衣液,囊心物是短雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、青春雙歧桿菌三種雙歧桿菌的活菌粉微粒,囊衣液是復(fù)合腸溶性材料,通過流化噴霧法制得;其制備方法包括:雙歧桿菌二級(jí)種子培養(yǎng),雙歧聯(lián)菌株發(fā)酵培養(yǎng),離心集菌與凍干,流化噴霧微型包囊;這種活性雙歧聯(lián)菌株耐酸腸溶微囊,使其能耐受強(qiáng)胄酸環(huán)境,并能在常溫下長時(shí)間儲(chǔ)存,有效地保護(hù)雙歧桿菌的活性。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1310016SQ01107518
公開日2001年8月29日 申請日期2001年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月13日
發(fā)明者楊汝德 申請人:華南理工大學(xué)