專利名稱：來自人體內(nèi)的免疫系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體而言是涉及與培養(yǎng)的免疫系統(tǒng)細(xì)胞相關(guān)的方法和組分。
背景技術(shù)：
所有的造血細(xì)胞系，包括紅細(xì)胞，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，和巨核細(xì)胞都源于叫作多能干細(xì)胞(PCSs)的一小類細(xì)胞。PCS具有自我更新的能力或成為能夠形成特定造血分化細(xì)胞系的專門的干細(xì)胞。具體地說，PSC形成髓樣細(xì)胞系或淋巴細(xì)胞系的多能細(xì)胞。這些多能細(xì)胞進(jìn)而形成單能或雙能的專門祖細(xì)胞，再由前體細(xì)胞分化為成熟的血細(xì)胞。
基質(zhì)介導(dǎo)的血細(xì)胞生成作用已在體外利用鼠長(zhǎng)期骨髓培養(yǎng)(LTBMC)予以證明。LTBMC首先由Dexter(1)和其同事利用組織培養(yǎng)瓶建立的。在Dexter LTBMC中產(chǎn)生的成熟細(xì)胞主要是中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞。骨髓在體內(nèi)可以產(chǎn)生10種以上的血細(xì)胞系。
骨髓是初級(jí)免疫器官也是造血組織。因此，一個(gè)功能性的骨髓模型應(yīng)該不僅產(chǎn)生造血細(xì)胞而且產(chǎn)生包括淋巴細(xì)胞的免疫細(xì)胞。目前，唯一的一種淋巴細(xì)胞產(chǎn)生模型是由Whitlock和Witte(16，17)建立的鼠LTBMC。Whitlock和Witte培養(yǎng)不同于Dexter培養(yǎng)之處在于，其培養(yǎng)溫度是37℃而非33℃，用胎牛血清代替馬血清。而且培養(yǎng)基中包含2-巰基乙醇而非氫化可的松。與Dexter培養(yǎng)不同，Whitlock和Witte培養(yǎng)幾乎只產(chǎn)生B-淋巴細(xì)胞，這表明基質(zhì)細(xì)胞提供了一種有助于淋巴細(xì)胞形成的微環(huán)境。Whitlock和Witte培養(yǎng)物包含pre-B細(xì)胞(前B細(xì)胞)(僅產(chǎn)生μ重鏈)和成熟的B細(xì)胞(可合成IgG的重鏈和輕鏈)。
有趣的是在產(chǎn)生優(yōu)勢(shì)的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞的Dexter條件下起始培養(yǎng)的培養(yǎng)物，當(dāng)轉(zhuǎn)變到Whitlock和Witte條件下時(shí)即由骨髓細(xì)胞生成轉(zhuǎn)變?yōu)榱馨图?xì)胞生成(4)。這一轉(zhuǎn)變伴隨脂肪細(xì)胞退化和基質(zhì)層的其它形態(tài)轉(zhuǎn)變。因此在培養(yǎng)瓶中的基質(zhì)細(xì)胞受培養(yǎng)條件的影響，或傾向于骨髓細(xì)胞生成或傾向于淋巴細(xì)胞生成，但不會(huì)同時(shí)傾向兩者。兩種培養(yǎng)系統(tǒng)的不同之處表明氫化可的松對(duì)調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞生成具有潛在的影響。盡管Whitlock和Witte培養(yǎng)作為鼠B-淋巴細(xì)胞生成模型十分有用，但在體內(nèi)脫離骨髓只能支持一種細(xì)胞系的發(fā)育。另外還內(nèi)有人Whitlock和Witte培養(yǎng)物的等價(jià)物的相關(guān)報(bào)道。盡管體內(nèi)B-淋巴細(xì)胞在骨髓內(nèi)成熟，還沒有人骨髓培養(yǎng)方法在體外支持B-淋巴細(xì)胞成熟。一些T-細(xì)胞也駐留于骨髓中。在人骨髓培養(yǎng)物中持續(xù)存在的T-淋巴細(xì)胞已有報(bào)道(14，15)。NK細(xì)胞是另一種在骨髓中產(chǎn)生的淋巴細(xì)胞。
近來已建立了用于體外B-細(xì)胞淋巴細(xì)胞生成的人模型(6)。這是一種復(fù)雜的兩階段培養(yǎng)系統(tǒng)。在第一階段，在鼠基質(zhì)細(xì)胞系S17上(存在2-巰基乙醇)培養(yǎng)CD34+或CD34+CD38-臍帶血造血祖細(xì)胞，導(dǎo)致持續(xù)產(chǎn)生大量的早期B-細(xì)胞祖細(xì)胞。第二階段，在IL-10和IL-4存在下將純化的CD19+細(xì)胞轉(zhuǎn)到表達(dá)人CD40-配體的鼠成纖維細(xì)胞。這導(dǎo)致細(xì)胞增殖和IgM+細(xì)胞表面表型調(diào)整為與活化的成熟B細(xì)胞一致。
這種兩階段培養(yǎng)方法存在幾點(diǎn)缺陷。首先，其需要使用鼠基質(zhì)細(xì)胞系和用CD40配基轉(zhuǎn)化的鼠成纖維細(xì)胞。這造成了一種非人的非自然的環(huán)境。另外與Whitlock和Witte培養(yǎng)相同，培養(yǎng)基中需要2-巰基乙醇以產(chǎn)生早期B-細(xì)胞祖細(xì)胞。而且，需要特定的細(xì)胞因子(IL-1和IL-4)存在，而所述的細(xì)胞因子很可能扭轉(zhuǎn)淋巴細(xì)胞的生成。
目前，缺少一種用于研究淋巴細(xì)胞生成過程中復(fù)雜的細(xì)胞與細(xì)胞相互作用的、穩(wěn)定的一階段人淋巴細(xì)胞生成模型，該模型應(yīng)不僅能產(chǎn)生B-細(xì)胞還能夠產(chǎn)生骨髓中存在的其它細(xì)胞類型。本發(fā)明提供一種用于培養(yǎng)人造血干細(xì)胞的和基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中的基質(zhì)細(xì)胞可支持干細(xì)胞生長(zhǎng)和/或分化為各種淋巴細(xì)胞亞型的免疫系統(tǒng)細(xì)胞。
發(fā)明概述依照本發(fā)明，令人驚訝地發(fā)現(xiàn)在三維生物反應(yīng)器中將基質(zhì)和造血干細(xì)胞一起培養(yǎng)可以產(chǎn)生包括B-細(xì)胞，T-細(xì)胞，和NK-細(xì)胞在內(nèi)的所有淋巴細(xì)胞亞型。
本發(fā)明提供一種細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其包含用于培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞的三維支持物；和支持所述干細(xì)胞生長(zhǎng)和/或分化為免疫系統(tǒng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。
所述的造血干細(xì)胞可以選自骨髓干細(xì)胞，外周血干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，來自臍帶的干細(xì)胞和其他來源的干細(xì)胞。由從屬于所述細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)生的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的實(shí)例包括T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞，抗原呈遞細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞。
依照本發(fā)明所產(chǎn)生的T淋巴細(xì)胞的實(shí)例包括CD4+和CD8+細(xì)胞。利用本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)所產(chǎn)生的T淋巴細(xì)胞可具有αβ或γδT細(xì)胞受體。它們可以是初生的，活化的或記憶T淋巴細(xì)胞。
依照本發(fā)明所產(chǎn)生的B淋巴細(xì)胞的實(shí)例包括CD19+，CD20+和CD21+細(xì)胞。它們可以是IgM陽性，proB，preB，IgG陽性，漿細(xì)胞，和/或記憶B細(xì)胞。依照本發(fā)明所產(chǎn)生的抗原呈遞細(xì)胞的實(shí)例包括巨噬細(xì)胞和樹狀細(xì)胞。
在本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中所用的培養(yǎng)基可以包含細(xì)胞因子或其它分子?？梢杂糜谒雠囵B(yǎng)基中的細(xì)胞因子和其它分子包括例如，IL-2，IL-7，IL-12，slt-12，slt-3L，CD40L，IL4，IL10，IL6，BCF-1，和干細(xì)胞因子。
依照本發(fā)明，基質(zhì)和造血干細(xì)胞用于接種細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。在一另外的實(shí)施方案中，除基質(zhì)和造血干細(xì)胞外，非骨髓細(xì)胞也可以用于接種細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)?？梢詰?yīng)用的非骨髓細(xì)胞的實(shí)例包括，例如外周血免疫系統(tǒng)細(xì)胞。
本發(fā)明提供產(chǎn)生免疫系統(tǒng)細(xì)胞的方法，該方法包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，及使其生長(zhǎng)或分化為免疫系統(tǒng)細(xì)胞。
由本發(fā)明的方法所產(chǎn)生的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的實(shí)例包括，T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞，抗原呈遞細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞，初生細(xì)胞，活化細(xì)胞，記憶細(xì)胞和其祖細(xì)胞或前體細(xì)胞。
由本發(fā)明的方法所產(chǎn)生的T淋巴細(xì)胞的實(shí)例包括，例如CD4+，CD8+，CD3+和TdT+細(xì)胞。
由本發(fā)明的方法所產(chǎn)生的B淋巴細(xì)胞的實(shí)例包括，例如CD19+，CD20+，CD21+，CD10+，TdT+，CD5+，Ig+細(xì)胞，胞質(zhì)mu鏈+和漿細(xì)胞。
本發(fā)明還提供產(chǎn)生抗原特異性抗體的方法。所述的方法包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，及使其生長(zhǎng)或分化為免疫系統(tǒng)細(xì)胞；用抗原或其片段免疫培養(yǎng)物，鑒定由抗原特異性的培養(yǎng)系統(tǒng)所產(chǎn)生的抗體。在另一實(shí)施方案中，可在非骨髓細(xì)胞存在下培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞和造血干細(xì)胞。在生產(chǎn)抗原特異的抗體的方法中，抗原或其抗原性片段可以是碳水化合物，肽聚糖，蛋白，糖蛋白，或核酸分子。在優(yōu)選實(shí)施例中，所述的基質(zhì)細(xì)胞和造血干細(xì)胞是人細(xì)胞。依照本發(fā)明，抗原或其片段可與抗原呈遞細(xì)胞相結(jié)合。如果需要，抗原或其片段可以作為偶聯(lián)物呈遞。關(guān)于抗原特異性抗體的產(chǎn)生，培養(yǎng)物的免疫可以在佐劑參與下進(jìn)行。
還是對(duì)于產(chǎn)生抗原特異性的抗體，本發(fā)明還提供一種產(chǎn)生抗原特異性抗體的方法，其中，分離出可產(chǎn)生與所述抗原特異性結(jié)合的單克隆抗體的細(xì)胞系。
本發(fā)明還提供由所述的培養(yǎng)細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體。而且，本發(fā)明提供產(chǎn)生所述抗體的B細(xì)胞。也提供單克隆抗體和細(xì)胞系。
依照本發(fā)明，提供一種產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞的方法。該方法包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，及使其生長(zhǎng)或分化為免疫系統(tǒng)細(xì)胞；用抗原或其片段免疫培養(yǎng)物，鑒定由抗原特異性的培養(yǎng)系統(tǒng)所產(chǎn)生的T細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，可在非骨髓細(xì)胞存在下培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞和造血干細(xì)胞。可用于免疫培養(yǎng)物的抗原或其抗原性片段可以是碳水化合物，肽聚糖，蛋白，糖蛋白，或核酸分子。所述抗原也可以是病毒抗原或腫瘤抗原?？乖蚱淦慰膳c抗原呈遞細(xì)胞相結(jié)合和/或作為偶聯(lián)物呈遞。如果需要，所述免疫可以在佐劑參與下進(jìn)行。
本發(fā)明還提供生產(chǎn)樹狀細(xì)胞的方法，其包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，及使其生長(zhǎng)或分化為樹狀細(xì)胞?？稍诜枪撬杓?xì)胞存在下培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞和造血干細(xì)胞。依照本發(fā)明的方法所產(chǎn)生的樹狀細(xì)胞可以包括，例如，來自骨髓樣前體的樹狀細(xì)胞或來自淋巴樣前體的樹狀細(xì)胞。如果需要，可以選擇性富集培養(yǎng)物中的樹狀細(xì)胞。另外，樹狀細(xì)胞的產(chǎn)生可以通過向培養(yǎng)物中添加一種或多種樹狀特異的細(xì)胞因子予以加強(qiáng)。
樹狀特異的細(xì)胞因子的實(shí)例包括IL-4，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子，干細(xì)胞因子，和fms-樣酪氨酸激酶3配體(flt-3L)。還提供由所述方法產(chǎn)生的樹狀細(xì)胞和由樹狀細(xì)胞衍生的細(xì)胞系。
在本發(fā)明的另一方面，還提供檢測(cè)疫苗的方法。所述的方法包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，及使其生長(zhǎng)或分化為免疫系統(tǒng)細(xì)胞；對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞施用疫苗；然后確定所述疫苗是否誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。如果需要，可以確定所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的類型。需要時(shí)可在非骨髓細(xì)胞存在下培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞和造血干細(xì)胞。在需要時(shí)檢測(cè)疫苗包括利用由一個(gè)以上人種的個(gè)體獲得的細(xì)胞進(jìn)行功效篩選。
本發(fā)明的又一方面，提供鑒定與免疫系統(tǒng)細(xì)胞發(fā)育和功能相關(guān)的基因的方法。該方法包括改變?cè)煅杉?xì)胞中基因的表達(dá)；在三維支物上培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞和造血干細(xì)胞；確定是否基因表達(dá)的改變導(dǎo)致培養(yǎng)細(xì)胞表型的改變。需要時(shí)可在非骨髓細(xì)胞存在下培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞和造血干細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步提供與免疫系統(tǒng)細(xì)胞發(fā)育和功能相關(guān)的基因的篩選方法。該方法包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞和造血干細(xì)胞的步驟；及利用基因克隆技術(shù)鑒定培養(yǎng)細(xì)胞所表達(dá)的基因。需要時(shí)可在非骨髓細(xì)胞存在下培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞和造血干細(xì)胞。在另一實(shí)施方式中，除上述步驟外，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞或非免疫細(xì)胞或未分化細(xì)胞間進(jìn)行進(jìn)行基因表達(dá)的比較。例如，可在培養(yǎng)細(xì)胞和具有不同免疫細(xì)胞譜的培養(yǎng)細(xì)胞之間進(jìn)行基因表達(dá)的比較。
在相關(guān)的實(shí)施方式中，在培養(yǎng)的造血干細(xì)胞和非免疫產(chǎn)生的培養(yǎng)物之間進(jìn)行基因表達(dá)的比較，并鑒定了第一、二種培養(yǎng)物間表達(dá)發(fā)生改變的基因。
在本發(fā)明的又一實(shí)施例中，提供一種確定藥物毒性的方法。該方法包括下述步驟在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，及使其生長(zhǎng)或分化為免疫系統(tǒng)細(xì)胞；對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞施用所述藥物；確定是否所施用的藥物對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞具有毒性。需要時(shí)可在非骨髓細(xì)胞存在下培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞和造血干細(xì)胞。本發(fā)明還提供經(jīng)前述方法處理仍存活的細(xì)胞。
本發(fā)明還提供確定一種藥物效力的方法。該方法包括下述步驟在三維支持物上培養(yǎng)骨髓細(xì)胞，及使其生長(zhǎng)或分化為免疫系統(tǒng)細(xì)胞；對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞施用所述藥物；確定所述藥物是否導(dǎo)致培養(yǎng)細(xì)胞的表型改變。需要時(shí)可在非骨髓細(xì)胞存在下培養(yǎng)骨髓細(xì)胞。
在該方法的一種實(shí)施方式中，所述藥物可以增進(jìn)免疫系統(tǒng)細(xì)胞的生成。同時(shí)提供在上述確定藥物功效的方法中存活的細(xì)胞。
在該方法的另一實(shí)施方式中，所述的藥物抑制免疫系統(tǒng)細(xì)胞的增殖。
在進(jìn)行確定藥物功效的方法中適用的藥物的實(shí)例包括如核酸，經(jīng)修飾的核酸，抗體，化學(xué)治療試劑，和細(xì)胞因子。
本發(fā)明還提供一種基因治療的方法。該方法包括下述步驟在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，及使其生長(zhǎng)或分化為免疫系統(tǒng)細(xì)胞；對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞施用某種基因。需要時(shí)可在非骨髓細(xì)胞存在下培養(yǎng)骨髓細(xì)胞。在可供選擇的實(shí)施方案中，所述的培養(yǎng)物中可以包括輔助細(xì)胞，該輔助細(xì)胞帶有包含待導(dǎo)入基因的載體。而且，所述基因可以靶向免疫系統(tǒng)細(xì)胞。在相關(guān)的實(shí)施方案中，提供基因轉(zhuǎn)化后所得的培養(yǎng)細(xì)胞。在相關(guān)的方法中轉(zhuǎn)入了基因的培養(yǎng)細(xì)胞可以引入病人中。
本發(fā)明還提供一種監(jiān)控HIV感染進(jìn)程的方法。該方法包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，及使其生長(zhǎng)或分化為免疫系統(tǒng)細(xì)胞；向所培養(yǎng)的細(xì)胞中引入HIV病毒；監(jiān)控HIV在培養(yǎng)細(xì)胞中的數(shù)量和定位。需要時(shí)可在非骨髓細(xì)胞存在下培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞和造血干細(xì)胞。
在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，提供測(cè)定抑制或治療HIV的藥物的方法。該方法包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，及使其生長(zhǎng)或分化為免疫系統(tǒng)細(xì)胞；向所培養(yǎng)的細(xì)胞中引入HIV病毒；對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞施用某種藥物；監(jiān)控HIV在培養(yǎng)細(xì)胞中的的數(shù)量和定位。需要時(shí)可在非骨髓細(xì)胞存在下培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞和造血干細(xì)胞。所述的藥物可在HIV引入培養(yǎng)細(xì)胞之前，期間或之后施用。
本發(fā)明還提供一種對(duì)病人的治療方法，該方法包括對(duì)所述病人施用有效劑量的在三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中產(chǎn)生的任意免疫系統(tǒng)細(xì)胞的步驟。這種免疫系統(tǒng)細(xì)胞的實(shí)例包括T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞，抗原呈遞細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞，初生細(xì)胞，活化細(xì)胞，記憶細(xì)胞，及其祖細(xì)胞或前體細(xì)胞。上述細(xì)胞可以以任意組合施用。需要時(shí)也可以只施用上述細(xì)胞類型中的一種。
因此，T淋巴細(xì)胞，例如CD4+，CD8+，或CD3+細(xì)胞可施用于病人。B淋巴細(xì)胞，例如CD19+，CD20+或CD21+細(xì)胞也可以施用于病人?？乖蔬f細(xì)胞，例如巨噬細(xì)胞或樹狀細(xì)胞也可以施用。B細(xì)胞，如漿細(xì)胞或記憶細(xì)胞也可以施用于病人。
由本發(fā)明的三維生物反應(yīng)器產(chǎn)生的免疫系統(tǒng)細(xì)胞可以有效劑量施用于病人。以“有效劑量”是指能有效地治療病人的劑量。此處所用的“治療”包括預(yù)防或改善病人的病癥。因此，易患或已患任何免疫系統(tǒng)疾病或機(jī)能紊亂的病人，均可施用有效劑量的本發(fā)明的免疫系統(tǒng)細(xì)胞，以預(yù)防或改善所患疾病或機(jī)能紊亂。類似地，可以有效劑量對(duì)病人施用在本發(fā)明的藥物毒性和藥物功效分析中存活的細(xì)胞。
也可以通過對(duì)病人施用本發(fā)明的生產(chǎn)抗原特異性抗體的方法中所得的抗體進(jìn)行治療。
本申請(qǐng)的實(shí)施例中使用的是骨髓干細(xì)胞，但顯而易見用外周血干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞和其它類型的干細(xì)胞均可替換骨髓干細(xì)胞。


圖1a是三維生物反應(yīng)器可能的構(gòu)型圖。在此處的構(gòu)型圖中，多孔的或纖維性的臺(tái)架位于培養(yǎng)室中。
圖1b是用作生物反應(yīng)器中的人工臺(tái)架的大孔纖維素微球體的電子顯微掃描圖。
圖2是0到4周在三維人骨髓模型中CD10抗原表達(dá)的流式細(xì)胞分析數(shù)據(jù)。
圖3是0到4周在三維人骨髓模型中CD19和CD20抗原表達(dá)的流式細(xì)胞分析數(shù)據(jù)。
圖4是0到4周在三維人骨髓模型中CD19和CD21抗原表達(dá)的流式細(xì)胞分析數(shù)據(jù)。
圖5A是在3-D反應(yīng)器中培養(yǎng)一周的TdT-陽性(箭頭記號(hào))淋巴祖細(xì)胞的顯微照片。核仁的TdT被染成紅色。
圖5B是表示由細(xì)胞質(zhì)μ鏈(抗體的重鏈，5.5周)染成紅色的pre-B淋巴細(xì)胞(前B淋巴細(xì)胞)(箭頭)的顯微照片。
圖5C是在第4周，受LPS-刺激由分泌IgG的B-淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的斑點(diǎn)的顯微照片，這表明培養(yǎng)物中的B-淋巴細(xì)胞是功能性的。
圖5D是圖5C的高倍放大圖。
圖6是0到4周在三維人骨髓模型中CD3，CD4，和CD8抗原表達(dá)的流式細(xì)胞分析數(shù)據(jù)。
圖7a和7b是人三維培養(yǎng)系統(tǒng)的細(xì)胞產(chǎn)量動(dòng)力學(xué)圖示。圖7a是每次抽樣中獲得的活性細(xì)胞產(chǎn)量。圖7b是累計(jì)的活性細(xì)胞產(chǎn)量。所用的細(xì)胞因子是rh IL-2(1000U/ml)，rh IL-7(2ng/ml)，和rh SCF(50ng/ml)。取樣后培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞數(shù)下降未作校正。每批培養(yǎng)物接種6個(gè)培養(yǎng)室。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖8是在不存在淋巴因子的條件下，在3D骨髓培養(yǎng)物中CD3，CD4，和CD8抗原表達(dá)的流式血細(xì)胞分析結(jié)果的圖示說明。外周血單核細(xì)胞用PBMNC表示，新鮮骨髓用FBM表示。
圖9是存在淋巴因子的條件下，在3D骨髓培養(yǎng)物中CD3，CD4，和CD8抗原表達(dá)的流式血細(xì)胞分析結(jié)果的圖示說明。所加入的細(xì)胞因子是rSCF(50ng/ml)，rh IL-2(1000U/ml)，和rh IL-7(2ng/ml)。外周血單核細(xì)胞用PBMNC表示，新鮮骨髓用FBM表示。
圖10是在不存在淋巴因子的條件下，在3D骨髓培養(yǎng)物中CD3，TCRaβ，和TCRγδ抗原表達(dá)的流式血細(xì)胞分析結(jié)果的圖示說明。
圖11是存在淋巴因子的條件下，在3D骨髓培養(yǎng)物中CD3，TCRaβ，和TCRγδ抗原表達(dá)的流式血細(xì)胞分析結(jié)果的圖示說明。
圖12a是存在或不存在氫化可的松的條件下，在人3D骨髓培養(yǎng)物中每次抽樣獲得的活性細(xì)胞產(chǎn)量的圖示說明。在第10天，將氫化可的松從培養(yǎng)基中去除。取樣后培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞數(shù)下降未作校正。每批培養(yǎng)物接種6個(gè)培養(yǎng)室。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖12b是累計(jì)的活性細(xì)胞產(chǎn)量。在第10天，將氫化可的松從培養(yǎng)基中去除。取樣后培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞數(shù)下降未作校正。每批培養(yǎng)物接種6個(gè)培養(yǎng)室。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖13a是存在(w)或不存在(w/o)氫化可的松的條件下，對(duì)來自人3-D骨髓培養(yǎng)物的培養(yǎng)4周的粘著細(xì)胞進(jìn)行RNA任意引物-PCR(RAP-PCR)，差別基因顯示產(chǎn)物的凝膠照片。箭頭指示HRI基因片段(682bp)的位置。MW代表分子量標(biāo)記。
圖13b是與圖13a中相同的一塊膠的照片，但切除了差示表達(dá)的基因。
圖14是在3D骨髓培養(yǎng)物中的細(xì)胞產(chǎn)量動(dòng)力學(xué)的圖示說明。曲線表示每次抽樣獲得的活性細(xì)胞產(chǎn)量。取樣后培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞數(shù)下降未作校正。每批培養(yǎng)物接種6個(gè)培養(yǎng)室。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。添加了包含動(dòng)物血清的培養(yǎng)基的對(duì)照培養(yǎng)物由CM表示；用含5％自體固有的血漿的培養(yǎng)基飼育的培養(yǎng)物表示為5％HP；用含10％自體固有的血漿的培養(yǎng)基飼育的培養(yǎng)物表示為10％HP。
圖15是三維人骨髓模型中CD19(不成熟的B細(xì)胞)和CD3(T細(xì)胞)抗原表達(dá)的流式血細(xì)胞計(jì)數(shù)分析數(shù)據(jù)。用添加有動(dòng)物血清的培養(yǎng)基飼育的培養(yǎng)物表示為CM；用添加有10％人血漿的培養(yǎng)基飼育的培養(yǎng)物表示為10％HP。
圖16是三維人骨髓模型中CD19(不成熟的B細(xì)胞)和CD3(T細(xì)胞)抗原表達(dá)的流式血細(xì)胞計(jì)數(shù)分析數(shù)據(jù)的圖示說明。外周血單核細(xì)胞表示為PBMNC；用添加了動(dòng)物血清的培養(yǎng)基飼育的培養(yǎng)物表示為CM；用含5％自體固有的血漿的培養(yǎng)基飼育的培養(yǎng)物表示為5％HP；用含10％自體固有的血漿的培養(yǎng)基飼育的培養(yǎng)物表示為10％HP。
圖17a是從人三維骨髓培養(yǎng)物中回收的非粘連紅細(xì)胞的差示細(xì)胞產(chǎn)量動(dòng)力學(xué)圖示說明。所述的差示細(xì)胞分析是通過在每份樣品中無目的地?cái)?shù)出100個(gè)細(xì)胞進(jìn)行的。用添加了動(dòng)物血清的培養(yǎng)基飼育的培養(yǎng)物表示為CM；用含10％自體固有的血漿的培養(yǎng)基飼育的培養(yǎng)物表示為10％HP。
圖17b是從人三維骨髓培養(yǎng)物中回收的非粘連骨髓細(xì)胞的差示細(xì)胞產(chǎn)量動(dòng)力學(xué)。依照?qǐng)D17a中描述的進(jìn)行分析和標(biāo)記。
圖17c是從人三維骨髓培養(yǎng)物中回收的非粘連淋巴細(xì)胞的差示細(xì)胞產(chǎn)量動(dòng)力學(xué)。依照?qǐng)D17a中描述的進(jìn)行分析和標(biāo)記。
發(fā)明詳述依照本發(fā)明令人驚訝地發(fā)現(xiàn)所有的淋巴細(xì)胞亞型包括B-細(xì)胞，T-細(xì)胞，和NK-細(xì)胞，均可在用基質(zhì)細(xì)胞和造血干細(xì)胞接種的三維生物反應(yīng)器中產(chǎn)生。
由此本發(fā)明提供一種細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含培養(yǎng)造血干細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的三維支持物，支持干細(xì)胞生長(zhǎng)或分化為免疫系統(tǒng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。此處所用到的″免疫系統(tǒng)細(xì)胞″指包括T淋巴細(xì)胞(T-細(xì)胞)，B淋巴細(xì)胞(B-細(xì)胞)，抗原呈遞細(xì)胞，和自然殺傷細(xì)胞(NK-細(xì)胞)。
所述的培養(yǎng)系統(tǒng)包括浸有或環(huán)繞有培養(yǎng)基的帶臺(tái)架的小室或容器，其中，所述的臺(tái)架可使造血干細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞在三維空間進(jìn)行細(xì)胞間的接觸。
這里所用到的術(shù)語“造血干細(xì)胞”骨髓干細(xì)胞，外周血干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，臍帶血干細(xì)胞和其它類型的干細(xì)胞。此處所用到的，″基質(zhì)細(xì)胞″可以包括內(nèi)皮細(xì)胞，網(wǎng)狀細(xì)胞，脂肪細(xì)胞和專門的抗原呈遞細(xì)胞，如樹狀細(xì)胞。所述基質(zhì)細(xì)胞可以是從不同來源分離得到的，如成人或胎兒的骨髓，脾，胸腺，外周血，肝，臍帶，主動(dòng)脈旁的胚臟壁，主動(dòng)脈，生殖腺和中腎(AGM)，淋巴結(jié)，和其它類型的基質(zhì)細(xì)胞；或由下述干細(xì)胞衍生的如，骨髓干細(xì)胞，外周血細(xì)胞，外周血干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，臍帶細(xì)胞，臍帶血干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，或其它類型的干細(xì)胞，或這些細(xì)胞的任意組合。
本發(fā)明提供生物反應(yīng)器系統(tǒng)和產(chǎn)生免疫系統(tǒng)細(xì)胞的方法。本發(fā)明的生物反應(yīng)器具有三維結(jié)構(gòu)，其模仿天然的胞外基質(zhì)和骨髓豐富的表面區(qū)域，允許細(xì)胞在組織樣細(xì)胞密度下進(jìn)行細(xì)胞間相互作用。可知本發(fā)明的生物反應(yīng)器可以具有提供三維結(jié)構(gòu)的不同構(gòu)型。關(guān)于生物反應(yīng)器，所用術(shù)語“三維結(jié)構(gòu)”可與術(shù)語“臺(tái)架”互換。
用于產(chǎn)生免疫系統(tǒng)細(xì)胞的生物反應(yīng)器包括具有至少一個(gè)其中帶有臺(tái)架的小室的容器或脈管。臺(tái)架由多孔的或纖維性的基質(zhì)構(gòu)成。培養(yǎng)基覆蓋或環(huán)繞于多孔的或纖維性的基質(zhì)。
圖1a舉例說明了用于產(chǎn)生免疫系統(tǒng)細(xì)胞的生物反應(yīng)器的一種可能的構(gòu)型。在圖1中多孔的或纖維性的臺(tái)架位于下層培養(yǎng)室中?？芍景l(fā)明的生物反應(yīng)器可以具有提供三維結(jié)構(gòu)(臺(tái)架)的多種構(gòu)型。
容器或脈管的壁可由多種材料如玻璃，陶瓷，聚碳酸酯，乙烯基，聚乙烯基氯化物(PVC)，金屬等材料構(gòu)成。支持免疫系統(tǒng)細(xì)胞生長(zhǎng)和/或造血干細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分化為免疫系統(tǒng)細(xì)胞的培養(yǎng)基覆蓋和/或環(huán)繞于多孔的或纖維性的材料。
多種不同的多孔或纖維性材料可用作生物反應(yīng)器中的臺(tái)架，例如，纏結(jié)的纖維，多孔顆粒，海綿，或海綿樣材料，多孔的或纖維性的臺(tái)架可使造血干細(xì)胞和/或基質(zhì)細(xì)胞存放，增殖和分化。為舉例但并不局限于此，合適的臺(tái)架可由多種材料制備，包括天然聚合物，如多糖和纖維蛋白，合成聚合物，如聚酰胺(尼龍)，聚酯，聚氨基甲酸乙酯，可降解的聚合物，如PGA，PGLA，和礦物質(zhì)，包括陶瓷，金屬，珊瑚，明膠，聚丙烯酰胺，棉花，玻璃纖維，corrageenans，藻酸鹽，幾丁質(zhì)，和葡聚糖。纏結(jié)纖維的例子包括玻璃棉，鋼絨和金屬絲或纖維網(wǎng)。
多孔顆粒的例子包括，如珠粒，膠塊，立方體，和圓柱體(由玻璃，塑料等制成的)纖維素，瓊脂，羥基磷灰石，經(jīng)處理或未經(jīng)處理的骨頭，膠原，凝膠，如聚丙烯酰胺葡聚糖(Sephacryl)，交聯(lián)葡聚糖(Sephadex)，瓊脂糖凝膠(Sepharose)，瓊脂糖或聚丙烯酰胺。
“經(jīng)處理的”骨頭易于被不同的化學(xué)制劑，如酸或堿溶液處理。這種處理改變了骨的多孔性。需要時(shí)上述物質(zhì)可以用胞外基質(zhì)或基質(zhì)如，膠原，matrigel，粘連蛋白，肝素硫酸酯，hyalumonic和軟骨素硫酸酯，昆布寧，hemonectin，或蛋白多糖所包被。
用作生物反應(yīng)器中的臺(tái)架的纖維性或多孔材料形成干細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞可以進(jìn)入的縫隙或小孔。一旦進(jìn)入，所述細(xì)胞即被捕獲或黏附于纖維性或多孔材料中，植入或聚集于其上。細(xì)胞的附著或植入僅通過將細(xì)胞接種于覆蓋或環(huán)繞于多孔或纖維性材料的培養(yǎng)基中而發(fā)生。
依照本發(fā)明造血干細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞必須能夠進(jìn)入縫隙(小孔)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道造血干細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的不同大小從而了解與這些細(xì)胞相適應(yīng)的小孔的大小。一般來說，所用的小孔的大小在約15微米到約1000微米。優(yōu)選地，小孔的大小在約100微米到約300微米的范圍。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將隔膜置于生物反應(yīng)器中以利于氣體交換。所述的隔膜是氣體透過性的，其厚度在約10到100μm的范圍之間。在一更優(yōu)選的實(shí)施例中，隔膜的厚度為約50μm。所述的膜置于小室或容器的底部或側(cè)面的開口上。為防止生物反應(yīng)器中的介質(zhì)和細(xì)胞的過分泄露，在開口的周圍設(shè)置密封襯墊和/或在開口的底部或旁邊設(shè)置固體盤并進(jìn)行緊固裝配。
生物反應(yīng)器中所用的細(xì)胞培養(yǎng)基可以是已知的任何一種用于支持骨髓細(xì)胞生長(zhǎng)和/或分化，特別是造血干細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化成免疫系統(tǒng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。例如，可以使用下列標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基，需要時(shí)可以添加維生素和氨基酸溶液，血清，和/或抗生素Fisher′s培養(yǎng)基(Gibco)，Eagle基礎(chǔ)培養(yǎng)基(BME)，Dulbecco氏改良的Eagle培養(yǎng)基(D-MEM)，Iscoves′s改良的Dulbecco氏培養(yǎng)基，極限必須培養(yǎng)基(MEM)，McCoy′s 5A培養(yǎng)基，和RPMI培養(yǎng)基。
也可以使用特定的培養(yǎng)基，例如，StemSpan SFEMTM(干細(xì)胞技術(shù))，StemPro 34 SFM(生物技術(shù))和Marrow-Gro(Quality生物公司)。
在一優(yōu)選實(shí)施方式中，用約70％v/v的McCoy′s 5A培養(yǎng)基(Gibco)，添加維生素和氨基酸溶液。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的培養(yǎng)基包括約70％(v/v)的McCoy′s 5A培養(yǎng)基(Gibco)，添加有約1×10-6M氫化可的松，約50ug/ml青霉素，約50mg/ml鏈霉素，約0.2mM L-谷氨酰胺，約0.45％碳酸氫鈉，約I×MEM丙酮酸鈉，約I×MEM維生素溶液，約0.4×MEM氨基溶液，約12.5％(v/v)熱滅活的馬血清和約12.5％熱滅活的FBS。需要時(shí)將培養(yǎng)基連續(xù)灌注于小室中。溶氧濃度和培養(yǎng)基的pH通過已知的方法控制。
將造血干細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞通過輕柔的加入方式，如移液管接種到生物反應(yīng)器的三維臺(tái)架部分?；蛘撸龅脑煅杉?xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞可以添加到覆蓋或環(huán)繞三維臺(tái)架的培養(yǎng)物中。細(xì)胞將定植或移植到多孔或纖維性的材料中形成臺(tái)架。添加到生物反應(yīng)器中的細(xì)胞的數(shù)量依三維臺(tái)架的總面積和培養(yǎng)基的體積而定。優(yōu)選地，自此處所廣泛討論的來源中分離造血干細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，通過梯度離心，如Ficol/Paque，去除成熟的紅細(xì)胞，收獲單核細(xì)胞。
對(duì)于具有約3/16″高約5/16″寬和約5/16″長(zhǎng)培養(yǎng)小室，填充了約0.01g多孔或纖維性的物質(zhì)的生物反應(yīng)器，添加到其中的單核細(xì)胞的數(shù)量可在104到109范圍內(nèi)。優(yōu)選地，可接種4-6×106細(xì)胞到生物反應(yīng)器中。根據(jù)上述指導(dǎo)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)三維臺(tái)架的總面積，培養(yǎng)基的體積，三維臺(tái)架的類型和造血干細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的來源調(diào)節(jié)接種到生物反應(yīng)器中的細(xì)胞的數(shù)量。
可每?jī)商煜蚺囵B(yǎng)物中添加培養(yǎng)基。多種其它成分也可以添加到培養(yǎng)基中。這樣的培養(yǎng)基在此處稱為“補(bǔ)充的”。
所述的培養(yǎng)基可以包含細(xì)胞因子，胞外基質(zhì)或其它生物活性分子。例如，重組的干細(xì)胞因子(rSCF)，和淋巴細(xì)胞特異的淋巴因子，白細(xì)胞介素2(rh IL-2)，白細(xì)胞介素7均可以添加到培養(yǎng)基中。例如添加的rSCF的量可以約為50ng/ml。添加的IL-2的量可以約為1000U每m1。添加的IL-7的量可以約為2ng/ml。上述的量均為示范性和經(jīng)驗(yàn)性的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)相應(yīng)生物反應(yīng)器的設(shè)置，即大小，容積，細(xì)胞的來源和細(xì)胞數(shù)量變換細(xì)胞因子的用量。在一優(yōu)選的實(shí)施例中，每天將非補(bǔ)充培養(yǎng)基添加到培養(yǎng)物中，每?jī)商鞂⒀a(bǔ)充培養(yǎng)基添加到培養(yǎng)物中。
細(xì)胞培養(yǎng)物可以生長(zhǎng)幾天到幾周。優(yōu)選地，在一周到四或五周后收獲培養(yǎng)物。氫化可的松優(yōu)選在培養(yǎng)一到三周的任意時(shí)間從培養(yǎng)物中去除，以防止其對(duì)免疫系統(tǒng)細(xì)胞分化的潛在抑制。在另一實(shí)施方案中，氫化可的松根本不添加到培養(yǎng)基中。
本發(fā)明提供培養(yǎng)免疫系統(tǒng)細(xì)胞的方法，其包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，及使其生長(zhǎng)或分化為免疫系統(tǒng)細(xì)胞。
由本發(fā)明的方法產(chǎn)生的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的例子包括T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞，抗原呈遞細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞，初生細(xì)胞，活化細(xì)胞，記憶細(xì)胞，和其祖細(xì)胞或前體細(xì)胞。
由本發(fā)明的方法所產(chǎn)生的T淋巴細(xì)胞的例子包括CD4+，CD8+，CD3+，和TdT+細(xì)胞。
由本發(fā)明的方法所產(chǎn)生的B淋巴細(xì)胞的例子包括CD19+，CD20+，CD21+，CD10+，TdT+，CD5+，Ig+，胞漿mu鏈+和漿細(xì)胞。
可以用任何已知的方法收獲免疫細(xì)胞?？捎煤线m的試劑，如膠原酶處理小室以釋放黏附的細(xì)胞。非黏附細(xì)胞可在其釋放到培養(yǎng)基中后予以收集。細(xì)胞也可以通過如搖動(dòng)，振蕩等物理的方式從基質(zhì)上釋放出來。因此，可以用任何本領(lǐng)域已知的方法如，移液或離心來收集細(xì)胞。優(yōu)選地，對(duì)于非黏附細(xì)胞可以通過輕柔地?cái)噭?dòng)混合多孔或纖維性的底座將其釋放出來，然后通過離心或沉降的方式收集。
需要時(shí)，從生物反應(yīng)器上收集的細(xì)胞樣品可進(jìn)一步通過本領(lǐng)域已知的正篩選方法進(jìn)行富集。例如將具有可與免疫細(xì)胞相結(jié)合的抗體的固體支持物(如小珠)與細(xì)胞樣品相混合。通過這種方式可將三種類型的免疫細(xì)胞一起或分別分離出來。如果需要一個(gè)混合的淋巴細(xì)胞群，則固體支持物上可以連接針對(duì)所有亞型的抗體。如果需要一個(gè)特定的亞型，則固體支持物上連接可與特定淋巴細(xì)胞亞型相結(jié)合的抗體?？捎糜谶B接到固體支持物上的抗體的例子有抗-CD3+，抗-CD4+(對(duì)于輔助T-細(xì)胞)，抗-CD8+(對(duì)于細(xì)胞毒性T細(xì)胞)，抗-CD19+(對(duì)于不成熟的B-細(xì)胞)，抗-CD19+，抗-CD20+(對(duì)于成熟B-細(xì)胞)抗TdT抗胞漿，抗-表面IgG和抗-表面IgM(對(duì)抗原激活的B-細(xì)胞)。
連接有結(jié)合了免疫系統(tǒng)細(xì)胞的抗體的小珠通過重力或其他方式，對(duì)于磁珠如磁力收集起來。
免疫系統(tǒng)細(xì)胞可用已知的方法進(jìn)行鑒定，例如流式細(xì)胞記數(shù)分析，免疫細(xì)胞化學(xué)，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)，和對(duì)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。這些方法是已知的且在此處有所描述。
本發(fā)明所培養(yǎng)的免疫系統(tǒng)細(xì)胞在治療，診斷和臨床應(yīng)用方面有多種用途。例如，本發(fā)明的免疫系統(tǒng)細(xì)胞可用于產(chǎn)生抗原特異性的抗體。這樣依照本發(fā)明還提供產(chǎn)生抗原特異性抗體的方法。該方法包括在三維支持物上，在足以使其生長(zhǎng)和/或分化成免疫系統(tǒng)細(xì)胞的條件下對(duì)基質(zhì)細(xì)胞和造血干細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間；用抗原或其抗原性片段免疫培養(yǎng)物，和鑒定由所述培養(yǎng)系統(tǒng)所產(chǎn)生的抗體是抗原特異性的。所述的抗原或其抗原性片段包括，例如碳水化合物，肽聚糖，蛋白，糖蛋白，病毒，組織團(tuán)塊，細(xì)胞，細(xì)胞碎片，或核酸分子。所述的病毒，組織團(tuán)塊，細(xì)胞碎片可以是活的或者是死的。任何可以誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的物質(zhì)均可使用。實(shí)施例3描述了用脂多糖(LPS)免疫本發(fā)明的免疫系統(tǒng)而產(chǎn)生抗體。
免疫細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的且有所描述，例如在免疫學(xué)基礎(chǔ)1993，Raven出版社，紐約，W.E.Paul，編在此全文引入作為參考。鑒定抗原特異性抗體的方法也是已知的，其包括例如，ELISA，ELISPOT，和PCR。
造血干細(xì)胞可以是如前所述的，例如骨髓干細(xì)胞。但其它細(xì)胞如外周血干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，臍帶血干細(xì)胞，和其他來源的干細(xì)胞均可以應(yīng)用。優(yōu)選的造血干細(xì)胞是是人細(xì)胞。需要時(shí)，抗原或其抗原性片段可以結(jié)合抗原呈遞細(xì)胞施用。另外，抗原和抗原片段也可以偶聯(lián)物的形式呈遞。偶聯(lián)物的例子包括白喉和破傷風(fēng)oxoids。需要的情況下免疫可在佐劑參與下進(jìn)行。可用于本發(fā)明的佐劑的例子包括弗氏佐劑。
依照本發(fā)明還提供應(yīng)用上述方法產(chǎn)生的抗體。單克隆抗體通常由已知的方法制備，如最初由Milstein和Kohler(1975)自然256495-497上所描述的方法。在公知的程序中，用抗原或其片段注射小鼠或其他合適的動(dòng)物。接下來處死上述動(dòng)物，將其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞相融合產(chǎn)生雜交瘤。依照本發(fā)明的方法，從生物反應(yīng)器中移走的產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞經(jīng)過篩選以分離出單獨(dú)的可分泌對(duì)所述抗原特異的單一抗體的細(xì)胞。由此衍生出分泌單克隆抗體的細(xì)胞系。
產(chǎn)生所述抗體的B細(xì)胞或B細(xì)胞系可用已知的方法分離，例如在免疫學(xué)基礎(chǔ)1993，Raven出版社，紐約，W.E.Paul，編中描述的方法。
本發(fā)明還提供產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞的方法。該方法包括下述步驟在三維支持物上，在足以使其生長(zhǎng)和/或分化成免疫系統(tǒng)細(xì)胞的條件下對(duì)基質(zhì)細(xì)胞和造血干細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間；用抗原或其抗原性片段免疫培養(yǎng)物，和鑒定由所述培養(yǎng)物所產(chǎn)生的T細(xì)胞是否是抗原特異性的?？捎帽绢I(lǐng)域已知的方法對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行鑒定，如T細(xì)胞受體的免疫細(xì)胞化學(xué)方法。例如用對(duì)CD4+，CD8+，αβ，γδ的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定T細(xì)胞。
在產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞的方法中，用于免疫培養(yǎng)物的抗原或抗原性片段可以是碳水化合物，肽聚糖，蛋白，糖蛋白，病毒，組織團(tuán)塊，細(xì)胞，細(xì)胞碎片，或核酸分子。所述的病毒，組織團(tuán)塊，細(xì)胞碎片可以是活的或者是死的。所述的抗原可以是病毒抗原也可以是腫瘤抗原。
造血干細(xì)胞可以是例如，前面所描述的骨髓細(xì)胞。但其它細(xì)胞，如外周血干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，臍帶血干細(xì)胞或其他來源的干細(xì)胞均可使用。優(yōu)選地，所述造血干細(xì)胞是人細(xì)胞。需要時(shí)，抗原或其抗原性片段可以結(jié)合抗原呈遞細(xì)胞施用。另外，抗原和抗原片段也可以偶聯(lián)物的形式呈遞。偶聯(lián)物的例子包括白喉和破傷風(fēng)oxoids。所述的免疫可在佐劑參與下進(jìn)行，如弗氏佐劑。
依照本發(fā)明也提供產(chǎn)生樹狀細(xì)胞的方法。該方法包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，及使其生長(zhǎng)或分化為樹狀細(xì)胞。如前面所描述的，造血干細(xì)胞可以是例如，骨髓細(xì)胞。但其它細(xì)胞，如外周血干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，臍帶血干細(xì)胞或其他來源的干細(xì)胞均可使用。優(yōu)選地，所述造血干細(xì)胞是人細(xì)胞。需要時(shí)，培養(yǎng)造血干細(xì)胞可以在非骨髓細(xì)胞存在下進(jìn)行。
由本發(fā)明的方法所產(chǎn)生的樹狀細(xì)胞的例子包括例如來自骨髓樣前體的樹狀細(xì)胞或來自淋巴樣前體的樹狀細(xì)胞。
需要時(shí)，在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，及使其生長(zhǎng)或分化為樹狀細(xì)胞后，樹狀細(xì)胞群可經(jīng)過選擇性地富集。可以通過向培養(yǎng)物中添加樹狀特異的細(xì)胞因子對(duì)樹狀細(xì)胞進(jìn)行選擇性地促進(jìn)。樹狀特異的細(xì)胞因子的例子包括IL-4，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子，干細(xì)胞因子，和fms-樣酪氨酸激酶3配體。
本發(fā)明還提供由在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，及使其生長(zhǎng)和/或分化為樹狀細(xì)胞的方法所產(chǎn)生的樹狀細(xì)胞。同樣的，本發(fā)明還提供由在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，及使其生長(zhǎng)和/或分化為樹狀細(xì)胞的方法所產(chǎn)生的樹狀細(xì)胞系，并通過向培養(yǎng)基中添加樹狀細(xì)胞特異的細(xì)胞因子增進(jìn)該樹狀細(xì)胞系的產(chǎn)生。由本發(fā)明的方法所產(chǎn)生的樹狀細(xì)胞系可以通過諸如利用免疫磁力分離方法進(jìn)行負(fù)篩選。
依照本發(fā)明還提供疫苗的檢測(cè)方法。該方法包括下述步驟在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，及使其生長(zhǎng)和/或分化為免疫系統(tǒng)細(xì)胞，將疫苗施用于所培養(yǎng)的細(xì)胞，確定所加入的疫苗是否引起免疫應(yīng)答。需要時(shí)，可在非骨髓細(xì)胞存在下培養(yǎng)造血干細(xì)胞。此處所用到的，“疫苗”是指任何可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答即激活免疫系統(tǒng)細(xì)胞的物質(zhì)。由所述疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的類型可由本領(lǐng)域已知的方法，如ELISA和流式血細(xì)胞記數(shù)進(jìn)行確定。在一種可選擇的實(shí)施方式中，此處所述的檢測(cè)疫苗的方法可進(jìn)一步包括利用由一個(gè)以上的種群的個(gè)體所獲得的細(xì)胞進(jìn)行效力的篩選。例如，所述的篩選可以包括細(xì)胞毒力分析。
本發(fā)明還提供鑒定與免疫系統(tǒng)細(xì)胞分化和發(fā)育相關(guān)的基因的方法。該方法包括改變?cè)煅杉?xì)胞中基因的表達(dá)，在三維支持物上培養(yǎng)所述細(xì)胞，確定所述基因表達(dá)的改變是否導(dǎo)致培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)的改變。需要時(shí)該方法的實(shí)施可在非骨髓細(xì)胞存在下進(jìn)行?？蓹z測(cè)到的表型改變可以包括例如，表面標(biāo)記表達(dá)的改變，細(xì)胞因子/趨化因子表達(dá)的改變。這種表型的改變可以通過抗體產(chǎn)生細(xì)胞的例如流式細(xì)胞分析技術(shù)，免疫化學(xué)，ELISPOT分析技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明的另一方面，提供與免疫系統(tǒng)細(xì)胞的發(fā)育和功能相關(guān)的基因的篩選方法。依照這一方法，改變?cè)煅杉?xì)胞中基因的表達(dá)，并在三維培養(yǎng)物上培養(yǎng)所述的造血干細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞。然后確定是否上述的基因的改變可導(dǎo)致所培養(yǎng)細(xì)胞表型的改變。
可通過任何已知的方法改變?cè)煅杉?xì)胞中基因的表達(dá)。例如，可以用包含某種序列的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化造血干細(xì)胞，使所述序列插入到造血干細(xì)胞的某基因中。如果上述插入了外源遺傳序列的基因是與免疫系統(tǒng)細(xì)胞的發(fā)育和功能相關(guān)的，則外源序列的插入使該基因遭到破壞并可表現(xiàn)出表型的改變?？蛇x擇的，反義分子可用于靶定與免疫系統(tǒng)細(xì)胞的發(fā)育和分化相關(guān)的基因。如果用反義分子轉(zhuǎn)化造血干細(xì)胞引起該造血干細(xì)胞表型的改變，則可以推導(dǎo)出該反義分子靶定了某個(gè)與免疫系統(tǒng)細(xì)胞的發(fā)育和功能相關(guān)的基因。裸DNA或RNA也可以用于轉(zhuǎn)染骨髓細(xì)胞。細(xì)胞也可以通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染。
有許多方法可以改變?cè)煅杉?xì)胞中基因的表達(dá)。除了上述的基因破壞和反義技術(shù)之外，也可以使用誘變技術(shù)。例如造血干細(xì)胞可與誘變劑接觸或暴露于誘變劑中，再在三維培養(yǎng)物上培養(yǎng)，然后確定是否誘變的細(xì)胞引起培養(yǎng)細(xì)胞表型的變化。
需要時(shí)可以在非骨髓細(xì)胞存在下培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞和造血干細(xì)胞。在一可選擇的實(shí)施方案中，培養(yǎng)細(xì)胞中基因的表達(dá)可與非免疫系統(tǒng)細(xì)胞或非分化細(xì)胞中基因的表達(dá)相比較。這種比較的目的在于研究與所感興趣的基因相關(guān)的細(xì)胞功能。在另一實(shí)施方案中，對(duì)本發(fā)明的培養(yǎng)物中的細(xì)胞與產(chǎn)生非免疫的培養(yǎng)物中的細(xì)胞進(jìn)行了基因表達(dá)的比較之后，對(duì)其表達(dá)發(fā)生改變的基因進(jìn)行鑒定。在又一種實(shí)施方案中，將本發(fā)明的培養(yǎng)細(xì)胞與具有不同免疫細(xì)胞譜的細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)的比較。
依照本發(fā)明還提供確定藥物毒性和效力的方法。依照本發(fā)明的這一方面，在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞和造血干細(xì)胞使其分化為免疫系統(tǒng)細(xì)胞。將某種藥物施用于培養(yǎng)細(xì)胞，然后確定所用藥物對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞是否是毒性的。如果所用藥物是無毒或微毒(marginally toxic)性的再確定其效力。此處所用到的，″藥物″包括任何元素，分子，化合物，激素，生長(zhǎng)因子，核酸序列(包括寡核苷酸)，蛋白(包括肽)，或能對(duì)免疫系統(tǒng)細(xì)胞起作用的試劑。例如，可以影響B(tài)細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力，影響T細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫功能的能力，如細(xì)胞毒性?？梢杂绊慛K細(xì)胞的溶細(xì)胞活性。本發(fā)明還提供暴露于某種藥物并存活下來的免疫系統(tǒng)細(xì)胞。
在影響免疫系統(tǒng)細(xì)胞的藥物的典型毒性或效力分析中，培養(yǎng)的免疫系統(tǒng)細(xì)胞從生物反應(yīng)器中移出，置于培養(yǎng)皿，搖瓶，顯微鏡的載玻片，微滴定板(microtiter dish)等中，加有足夠的培養(yǎng)基和緩沖溶液以維持細(xì)胞存活。所培養(yǎng)的免疫系統(tǒng)細(xì)胞可包括混合的細(xì)胞種群，如T細(xì)胞，B細(xì)胞，NK細(xì)胞，等等?？蛇x擇地，可分離出亞群(subpopulations)用于毒性分析。優(yōu)選地，保持pH約為7.2，培養(yǎng)溫度約為37℃。在篩選分析中所用到的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的數(shù)量是經(jīng)驗(yàn)性的。典型地，依細(xì)胞樣品中免疫系統(tǒng)細(xì)胞的數(shù)量，一般使用包含總共1×106細(xì)胞的樣品。
在細(xì)胞樣品中免疫系統(tǒng)細(xì)胞相對(duì)于其它細(xì)胞的數(shù)量可以通過顯微鏡記數(shù)或上述的免疫組織化學(xué)確定。此處，細(xì)胞記數(shù)的方法是本領(lǐng)域所公知的并在實(shí)施例1“不同細(xì)胞的記數(shù)”中有所描述。毒性或功效實(shí)驗(yàn)中所用藥物的濃度是經(jīng)驗(yàn)性的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉調(diào)節(jié)不同組分濃度的方法以在篩選實(shí)驗(yàn)中最佳地鑒定供試化合物的效果。典型地，在一定濃度范圍內(nèi)應(yīng)用，排除所述范圍中那些對(duì)免疫系統(tǒng)細(xì)胞活性表現(xiàn)嚴(yán)重破壞作用的部分，進(jìn)行進(jìn)一步研究。鑒定出所述范圍中那些對(duì)免疫系統(tǒng)細(xì)胞活性表現(xiàn)較弱破壞作用的部分，進(jìn)行進(jìn)一步的功效確定。
將免疫系統(tǒng)細(xì)胞與藥物的混合物在足以抑制或刺激免疫功能的條件下一起培養(yǎng)一段時(shí)間。依照此處所定義的，足夠的時(shí)間可以是5分鐘到幾小時(shí)或更多。當(dāng)免疫系統(tǒng)細(xì)胞在培養(yǎng)皿，搖瓶，顯微鏡的載玻片，微滴定板(microtiter dish)等中試驗(yàn)時(shí)，所謂足夠的時(shí)間可以是幾分鐘到幾小時(shí)。當(dāng)然，為看到細(xì)胞所反映的效果，需要時(shí)時(shí)間可以延長(zhǎng)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠通過取樣，并在顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞的活性來確定進(jìn)行篩選分析的最佳時(shí)間。
用于所述反應(yīng)的優(yōu)選的緩沖液是添加有1×非必須氨基酸，1×L-谷氨酰胺，10％FBS，50U/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的無酚紅MEM。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，反應(yīng)的體積在約0.5到約2ml的范圍內(nèi)。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中反應(yīng)的體積是1ml。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中培養(yǎng)的溫度為約37℃。
所試驗(yàn)的化合物可以加入到培養(yǎng)基中也可以加入到三維臺(tái)架上?；衔锛尤氲臅r(shí)間是經(jīng)驗(yàn)性的但相對(duì)較早。典型地，不向生物反應(yīng)器中加入供試化合物進(jìn)行反應(yīng)作為對(duì)照。
用本發(fā)明的方法測(cè)試毒性和功效的藥物的例子包括，如核酸，經(jīng)修飾的核酸，抗體，化學(xué)治療試劑和細(xì)胞因子。如上所述，任何可得的試驗(yàn)化合物均可用于篩選對(duì)免疫系統(tǒng)細(xì)胞的毒性和/或功效。一些情況下，供試化合物歸為免疫系統(tǒng)細(xì)胞的抑制劑還是激活劑(誘導(dǎo)劑)是未知的，通過上述的分析開始確定。
本發(fā)明還提供基因治療的方法。該方法包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，使其生長(zhǎng)和/或分化為免疫系統(tǒng)細(xì)胞，然后將某種基因施用于所培養(yǎng)的細(xì)胞。需要時(shí)，可在非骨髓細(xì)胞存在下培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞。向培養(yǎng)細(xì)胞“施用”一種基因，是指將所述基因轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)細(xì)胞中。在本發(fā)明的這一方面，所述的基因治療視為源于體內(nèi)的基因治療。轉(zhuǎn)染包括骨髓細(xì)胞的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域所公知的，參見例如“反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化造血祖細(xì)胞”免疫學(xué)方法手冊(cè)，1997科學(xué)出版社，圣地亞哥，I.Lefkovits，編。本發(fā)明還提供依此處所述方法產(chǎn)生的經(jīng)轉(zhuǎn)化的造血干細(xì)胞。在一可選擇的實(shí)施方案中，培養(yǎng)物包含輔助細(xì)胞，該輔助細(xì)胞帶有包含待轉(zhuǎn)入基因的載體。
本發(fā)明還提供一種將經(jīng)轉(zhuǎn)染的造血干細(xì)胞引入病人的方法。可以通過任意種方法引入，如移植到機(jī)體的特定部位，例如特定的組織或器官。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的部位是骨髓。也可以進(jìn)行細(xì)胞的系統(tǒng)灌注。
在另一實(shí)施方案中，所述的基因可以靶向免疫系統(tǒng)細(xì)胞。靶定免疫系統(tǒng)細(xì)胞的方法包括使用反轉(zhuǎn)錄病毒。
本發(fā)明還提供監(jiān)控HIV感染進(jìn)程的方法。在本發(fā)明的這一方面，該方法包括下述步驟在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞和造血干細(xì)胞，使其生長(zhǎng)和/或分化成免疫系統(tǒng)細(xì)胞，向培養(yǎng)細(xì)胞中引入HIV病毒，監(jiān)控HIV病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中的數(shù)量和定位。同樣，需要時(shí)可以在非骨髓細(xì)胞存在下培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞和造血干細(xì)胞。
本發(fā)明還提供檢測(cè)抑制或治療HIV的藥物的方法。該方法包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞和造血干細(xì)胞，使其生長(zhǎng)和/或分化成免疫系統(tǒng)細(xì)胞，向培養(yǎng)細(xì)胞中引入HIV病毒，對(duì)上述培養(yǎng)細(xì)胞施用某種的藥物，監(jiān)控HIV病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中的數(shù)量和定位。所述的藥物可以在HIV病毒引入培養(yǎng)細(xì)胞之前或之后施用。同樣，需要時(shí)可以在非骨髓細(xì)胞存在下培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞和造血干細(xì)胞。
本發(fā)明還提供治療病人的方法，該方法包括向病人施用有效劑量的在三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中產(chǎn)生的任何免疫系統(tǒng)細(xì)胞的步驟。所述的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的例子包括T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞，抗原呈遞細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞，初生細(xì)胞，活化細(xì)胞，記憶細(xì)胞，和其祖細(xì)胞或前體細(xì)胞。上述的細(xì)胞可以任意組合施用。需要時(shí)也可以僅使用上述細(xì)胞中的一種類型。
因此，可施用于病人的T淋巴細(xì)胞如CD4+，CD8+，CD3+或TdT細(xì)胞?？墒┯糜诓∪说腂淋巴細(xì)胞如CD19+，CD20+或CD21+細(xì)胞。可以施用的抗原呈遞細(xì)胞如巨噬細(xì)胞或樹狀細(xì)胞。B細(xì)胞如漿細(xì)胞或記憶細(xì)胞也可以施用于病人。
本發(fā)明的三維生物反應(yīng)器所產(chǎn)生的免疫系統(tǒng)細(xì)胞可以有效劑量施用于病人。以“有效劑量”是指治療病人的有效劑量。此處所用的“治療”指包括預(yù)防或改善病人的病癥。易患或已患任何免疫系統(tǒng)疾病或機(jī)能紊亂的病人，均可施用有效劑量的本發(fā)明的免疫系統(tǒng)細(xì)胞或其祖細(xì)胞或前體細(xì)胞，以預(yù)防或改善所患疾病或機(jī)能紊亂。免疫系統(tǒng)疾病或機(jī)能紊亂的例子包括獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)，血友病，和迪喬治(DiGeorge)綜合癥。
類似地，由本發(fā)明的藥物毒性或藥物功效分析中存活的細(xì)胞可以有效劑量施用于病人。
還可以用有效劑量的由本發(fā)明的產(chǎn)生抗原特異性抗體的方法所產(chǎn)生的抗體治療病人。“有效劑量”是指有效地中和污染(外來)抗原的量。
本發(fā)明還提供免疫細(xì)胞成熟，選擇，抗原呈遞，或擴(kuò)增的方法。該方法包括將在三維生物反應(yīng)器中產(chǎn)生的免疫細(xì)胞移走，并將移出的免疫細(xì)胞接種到另一種培養(yǎng)物中。再通過本領(lǐng)域已知的或本發(fā)明中所描述的方法從另一種培養(yǎng)物中移出或篩選出成熟的，擴(kuò)增的和/或抗原呈遞細(xì)胞。此處所用到的“另一種培養(yǎng)物”是指支持造血干細(xì)胞生長(zhǎng)和或分化為免疫系統(tǒng)細(xì)胞的三維支持物(臺(tái)架)，培養(yǎng)基；即第二三維生物反應(yīng)器。
優(yōu)選地，“另一種培養(yǎng)物”指包括至少成人或胎兒脾細(xì)胞培養(yǎng)物，胸腺細(xì)胞培養(yǎng)物，淋巴結(jié)細(xì)胞培養(yǎng)物，或肝細(xì)胞培養(yǎng)物系統(tǒng)之一。成人或胎兒脾細(xì)胞，胸腺細(xì)胞，淋巴結(jié)細(xì)胞，或肝細(xì)胞的培養(yǎng)方法是本領(lǐng)域已知的。
本發(fā)明還提供B細(xì)胞成熟，選擇，抗原呈遞或擴(kuò)增的方法，其包括在本發(fā)明的三維生物反應(yīng)器中用產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞接種另一種培養(yǎng)物的步驟。產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞是由下述步驟產(chǎn)生的在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，使其成長(zhǎng)或分化為免疫系統(tǒng)細(xì)胞；用抗原或其抗原性片段免疫培養(yǎng)物；鑒定所產(chǎn)生的抗體；分離產(chǎn)生抗原特異性抗體的B細(xì)胞。
本發(fā)明還提供T細(xì)胞成熟，選擇，抗原呈遞或擴(kuò)增的方法。該方法包括用抗原特異性T細(xì)胞接種另一種培養(yǎng)物的步驟?？乖禺愋缘腡細(xì)胞是由下述步驟產(chǎn)生的在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，使其成長(zhǎng)或分化為免疫系統(tǒng)細(xì)胞；用抗原或其抗原性片段免疫培養(yǎng)物；鑒定所產(chǎn)生的抗體；分離由培養(yǎng)物產(chǎn)生的抗原特異性的T細(xì)胞。
本發(fā)明還提供樹狀細(xì)胞成熟，選擇，抗原承載或擴(kuò)增的方法。該方法包括將免疫系統(tǒng)細(xì)胞從三維生物反應(yīng)器中移出，分離樹狀細(xì)胞，將樹狀細(xì)胞接種到另一種細(xì)胞培養(yǎng)物中。
本發(fā)明還包括自然殺傷細(xì)胞成熟，選擇，抗原呈遞或擴(kuò)增的方法。該方法包括將免疫系統(tǒng)細(xì)胞從三維生物反應(yīng)器中移出，分離自然殺傷細(xì)胞，將自然殺傷細(xì)胞接種到另一種細(xì)胞培養(yǎng)物中。
依照本發(fā)明還提供施用有效劑量的由另一種細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的自然殺傷細(xì)胞以治療病人的方法。
本發(fā)明的再一方面還提供細(xì)胞生長(zhǎng)和擴(kuò)增的方法，該方法包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，使其生長(zhǎng)或分化為免疫系統(tǒng)細(xì)胞的步驟。用某種核酸序列轉(zhuǎn)染該免疫系統(tǒng)細(xì)胞，將經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用于接種另一種細(xì)胞培養(yǎng)物。
本發(fā)明的又一方面還提供用于HIV感染的細(xì)胞生長(zhǎng)和擴(kuò)增的方法，該方法包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，使其生長(zhǎng)或分化為免疫系統(tǒng)細(xì)胞的步驟。將HIV引入所培養(yǎng)的細(xì)胞，將經(jīng)HIV感染的細(xì)胞接種另一種細(xì)胞培養(yǎng)物。
本發(fā)明的再一方面還提供細(xì)胞生長(zhǎng)和擴(kuò)增的方法，該方法包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，使其生長(zhǎng)或分化為免疫系統(tǒng)細(xì)胞的步驟。將HIV引入所培養(yǎng)的細(xì)胞，同時(shí)將一種藥物也引入所培養(yǎng)的細(xì)胞。將經(jīng)HIV感染并暴露于藥物的細(xì)胞接種另一種細(xì)胞培養(yǎng)物。
本發(fā)明通過下述的實(shí)施例進(jìn)一步描述，但這些實(shí)施例并不作為對(duì)本發(fā)明范圍的任何形式的限制。
實(shí)施例1一般材料和方法流式-血細(xì)胞計(jì)數(shù)分析淋巴細(xì)胞亞型(輔助和溶細(xì)胞性T細(xì)胞和B細(xì)胞)和活化的淋巴細(xì)胞表面標(biāo)記百分比在EPICS Profile Analyzer(Coulter，Miami，F(xiàn)L)上通過流式-血細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行定量。細(xì)胞樣品和熒光標(biāo)記的抗體及同種型對(duì)照一起溫育。所用的抗體是抗-CD3(pan T細(xì)胞)，抗-CD4(輔助T細(xì)胞)，抗-CD8(溶細(xì)胞性T細(xì)胞)，抗-TCRαβ(帶有αβT細(xì)胞受體的T-細(xì)胞)，抗-TCRγδ(帶有γδT細(xì)胞受體的T-細(xì)胞)，抗-CD45RA(初生T細(xì)胞)，抗-CD45RO(活化的T細(xì)胞)，抗-CD19，抗-CD20，抗-CD21，和抗-CD10(B細(xì)胞)(10)。免疫細(xì)胞化學(xué)培養(yǎng)物中的非黏附細(xì)胞的經(jīng)丙酮固定的cytospin玻片制品由單克隆抗體(抗-CD3，抗-CD19，抗-CD56，和抗-TdT)或多克隆抗體(抗胞漿μ，抗表面IgG，和抗表面IgM)標(biāo)記，然后加入生物素連接的第二抗體和鏈霉抗生物素蛋白-連接的過氧化物酶(DPC)。在免疫染色前將玻片在3％過氧化氫中浸沒5分鐘使內(nèi)源的過氧化物酶滅活(8)。正染色的細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下鑒定。并對(duì)正染色細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)的檢測(cè)以確定其各自與由細(xì)胞化學(xué)定義的亞型一致?？贵w產(chǎn)生B細(xì)胞的ELISPOT分析用ELISPOT(酶聯(lián)免疫點(diǎn)樣)試驗(yàn)(10)，檢測(cè)到了產(chǎn)生免疫球蛋白的B-細(xì)胞。簡(jiǎn)要地說，抗原包被到固相(培養(yǎng)皿或多孔培養(yǎng)板)上于4℃下過夜。然后將平板封閉，然后以合適的稀釋度(一般在103到106細(xì)胞/ml的范圍)使抗體產(chǎn)生細(xì)胞于潮濕的培養(yǎng)箱(含有5％CO2)中在37℃下溫育12到16小時(shí)。通過與酶聯(lián)的抗球蛋白在37℃下溫育2小時(shí)后加入合適的底物(10)完成在活性的抗體分泌細(xì)胞處檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物。所記數(shù)的斑點(diǎn)放大了10×到30×。NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性試驗(yàn)通過溶解NK-敏感的靶細(xì)胞K562估計(jì)NK細(xì)胞的天然溶細(xì)胞活性。簡(jiǎn)要地說，將2×105細(xì)胞/ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞用10μM BrdU(標(biāo)記DNA)在37℃下標(biāo)記過夜。標(biāo)記的靶細(xì)胞與不同數(shù)量的在U型底96-孔微滴定板中，于37℃下培養(yǎng)4小時(shí)的效應(yīng)淋巴細(xì)胞混合。如(11)中所描述的用DNA Fragmentation試劑盒(Boehringer Manheim)對(duì)所收集的小份的上清液和BrdU-標(biāo)記的DNA(由溶解的靶細(xì)胞中釋放的)進(jìn)行夾心ELISA定量測(cè)定。自體血漿的收集在收獲骨髓細(xì)胞之前，供試者提供120ml外周血，收集到肝素化的管子中以防止凝固。所述的外周血以2000rpm離心30min，收集血漿儲(chǔ)存于-20℃以備以后需要時(shí)使用(10)。石蠟薄切片所述的臺(tái)架和其中的細(xì)胞用10％甲醛(Fisher，Pittsburgh，PA)在室溫下固定1小時(shí)，用3％Bacto瓊脂包埋(Gibco)，然后浸沒在10％的甲醛緩沖液(Fisher)中。用石蠟浸潤，薄切片，用蘇木精/依紅染色用于顯微鏡檢。掃描電子顯微術(shù)(SEM)所述臺(tái)架和其中的細(xì)胞用在0.1M磷酸緩沖液中混合的2％的甲醛和4％的戊二醛固定，用磷酸緩沖液洗兩次，用1％OsO4水溶液再次固定1小時(shí)，再用蒸餾水洗。所述的樣品用乙醇溶液連續(xù)洗滌脫水，進(jìn)行SEM(7)檢測(cè)之前用金包被。鑒別細(xì)胞記數(shù)細(xì)胞樣品切片用Cytospin離心機(jī)(Shandon，Sewickly，PA)制備，在用Wright′s染色之前在空氣中干燥。通過光學(xué)顯微鏡在每張切片上數(shù)出100-200個(gè)細(xì)胞進(jìn)行鑒別細(xì)胞記數(shù)。細(xì)胞化學(xué)福爾馬林固定的培養(yǎng)物石蠟薄切片用單克隆抗體(抗-CD68用于巨噬細(xì)胞抗-CD31用于內(nèi)皮細(xì)胞)或多克隆抗體(抗-波形蛋白用于來自間充質(zhì)的基質(zhì)細(xì)胞)標(biāo)記，然后再用生物素連接的第二抗體和鏈霉抗生物素蛋白-連接的過氧化物酶(DPC)標(biāo)記。銀染網(wǎng)狀的基質(zhì)細(xì)胞，通過Masson染色顯示膠原沉淀。在免疫染色之前通過將切片在3％的過氧化氫中浸沒5分鐘將內(nèi)源的過氧化物酶滅活(8)。在光學(xué)顯微鏡下鑒定正染色細(xì)胞。并對(duì)正染色細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)的檢測(cè)以確定其各自與由細(xì)胞化學(xué)定義的亞型一致。RNA任意引物PCR(RAP-PCR)RNA任意引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RAP-PCR)提供簡(jiǎn)單快速的RNA基因轉(zhuǎn)錄物指紋技術(shù)。在第一條鏈的合成過程中，一個(gè)18個(gè)堿基的任意引物(Stratagene，La Jolla，CA)由信使RNA內(nèi)所包含的位點(diǎn)退火并延伸。第二條鏈在一輪低嚴(yán)謹(jǐn)性的PCR反應(yīng)中以類似的方式合成。PCR擴(kuò)增以嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件進(jìn)行，通過在PCR的兩端摻入任意引物以擴(kuò)增出cDNA。存在模板依賴的競(jìng)爭(zhēng)，其決定最終哪種可能的產(chǎn)物最終占優(yōu)勢(shì)。對(duì)于每一試驗(yàn)的任意引物-RNA結(jié)合，從反應(yīng)中去除逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行“模擬”第一鏈合成。這一對(duì)照樣品在后續(xù)的PCR步驟中易于擴(kuò)增，從而指示源于不需要逆轉(zhuǎn)錄的模板的背景信號(hào)。RAP-PCR產(chǎn)物分析所得的RAP-PCR產(chǎn)物通過在6％丙烯酰胺/7M尿素凝膠(9)上進(jìn)行凝膠電泳再用Pharmacia銀染試劑盒(Pharmacia，Piscataway，NJ)經(jīng)銀染分析。生物反應(yīng)器的制備所述的生物反應(yīng)器用聚碳酸酯板(圖1A)制造。培養(yǎng)小室(3/16″H×5/16″W×5/16″L)用0.01g多孔微載體填充。微載體的填充床用培養(yǎng)基覆蓋。培養(yǎng)基小室(1/2″H×5/16″W×12/16″L)含0.6ml的培養(yǎng)基。聚四氟乙烯膜(50μm厚)用于促進(jìn)氣體交換。
Cellsnow-EX，L型(low ion-charged)，大孔纖維素微載體(Kirin，日本；直徑1-2mm；孔的大小為100-200μm；孔隙率95％)用于這些實(shí)驗(yàn)中作為人骨髓細(xì)胞的人工臺(tái)架(圖1B)。人骨髓的制備根據(jù)大學(xué)研究主題評(píng)審委員會(huì)(Research Subjects ReviewBoard)的教導(dǎo)，由志愿提供者髂骨嵴中抽取的骨髓用McCoy′s 5A培養(yǎng)基(Gibco，Grand Island，NY)以1∶1的比例稀釋，覆蓋到Ficol/Paque(Pharmacia，Piscataway，NJ，密度1.027g/ml)上，200g離心30分鐘。收集單核細(xì)胞層，洗3遍用于在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)。其中的一部分細(xì)胞放在一邊以備在各種試驗(yàn)中使用。
實(shí)施例2三維人長(zhǎng)期骨髓培養(yǎng)將適當(dāng)數(shù)量的單核細(xì)胞(4-6×106每培養(yǎng)小室)移入生物反應(yīng)器的多孔微載體部分與所述的培養(yǎng)物一起培養(yǎng)。所述的培養(yǎng)物于潮濕的培養(yǎng)箱(含5％CO2)中在37℃下培養(yǎng)。LTBMC培養(yǎng)基(每天更換)，由70％(v/v)McCoy′s 5A培養(yǎng)基(Gibco)，1×10-6M氫化可的松(Sigma，St.Louis，MO)，50u/ml青霉素(Sigma)，50mg/ml鏈霉素(Sigma)，0.2mM L-谷氨酰胺(Gibco)，0.045％碳酸氫鈉(Sigma)，1×MEM丙酮酸鈉(Gibco)，1×MEM維生素溶液(Gibco)，0.4×MEM氨基酸溶液(Gibco)，12.5％(v/v)熱滅活馬血清(Gibco)，和12.5％熱滅活的FBS(Gibco)組成。所述培養(yǎng)基添加了重組的人干細(xì)胞因子(rhSCF 50ng/ml)和淋巴細(xì)胞特異的淋巴因子，IL-2(rhIL2，1000U/ml)和I L-7(rh IL-7，2ng/ml)。所述培養(yǎng)物每天添加非補(bǔ)充培養(yǎng)基，每?jī)商焯砑友a(bǔ)充培養(yǎng)基。第4天開始添加補(bǔ)充了細(xì)胞因子的培養(yǎng)基。
對(duì)氫化可的松實(shí)驗(yàn)，每天添加完全培養(yǎng)基，第10天開始使用無可的松的培養(yǎng)基。對(duì)自體血漿實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基中添加10％的自體血漿。第二周，通過輕柔地?cái)噭?dòng)和混合多孔微球培養(yǎng)床釋放非黏附細(xì)胞(501/孔)使培養(yǎng)物脫細(xì)胞(depopulated)。有活力的非黏附細(xì)胞記數(shù)通過臺(tái)盼蘭染料(Sigma)和血細(xì)胞計(jì)數(shù)器由染色排除的方法確定。在第3周收獲培養(yǎng)物，輕柔地移出培養(yǎng)物破壞細(xì)胞進(jìn)行各種試驗(yàn)。
實(shí)施例3B淋巴細(xì)胞的檢測(cè)不存在外源生長(zhǎng)因子的情況下對(duì)三維人骨髓模擬的細(xì)胞產(chǎn)出的流式血細(xì)胞記數(shù)分析確定了pro-B(原B細(xì)胞) (CD10+)，非成熟B(CD19+)，和成熟B-細(xì)胞(CD20+，CD21+)的存在。第0周2.4％的細(xì)胞CD10表達(dá)標(biāo)記，其代表新鮮骨髓中的pro-B(原B細(xì)胞)細(xì)胞群(圖2)。培養(yǎng)一周后pro-B(原B細(xì)胞)細(xì)胞群仍維持在相同的水平。但第2周，pro-B(原B細(xì)胞)細(xì)胞群急劇下降，僅在第4周恢復(fù)。這一波動(dòng)可能表示出現(xiàn)在三維培養(yǎng)物中的再生過程并預(yù)示著存在于生物反應(yīng)器中的活性B細(xì)胞淋巴細(xì)胞生成。而且，CD10+B細(xì)胞群(pro-B(原B細(xì)胞)細(xì)胞)的波動(dòng)與非成熟的(CD19)和成熟的(CD20+和CD21+)B細(xì)胞的波動(dòng)一致。具體說來，在第0周CD19+CD20+B細(xì)胞群為5.7％(圖，3)。在第1周，CD19+CD20+群下降一半達(dá)2.5％。在第2周，CD19+CD20+恢復(fù)并擴(kuò)增到9％。這一恢復(fù)與CD10+細(xì)胞的下降一致，且很可能代表由pro-B(原B細(xì)胞)細(xì)胞到非成熟的(CD19+)和成熟的(CD19+CD20+)B細(xì)胞的成熟過程。在第4周，CD19+和CD20+細(xì)胞的水平與新鮮骨髓相同。以類似的方式，圖4表示CD19和CD21B細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)。培養(yǎng)過程中，與體內(nèi)骨髓類似的方式，CD21標(biāo)記(其代表成熟最后階段的B細(xì)胞)幾乎不表達(dá)。值得注意利用不同B淋巴細(xì)胞標(biāo)記的總B細(xì)胞群的良好一致。
用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)淋巴干細(xì)胞和pre-B細(xì)胞(前B細(xì)胞)的存在。圖5a確證了在三維生物反應(yīng)器中存在淋巴干細(xì)胞(核TdT染色陽性)。TdT+細(xì)胞代表骨髓細(xì)胞中的一小部分(0.1％)。胞漿μ陽性細(xì)胞確證培養(yǎng)過程中也存在Pre-B淋巴細(xì)胞(前B淋巴細(xì)胞)。用ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了生物反應(yīng)器中產(chǎn)生的B-細(xì)胞的功能。圖5c和5d示出受磷脂多糖(LPS)的刺激在培養(yǎng)物中(4周)的B細(xì)胞分泌抗體，這說明B細(xì)胞是功能性的。因此，人骨髓培養(yǎng)物可支持來自體內(nèi)的B淋巴細(xì)胞生成，類似于體內(nèi)骨髓的功能。這提供令人興奮的前所未有的機(jī)會(huì)來研究人淋巴細(xì)胞生成的微環(huán)境。
實(shí)施例4T淋巴細(xì)胞的檢測(cè)對(duì)三維人骨髓生物反應(yīng)器產(chǎn)出的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分析表明，在差示記數(shù)中鑒定的大多數(shù)淋巴細(xì)胞(＞90％)是CD3+T-細(xì)胞。進(jìn)一步的分析顯示存在兩種T細(xì)胞亞型(圖6)。具體地說，在不存在外源生長(zhǎng)因子的情況下，輔助T細(xì)胞(CD3+，CD4+)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CD3+CD8+)存在于整個(gè)培養(yǎng)過程中。這一觀察結(jié)果進(jìn)一步說明人三維骨髓模擬物具有支持來自體內(nèi)淋巴細(xì)胞生成的功能。
為進(jìn)一步表征在生物反應(yīng)器中產(chǎn)生的T淋巴細(xì)胞，在外源淋巴細(xì)胞-特異的細(xì)胞因子(淋巴因子)存在或不存在的情況下進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)。具體地說，干細(xì)胞因子(rh SCF，50ng/ml)和IL-2(rh IL-2，1000U/ml)和IL-7(rh IL-7，2ng/ml)補(bǔ)充到培養(yǎng)基中。圖7a和7b示出與對(duì)照相比(沒有細(xì)胞因子)補(bǔ)充了細(xì)胞因子的培養(yǎng)物的細(xì)胞產(chǎn)量受到因子2-8的刺激。而且，存在細(xì)胞因子時(shí)，第三周累積的細(xì)胞產(chǎn)量超出了接種物，這表明在生物反應(yīng)器中擴(kuò)增和/或產(chǎn)生了T淋巴細(xì)胞。更重要的是，添加淋巴因子導(dǎo)致擴(kuò)增持續(xù)了5周。
差示細(xì)胞分析(表1)確證了在淋巴細(xì)胞特異的細(xì)胞因子存在下淋巴細(xì)胞群中細(xì)胞產(chǎn)量的擴(kuò)增。第2周時(shí)，淋巴細(xì)胞構(gòu)成了所述細(xì)胞中的主要部分(55％)。類似地，第4周時(shí)，淋巴細(xì)胞群占到了58.7％，與對(duì)照相比增長(zhǎng)了三倍。因此，添加淋巴因子導(dǎo)致生物反應(yīng)器中造血細(xì)胞向淋巴細(xì)胞生成轉(zhuǎn)變。
利用流式細(xì)胞記數(shù)通過下述CD3，CD4，和CD8抗原的表達(dá)分析了T-細(xì)胞亞型。在不存在外源生長(zhǎng)因子的情況下(圖8)，培養(yǎng)過程中T淋巴細(xì)胞的百分比由新鮮骨髓(第0周)中的25％下降到約10-15％。有趣的是，CD4+輔助與CD8+細(xì)胞毒性細(xì)胞的比率在培養(yǎng)過程中保持恒定在1.5∶1，這也是在體內(nèi)骨髓中的正常比率。當(dāng)外源淋巴細(xì)胞特異的細(xì)胞因子(IL-2和IL-7)與SCF一起補(bǔ)充到培養(yǎng)基中時(shí)，可以觀察到優(yōu)先刺激CD4+T-細(xì)胞(圖9)。這可以通過下述事實(shí)得以解釋已知IL-2刺激輔助T-細(xì)胞，其反過來產(chǎn)生細(xì)胞因子進(jìn)一步加強(qiáng)輔助T-細(xì)胞群。
研究了T-細(xì)胞受體(TCR)亞型。已知T-細(xì)胞在其表面表達(dá)兩種TCR亞型，TCRαβ和TCRγδ。大多數(shù)的T-細(xì)胞表達(dá)αβTCR。圖10示出在不存在生長(zhǎng)因子時(shí)大多數(shù)的T細(xì)胞(95％)在其表面表達(dá)TCRαβ。當(dāng)SCF，IL-2，和IL-7添加到培養(yǎng)基中時(shí)，T淋巴細(xì)胞膨脹和/或表達(dá)αβTCR，相反，表達(dá)γδTCR的T細(xì)胞不受刺激。
該數(shù)據(jù)表明在人骨髓模型產(chǎn)生的細(xì)胞中存在T-細(xì)胞。兩種T-淋巴細(xì)胞亞型，輔助和細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞亞型以與體內(nèi)骨髓中類似的比率存在(在不存在外源生長(zhǎng)因子時(shí))。而如所預(yù)期的，大多數(shù)的T細(xì)胞表達(dá)αβTCR。并且當(dāng)向生物反應(yīng)器中加入外源的淋巴細(xì)胞特異的生長(zhǎng)因子時(shí)，生物反應(yīng)器中的T細(xì)胞以與其亞型一致的方式受到刺激，從而表明這些細(xì)胞是功能性的。因此，三維人骨髓模型所形成產(chǎn)生淋巴細(xì)胞的微環(huán)境，并提供了良好的研究對(duì)淋巴細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要的信號(hào)，分子和細(xì)胞間相互作用的機(jī)會(huì)。
實(shí)施例5去除可的松的效果在Whitlock-Witte培養(yǎng)物中，為B淋巴細(xì)胞生成需去除一種已知的免疫抑制劑可的松。而且，去除培養(yǎng)瓶中的可的松導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)量下降。但在三維人骨髓模型中即使存在可的松B-和T-淋巴細(xì)胞也可以存在。在這一實(shí)施例中檢測(cè)了去除可的松對(duì)體內(nèi)淋巴細(xì)胞生成的影響。這樣確定了淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的最優(yōu)條件。另外，比較了在含可的松和不含可的松的培養(yǎng)基中基因表達(dá)方式，以鑒定與去除可的松有關(guān)的潛在基因。在第0，3，10-14天從培養(yǎng)基中去除可的松。
去除可的松的時(shí)間選擇對(duì)培養(yǎng)物的存活是非常重要的。在第0或3天去除可的松后不久培養(yǎng)物即發(fā)生萎縮。但在第10或14天去除可的松培養(yǎng)物是穩(wěn)定的并保持健康的活性(＞80％)。圖12表明在第10天去除可的松第2周細(xì)胞產(chǎn)量增加。細(xì)胞產(chǎn)量的增加在培養(yǎng)的全過程均得以保持，在第3周最為劇烈。在三維模擬物對(duì)細(xì)胞產(chǎn)量的刺激與傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞產(chǎn)量的下降形成鮮明的對(duì)比。去除可的松后與含可的松的培養(yǎng)物相比仍保持85-95％的高活性。
為鑒定去除可的松對(duì)不同的細(xì)胞型的影響進(jìn)行了差示細(xì)胞分析。從兩個(gè)獨(dú)立的供體的培養(yǎng)物中回收可的松(在第3周)表現(xiàn)出加強(qiáng)了非成熟的淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞(表2)。具體說來，成髓細(xì)胞和髓細(xì)胞表現(xiàn)出兩倍的增長(zhǎng)，而成淋巴細(xì)胞增長(zhǎng)了50％。這一結(jié)果與可的松作為免疫抑制劑的結(jié)果相吻合。
差示顯示技術(shù)用于檢測(cè)在含可的松和不含可的松的培養(yǎng)物中基因表達(dá)方式的不同，以鑒定與去除可的松相關(guān)的基因。含有或不含可的松的三維人骨髓培養(yǎng)物在第4周處死，提取黏附細(xì)胞的mRNA以分析差示顯示的基因。圖13確證了回收可的松導(dǎo)致不同的基因表達(dá)方式。在到目前所鑒定的基因中是血紅素調(diào)節(jié)的起始fact 2α激酶基因。該基因是通過去除差示表達(dá)的基因片段(圖13，682bp)，再擴(kuò)增，克隆，測(cè)序進(jìn)行鑒定。血紅素控制網(wǎng)織紅細(xì)胞中的蛋白合成。血紅素調(diào)節(jié)的真核起始因子2α(eIF-2α)，也稱為血紅素調(diào)節(jié)抑制劑(HRI)在這一過程中起重要作用(59，60)。
這些結(jié)果顯示了可的松作為培養(yǎng)基的補(bǔ)充的重要性和其對(duì)造血細(xì)胞生成的作用。而且也說明三維生物反應(yīng)器作為闡明調(diào)節(jié)劑，如可的松對(duì)造血細(xì)胞生成的作用。
實(shí)施例6應(yīng)用自體血漿研究了用自體血漿代替動(dòng)物血漿應(yīng)用于培養(yǎng)基中。動(dòng)物血清包含其可潛在的激活或抑制細(xì)胞分化和增殖的外源蛋白。自體血漿即可回避這一矛盾。但是其有限的來源相對(duì)于長(zhǎng)期培養(yǎng)存在問題。因此，自體血漿的可行性通過檢測(cè)兩種濃度(5％和10％)的血漿進(jìn)行了評(píng)價(jià)。研究了細(xì)胞產(chǎn)量和細(xì)胞分化。另外，表達(dá)CD19和CD3抗原后用流式細(xì)胞記數(shù)監(jiān)控B-和T-細(xì)胞。
三維培養(yǎng)物的細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)力學(xué)表明與添加動(dòng)物血清培養(yǎng)基相比，用自體血漿(在5％和10％)并不產(chǎn)生影響(圖14)。對(duì)非成熟B細(xì)胞(CD19+)和T細(xì)胞(CD3+)的流式細(xì)胞記數(shù)分析表明含自體血漿的培養(yǎng)基比動(dòng)物血漿的培養(yǎng)基更有利于支持淋巴細(xì)胞群(圖15)。特別地，含10％自體血漿的培養(yǎng)物較對(duì)照培養(yǎng)物含有更多的非成熟B細(xì)胞(圖34)，特別是在第3周和第4周。最終差示細(xì)胞動(dòng)力學(xué)分析確證了所觀察到的自體血漿(特別是10％含量的培養(yǎng)物)加強(qiáng)了淋巴細(xì)胞群(圖17a-17c)。
這些數(shù)據(jù)表明用10％自體血漿作為動(dòng)物血漿的替代物進(jìn)行長(zhǎng)期人骨髓培養(yǎng)的可能性。由此，可以在防止外源抗原性刺激或抑制，更接近生理?xiàng)l件的情況下研究造血細(xì)胞生成。細(xì)胞類型細(xì)胞類型百分比第2周 第4周BM(第0周)對(duì)照GF 對(duì)照 GF粒細(xì)胞成髓細(xì)胞 8 3.6 nd22.8 nd髓細(xì)胞 1421.414 15.8 nd帶狀嗜中性粒細(xì)胞 3738.45 38.4 nd節(jié)段嗜中性粒細(xì)胞 7 3.6 1 1.2 nd嗜堿性粒細(xì)胞 1 1 0.512.2嗜酸性粒細(xì)胞 2.6 4.5 2 3.7 6.5單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞2.6 7.6 5 4nd淋巴細(xì)胞 14.3 8.9 55 16.6 58.7巨核細(xì)胞 2.7 2.7 1 2.8 6.5紅細(xì)胞成熟RBCs12.6 nd 1 nd nd具核RBCs 9.5 9 15 3.6 21細(xì)胞類型細(xì)胞類型百分?jǐn)?shù)w/o氫化可的松BM(第0周) 對(duì)照(第3周)(第3周)粒細(xì)胞成髓細(xì)胞 3.2 nd2.5髓細(xì)胞 5.6 3.4 7.4帶狀嗜中性粒細(xì)胞 7.2 11.1 10.3節(jié)段嗜中性粒細(xì)胞 1.6 167.9嗜堿性粒細(xì)胞 0.8 nd1.5嗜酸性粒細(xì)胞 nd28.3 9.4單核-巨噬細(xì)胞nd 5.3 1.5淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 32 3630淋巴母細(xì)胞 16.8 17.5 27.5巨核細(xì)胞 nd ndnd紅細(xì)胞成熟RBCs120 ndnd具核RBCs 12.8 2.4 2
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權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其包括培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞的三維支持物；和支持干細(xì)胞生長(zhǎng)或分化為免疫系統(tǒng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)系統(tǒng)，其中，所述的基質(zhì)細(xì)胞是從至少下列來源之一分離的成人或胎兒的骨髓，脾，胸腺，外周血，肝，臍帶，主動(dòng)脈旁的胚臟壁，主動(dòng)脈，生殖腺，中腎(AGM)，淋巴結(jié)，和其它來源，或由下述之一衍生的骨髓干細(xì)胞，外周血細(xì)胞，外周血干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，臍帶細(xì)胞，臍帶血干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，其它來源的干細(xì)胞，或這些細(xì)胞的任意組合。
3.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中，所述的免疫系統(tǒng)細(xì)胞是進(jìn)一步在另一培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)。
4.如權(quán)利要求3所述的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中，所述的另一種細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)至少是下述之一成人或胎兒脾細(xì)胞，胸腺細(xì)胞，淋巴結(jié)細(xì)胞或肝細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。
5.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中，所述的造血干細(xì)胞選自骨髓干細(xì)胞，外周血干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，臍帶干細(xì)胞，或其它來源的干細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中，所述的免疫系統(tǒng)細(xì)胞選自T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞，抗原呈遞細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞，初生細(xì)胞，活化細(xì)胞，記憶細(xì)胞，和其祖細(xì)胞或前體細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求6所述的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中，所述的T淋巴細(xì)胞包含至少下列細(xì)胞之一CD4+，CD8+，CD3+，或TdT+細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求6所述的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中，所述的T淋巴細(xì)胞具有αβ或γδT細(xì)胞受體。
9.如權(quán)利要求6所述的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中，所述的B淋巴細(xì)胞包括至少下列細(xì)胞之一CD19+，CD20+，CD21+，CD10+，TdT+，CD5+，Ig+，胞質(zhì)mu鏈+或漿細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求6所述的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中，所述的抗原呈遞細(xì)胞選自巨噬細(xì)胞和樹狀細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中，所述的培養(yǎng)基包含細(xì)胞因子，胞外基質(zhì)或其它生物活性分子。
12.如權(quán)利要求11所述的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中，所述的細(xì)胞因子選自IL-2，IL-4，IL-6，IL-7，IL-12，flt-3L，干細(xì)胞因子，凝血蛋白，IL-4，CD40L，BCA-1，LBCGF，和可溶性IL-6R。
13.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，進(jìn)一步包括非骨髓細(xì)胞或細(xì)胞系。
14.如權(quán)利要求13所述的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中，所述的非骨髓細(xì)胞包含外周血免疫細(xì)胞。
15.一種治療病人的方法，該方法包括對(duì)病人施用有效劑量的如權(quán)利要求1，3，6，7，8，9或10中任意一項(xiàng)中的免疫系統(tǒng)細(xì)胞。
16.一種治療病人的方法，該方法包括對(duì)病人施用有效劑量的并在另一細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)一步培養(yǎng)的如權(quán)利要求1，3，6，7，8，9或10中任意一項(xiàng)中的免疫系統(tǒng)細(xì)胞。
17.一種免疫系統(tǒng)細(xì)胞成熟，選擇，抗原呈遞，或擴(kuò)增的方法，該方法包括用如權(quán)利要求1，3，6，7，8，9或10中任意一項(xiàng)中的免疫系統(tǒng)細(xì)胞接種另一種細(xì)胞培養(yǎng)物。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述的另一種細(xì)胞培養(yǎng)物至少是下述之一成人或胎兒脾細(xì)胞，胸腺細(xì)胞，淋巴結(jié)細(xì)胞或肝細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。
19.一種產(chǎn)生抗原特異性抗體的方法，該方法包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，使其生長(zhǎng)或分化成免疫系統(tǒng)細(xì)胞；用抗原或其抗原性片段免疫所述培養(yǎng)物；鑒定由培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)生的抗原特異性的抗體。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的造血干細(xì)胞選自骨髓干細(xì)胞，外周血干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，臍帶干細(xì)胞，或其它來源的干細(xì)胞。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞在非骨髓細(xì)胞存在下進(jìn)行。
22.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的非骨髓細(xì)胞包括外周血免疫細(xì)胞。
23.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的抗原或其片段是碳水化合物，肽聚糖，蛋白，糖蛋白，病毒，組織團(tuán)塊，細(xì)胞，細(xì)胞碎片，或核酸分子。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述的組織團(tuán)塊，細(xì)胞或細(xì)胞碎片是活的或死的。
25.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的細(xì)胞是人細(xì)胞。
26.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的抗原或其片段與抗原呈遞細(xì)胞相結(jié)合。
27.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的抗原或其片段作為偶聯(lián)物呈遞。
28.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的免疫在佐劑參與下進(jìn)行。
29.如權(quán)利要求19所述的方法產(chǎn)生的抗體。
30.如權(quán)利要求19所述的方法產(chǎn)生的B細(xì)胞。
31.一種B細(xì)胞成熟，選擇，抗原呈遞，或擴(kuò)增的方法，該方法包括用如權(quán)利要求30所述的B細(xì)胞接種另一種培養(yǎng)物。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中，所述的另一種培養(yǎng)物至少是下述之一成人或胎兒脾細(xì)胞，淋巴結(jié)細(xì)胞，或肝細(xì)胞培養(yǎng)物。
33.如權(quán)利要求30所述的B細(xì)胞，其包括漿細(xì)胞或記憶B細(xì)胞。
34.如權(quán)利要求19所述的方法，進(jìn)一步包括分離產(chǎn)生與所述抗原特異結(jié)合的單克隆抗體的細(xì)胞系。
35.如權(quán)利要求34所述的單克隆抗體。
36.如權(quán)利要求34所述的細(xì)胞系。
37.一種治療病人的方法，該方法包括對(duì)病人施用有效劑量的如權(quán)利要求30或33所述的B細(xì)胞。
38.一種治療病人的方法，該方法包括對(duì)病人施用有效劑量的如權(quán)利要求29所述的抗體或如權(quán)利要求35所述的單克隆抗體。
39.一種治療病人的方法，該方法包括對(duì)病人施用有效劑量的如權(quán)利要求36所述的細(xì)胞系。
40.一種產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞的方法，該方法包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，使其生長(zhǎng)或分化成免疫系統(tǒng)細(xì)胞；用抗原或其片段免疫培養(yǎng)物；鑒定由培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)生的抗原特異性的T細(xì)胞。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述的造血干細(xì)胞選自骨髓干細(xì)胞，外周血干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，臍帶干細(xì)胞，或其它來源的干細(xì)胞。
42.如權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述的培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞在非骨髓細(xì)胞存在下進(jìn)行。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，其中，所述的非骨髓細(xì)胞包括外周血免疫細(xì)胞。
44.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述的抗原或其片段是碳水化合物，肽聚糖，蛋白，糖蛋白，病毒，組織團(tuán)塊，細(xì)胞，細(xì)胞碎片，或核酸分子。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中，所述的病毒，組織團(tuán)塊，細(xì)胞，或細(xì)胞碎片是活的或死的。
46.如權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述的T細(xì)胞包括至少下述之一CD3+，CD4+或CD8+細(xì)胞。
47.如權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述的T細(xì)胞具有αβ或γδT細(xì)胞受體。
48.如權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述的T細(xì)胞是初生或記憶T細(xì)胞。
49.如權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述的細(xì)胞是人細(xì)胞。
50.如權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述的抗原或其片段與抗原呈遞細(xì)胞相結(jié)合。
51.如權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述的抗原或其片段作為偶聯(lián)物呈遞。
52.如權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述的免疫在佐劑存在下進(jìn)行。
53.如權(quán)利要求40所述的方法所產(chǎn)生的抗原特異性T細(xì)胞。
54.一種T細(xì)胞成熟，選擇，抗原呈遞，或擴(kuò)增的方法，該方法包括用如權(quán)利要求53所述的抗原特異性T細(xì)胞接種另一種細(xì)胞培養(yǎng)物。
55.如權(quán)利要求54所述的方法，其中，另一種細(xì)胞培養(yǎng)物至少包括下述之一成人或胎兒脾細(xì)胞，胸腺細(xì)胞，淋巴結(jié)細(xì)胞或肝細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。
56.如權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述的抗原是病毒抗原。
57.如權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述的抗原是腫瘤抗原。
58.一種治療病人的方法，該方法包括對(duì)病人施用有效劑量的如權(quán)利要求53所述的抗原特異性T細(xì)胞。
59.一種產(chǎn)生樹狀細(xì)胞的方法，該方法包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，使其生長(zhǎng)或分化成樹狀細(xì)胞。
60.如權(quán)利要求59所述的方法，其中，所述的造血干細(xì)胞選自骨髓干細(xì)胞，外周血干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，臍帶干細(xì)胞，或其它來源的干細(xì)胞。
61.如權(quán)利要求59所述的方法，其中，所述的培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞在非骨髓細(xì)胞存在下進(jìn)行。
62.如權(quán)利要求61所述的方法，其中，所述的非骨髓細(xì)胞包括外周血免疫細(xì)胞。
63.如權(quán)利要求59所述的方法，其中所述的樹狀細(xì)胞選自來自骨髓樣前體細(xì)胞的樹狀細(xì)胞和來自淋巴樣前體細(xì)胞的樹狀細(xì)胞。
64.如權(quán)利要求59所述的方法，其進(jìn)一步包括為獲得樹狀細(xì)胞選擇性的富集細(xì)胞培養(yǎng)物。
65.如權(quán)利要求59所述的方法，其中，所述的產(chǎn)生樹狀細(xì)胞通過向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加樹狀細(xì)胞特異的細(xì)胞因子予以加強(qiáng)。
66.如權(quán)利要求65所述的方法，其中，所述的樹狀細(xì)胞特異的細(xì)胞因子選自IL-4，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子，干細(xì)胞因子，和fms-樣酪氨酸激酶3配體。
67.依如權(quán)利要求59所述方法獲得的樹狀細(xì)胞。
68.一種樹狀細(xì)胞成熟，選擇，抗原-承載或擴(kuò)增的方法，該方法包括用如權(quán)利要求67所述的樹狀細(xì)胞接種另一種細(xì)胞培養(yǎng)物。
69.如權(quán)利要求68所述的方法，其中，所述的另一種培養(yǎng)物至少選自下列培養(yǎng)物之一成人或胎兒脾細(xì)胞，淋巴結(jié)細(xì)胞，或肝細(xì)胞培養(yǎng)物。
70.如權(quán)利要求69所述方法產(chǎn)生的樹狀細(xì)胞。
71.源于如權(quán)利要求65或69所述的樹狀細(xì)胞系。
72.一種治療病人的方法，該方法包括對(duì)病人施用有效劑量的如權(quán)利要求67或69所述的樹狀細(xì)胞。
73.一種治療病人的方法，該方法包括對(duì)病人施用有效劑量的如權(quán)利要求71所述的細(xì)胞系。
74.如權(quán)利要求72所述的方法，其中，所述的樹狀細(xì)胞與抗原相結(jié)合。
75.如權(quán)利要求72所述的方法，其中，所述的樹狀細(xì)胞由基因轉(zhuǎn)染。
76.一種檢測(cè)疫苗的方法，該方法包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，使其生長(zhǎng)或分化成免疫系統(tǒng)細(xì)胞；將所述疫苗施用于培養(yǎng)細(xì)胞；確定所述疫苗是否誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
77.如權(quán)利要求76所述的方法，其中，所述的造血干細(xì)胞選自骨髓干細(xì)胞，外周血干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，臍帶干細(xì)胞，或其它來源的干細(xì)胞。
78.如權(quán)利要求76所述的方法，其進(jìn)一步包括確定所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的類型。
79.如權(quán)利要求76所述的方法，其中，所述的培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞在非骨髓細(xì)胞存在下進(jìn)行。
80.如權(quán)利要求76所述的方法，其中，所述的檢測(cè)包括用由一個(gè)以上種群的個(gè)體所獲得的細(xì)胞進(jìn)行效力篩選。
81.一種鑒定與免疫系統(tǒng)細(xì)胞的發(fā)育和功能相關(guān)的基因的方法，該方法包括改變?cè)煅杉?xì)胞中基因的表達(dá)；在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞；確定是否表達(dá)改變了的基因?qū)е滤囵B(yǎng)細(xì)胞表型的改變。
82.如權(quán)利要求81所述的方法，其中，所述的造血干細(xì)胞選自骨髓干細(xì)胞，外周血干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，臍帶干細(xì)胞，或其它來源的干細(xì)胞。
83.如權(quán)利要求81所述的方法，其中，所述的培養(yǎng)造血干細(xì)胞在非骨髓細(xì)胞存在下進(jìn)行。
84.一種篩選與免疫系統(tǒng)細(xì)胞發(fā)育和功能相關(guān)的方法，該方法包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞；通過基因克隆技術(shù)鑒定培養(yǎng)細(xì)胞中的基因表達(dá)。
85.如權(quán)利要求84所述的方法，其中，所述的造血干細(xì)胞選自骨髓干細(xì)胞，外周血干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，臍帶干細(xì)胞，或其它來源的干細(xì)胞。
86.如權(quán)利要求84所述的方法，其中，所述的培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞在非骨髓細(xì)胞存在下進(jìn)行。
87.如權(quán)利要求84所述的方法，其進(jìn)一步包括將培養(yǎng)細(xì)胞中的基因表達(dá)圖譜與非免疫細(xì)胞或未分化細(xì)胞相比較。
88.如權(quán)利要求84所述的方法，其進(jìn)一步包括將培養(yǎng)細(xì)胞中的基因表達(dá)與具有不同免疫細(xì)胞譜的培養(yǎng)細(xì)胞相比較。
89.如權(quán)利要求84所述的方法，其進(jìn)一步包括比較培養(yǎng)物和非免疫產(chǎn)生的培養(yǎng)物之間的基因表達(dá)；并鑒定第一、二種培養(yǎng)物間表達(dá)發(fā)生改變的基因。
90.一種確定藥物毒性的方法，該方法包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，使其生長(zhǎng)或分化成免疫系統(tǒng)細(xì)胞；將藥物施用于培養(yǎng)細(xì)胞；確定所述藥物是否對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞具有毒性。
91.如權(quán)利要求90所述的方法，其中，所述的造血干細(xì)胞選自骨髓干細(xì)胞，外周血干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，臍帶干細(xì)胞，或其它來源的干細(xì)胞。
92.如權(quán)利要求90所述的方法，其中，所述的培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞在非骨髓細(xì)胞存在下進(jìn)行。
93.如權(quán)利要求92所述的方法，其中，所述的非骨髓細(xì)胞包含外周血免疫細(xì)胞。
94.在如權(quán)利要求90所述的方法中存活的細(xì)胞。
95.一種確定藥物功效的方法，該方法包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，使其生長(zhǎng)或分化成免疫系統(tǒng)細(xì)胞；將藥物施用于培養(yǎng)細(xì)胞；確定所述藥物是否導(dǎo)致培養(yǎng)細(xì)胞表型的改變。
96.如權(quán)利要求95所述的方法，其中，所述的造血干細(xì)胞選自骨髓干細(xì)胞，外周血干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，臍帶干細(xì)胞，或其它來源的干細(xì)胞。
97.如權(quán)利要求95所述的方法，其中，所述的培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞在非骨髓細(xì)胞存在下進(jìn)行。
98.如權(quán)利要求95所述的方法，其中，所述的藥物提高免疫系統(tǒng)細(xì)胞的產(chǎn)量。
99.如權(quán)利要求97所述的方法，其中，所述的非骨髓細(xì)胞包括外周血免疫細(xì)胞。
100.如權(quán)利要求95所述的方法，其中所述的藥物抑制免疫系統(tǒng)細(xì)胞的增殖。
101.如權(quán)利要求95所述的方法，其中，所述的藥物選自核酸，經(jīng)修飾的核酸，抗體，化學(xué)治療劑，和細(xì)胞因子。
102.如權(quán)利要求95所述的方法中存活的細(xì)胞。
103.一種治療病人的方法，該方法包括對(duì)病人施用有效劑量的如權(quán)利要求102所述的存活細(xì)胞。
104.一種基因治療的方法，該方法包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，使其生長(zhǎng)或分化成免疫系統(tǒng)細(xì)胞；對(duì)所述培養(yǎng)細(xì)胞施用基因。
105.如權(quán)利要求104所述的方法，其中，所述的造血干細(xì)胞選自骨髓干細(xì)胞，外周血干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，臍帶干細(xì)胞，或其它來源的干細(xì)胞。
106.一種細(xì)胞生長(zhǎng)和擴(kuò)增的方法，該方法包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，使其生長(zhǎng)或分化成免疫系統(tǒng)細(xì)胞；轉(zhuǎn)染免疫系統(tǒng)細(xì)胞并用轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種另一種細(xì)胞培養(yǎng)物。
107.如權(quán)利要求104所述的方法，其中，所述的培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞在非骨髓細(xì)胞存在下進(jìn)行。
108.由權(quán)利要求104所述的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)免疫系統(tǒng)細(xì)胞。
109.如權(quán)利要求104所述的方法，其進(jìn)一步包括將經(jīng)所述基因轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)細(xì)胞引入病人。
110.如權(quán)利要求104所述的方法，其中，所述的基因靶定免疫系統(tǒng)細(xì)胞。
111.如權(quán)利要求104所述的方法，其中，所述培養(yǎng)物包含輔助細(xì)胞，該輔助細(xì)胞帶有包含待導(dǎo)入基因的載體。
112.一種監(jiān)控HIV感染進(jìn)程的方法，該方法包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，及使其生長(zhǎng)或分化為免疫系統(tǒng)細(xì)胞；向所培養(yǎng)的細(xì)胞中引入HIV病毒；監(jiān)控HIV在培養(yǎng)細(xì)胞中的數(shù)量和定位。
113.一種HIV-感染細(xì)胞生長(zhǎng)和擴(kuò)增的方法，該方法包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，及使其生長(zhǎng)或分化為免疫系統(tǒng)細(xì)胞；向所培養(yǎng)的細(xì)胞中引入HIV病毒；用HIV-感染的細(xì)胞接種另一種細(xì)胞培養(yǎng)物。
114.如權(quán)利要求112所述的方法，其中，所述的造血干細(xì)胞選自骨髓干細(xì)胞，外周血干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，臍帶干細(xì)胞，或其它來源的干細(xì)胞。
115.如權(quán)利要求112所述的方法，其中，所述的培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞在非骨髓細(xì)胞存在下進(jìn)行。
116.一種測(cè)定抑制或治療HIV的藥物的方法。該方法包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，使其生長(zhǎng)或分化為免疫系統(tǒng)細(xì)胞；向所培養(yǎng)的細(xì)胞中引入HIV病毒；對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞施用某種藥物；監(jiān)控在培養(yǎng)細(xì)胞中的HIV的數(shù)量和定位。
117.如權(quán)利要求116所述的方法，其中，所述的造血干細(xì)胞選自骨髓干細(xì)胞，外周血干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，臍帶干細(xì)胞，或其它來源的干細(xì)胞。
118.一種細(xì)胞生長(zhǎng)和擴(kuò)增的方法，該方法包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，使其生長(zhǎng)或分化為免疫系統(tǒng)細(xì)胞；向所培養(yǎng)的細(xì)胞中引入HIV病毒；對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞施用某種藥物；用HIV-感染并暴露于藥物中的細(xì)胞接種另一種培養(yǎng)物。
119.如權(quán)利要求111所述的方法，其中，所述的藥物在HIV病毒引入培養(yǎng)細(xì)胞之后施用。
120.如權(quán)利要求118所述的方法，其中，所述的藥物在HIV病毒引入培養(yǎng)細(xì)胞之前或其間施用。
121.如權(quán)利要求118所述的方法，其中，所述的培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞在非骨髓細(xì)胞存在下進(jìn)行。
122.一種自然殺傷細(xì)胞成熟，選擇，抗原呈遞或擴(kuò)增的方法，該方法包括用如權(quán)利要求6所述的自然殺傷細(xì)胞接種另一種細(xì)胞培養(yǎng)物。
123.一種治療病人的方法，該方法包括對(duì)病人施用有效劑量的如權(quán)利要求6所述的自然殺傷細(xì)胞。
124.一種治療病人的方法，該方法包括對(duì)病人施用有效劑量的如權(quán)利要求122所述的另一種細(xì)胞培養(yǎng)物中的自然殺傷細(xì)胞。
125.一種產(chǎn)生免疫系統(tǒng)細(xì)胞的方法，該方法包括在三維支持物上培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞，使其生長(zhǎng)或分化為免疫系統(tǒng)細(xì)胞。
126.如權(quán)利要求125所述的方法，其中，所述的免疫系統(tǒng)細(xì)胞選自T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞，抗原呈遞細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞，初生細(xì)胞，活化的細(xì)胞，記憶細(xì)胞，和其祖細(xì)胞或前體細(xì)胞。
127.如權(quán)利要求126所述的方法，其中，所述的T淋巴細(xì)胞至少包括下述之一CD4+，CD8+，CD3+，或TdT+細(xì)胞。
128.如權(quán)利要求126所述的方法，其中所述的T淋巴細(xì)胞具有αβ或γδT細(xì)胞受體。
129.如權(quán)利要求126所述的方法，其中，所述的B淋巴細(xì)胞至少包含下述之一CD19+，CD20+，CD21+，CD10+，TdT+，CD5+，Ig+，胞漿mu鏈+或漿細(xì)胞。
130.如權(quán)利要求125-129的方法所產(chǎn)生的免疫系統(tǒng)細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供培養(yǎng)的免疫系統(tǒng)細(xì)胞和培養(yǎng)方法。該方法包括:在具有覆蓋或環(huán)繞著培養(yǎng)基的臺(tái)架的小室中培養(yǎng)基質(zhì)和造血干細(xì)胞,其中的臺(tái)架使得造血干細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞在三維空間進(jìn)行細(xì)胞間接觸。本發(fā)明的免疫系統(tǒng)細(xì)胞用于篩選抑制或刺激免疫系統(tǒng)的藥物。本發(fā)明的免疫系統(tǒng)細(xì)胞還用于治療免疫系統(tǒng)疾病。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1423523SQ00818454
公開日2003年6月11日 申請(qǐng)日期2000年11月17日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月17日
發(fā)明者J·H·D·吳, A·曼塔拉里斯 申請(qǐng)人:羅切斯特大學(xué)