專利名稱：大孔脫乙酰殼多糖小珠及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大孔脫乙酰殼多糖小珠，以及制備大孔脫乙酰殼多糖小珠的方法。更具體地，本發(fā)明涉及細胞附著性、生物相容性和生物降解性均優(yōu)異的大孔脫乙酰殼多糖小珠，由此用于細胞生長、血管生成和營養(yǎng)擴散，以及制備大孔脫乙酰殼多糖小珠的方法。此外，本發(fā)明還涉及應(yīng)用該大孔脫乙酰殼多糖小珠培養(yǎng)動物和植物細胞的方法。
到目前為止，已有許多天然聚合物和合成聚合物用作細胞培養(yǎng)的基體。例如，PGA(聚乙醇酸)網(wǎng)用于制備三維、多孔骨替代物，它可以使許多細胞附著到其上，除了能夠支持快速組織再生外，它還具有優(yōu)異的生物可降解性(Vunjak-Nonakovi，G.等，Journal of Biotechnology Progress，Vol.14，193-202，1998)。Du，C.等合成了nHAC(納-HAp/膠原)(Journal ofBiomedical Materials Research，Vol.44，407-415，1999)。PLLA(聚-L乳酸)成功地用于培養(yǎng)成骨細胞(Lo等，Journal of Biomedical Materials Research，Vol.30，475-484，1996；Evans，G.R.等，Journal of Biomaterials，Vol.20，1109-1115，1999)。應(yīng)用溶劑-灌制、微粒-瀝濾方法，PGA和PLLA能形成網(wǎng)或三維多孔支架結(jié)構(gòu)，軟骨細胞能在其上生長(Freed等，Journal of BiomedicalMaterials Research Vol.27，11-23，1993)。并試圖從與纖維蛋白原結(jié)合的PEG(聚乙二醇)制備的多孔性基體培養(yǎng)成纖維細胞(Pandit，A.S.等，Journalof Biomaterials Application，vol.12，222-236)。應(yīng)用PLLA或PLGA(聚-D，L-乳酸-共-羥基乙酸)的氯仿溶液噴霧-灌制方法形成的管狀PGA，也能成功地培養(yǎng)成纖維細胞，表明其具有改善的抗壓強度。
為了進行有效的細胞培養(yǎng)，多孔基體最基本的是允許一些細胞在有限的空間內(nèi)容易且均勻地盡可能附著其上，并且有助于細胞生長。然而，上述基體不能令人滿意地符合這些需要。
被推薦用來補充上述基體缺陷的是小珠樣基體。在外傷情況下對有止血作用的具有生長因子特性的各種生物相容性材料的研究中，發(fā)現(xiàn)帶正電荷的小珠有更好的止血效果(Wu，L.等，Journal of Surgical Research，vol.85，43-50，1999)。藻酸鹽小珠用于培養(yǎng)軟骨細胞，細胞培養(yǎng)1-2天后，加入IL-1β(白細胞介素-1β)，促進形成胞外基體(Beekman，B.等，OsteoarthritisCartilage，Vol.5，330-340，1998)。
另外，已經(jīng)從明膠、膠原、透明質(zhì)酸、纖維素和玻璃研制出用于細胞培養(yǎng)的其他多孔基體。通過加入HEMA(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)和EDM(乙二醇二甲基丙烯酸酯)使多孔明膠小珠聚合，并通過反復(fù)冷凍和解凍循環(huán)使之形成多孔。
這種明膠小珠可以允許各種細胞附著于其上。之后，將細胞移植到組織，以便研究組織取代。小珠可以根據(jù)材料改變尺寸，但不適用于細胞培養(yǎng)，因為它們的孔徑太小，僅為0.7到2.6μm。小珠基體具有這樣的優(yōu)點，即在有限空間內(nèi)容納大量細胞，能夠使細胞生長良好，并有效釋放產(chǎn)物。然而，藻酸鹽或明膠制成的小珠基體難以形成理想孔徑的小孔，難以使細胞在其上或其中均勻分布。膠原或玻璃制成的小珠，在生物相容性方面較差。因此，考慮到細胞的多功能性和吸附強度，這些小珠不適于用作細胞吸附的基體。
為了在通過細胞移植而進行的組織取代研究中有效使用，聚合物需要具有細胞附著能力和生物相容性、生物降解、可塑性和多孔性。合成聚合物在尺寸和形狀的可塑性方面優(yōu)越于天然聚合物，然后它們在生物相容性和生物降解性方面卻較差。因此，合成聚合物在直接組織移植時易于造成各種副作用。基于這些原因，對安全且具有廣泛用途的天然聚合物的研究很活躍。
殼多糖，脫乙酰殼多糖的前體，發(fā)現(xiàn)在甲殼類動物例如螃蟹和小蝦的貝殼中，昆蟲，真菌的細胞壁中，蘑菇和細菌中大量存在。它是彼此經(jīng)(1→4)-β-糖苷鍵連接而成的由N-乙酰-D-氨基葡萄糖重復(fù)單元構(gòu)成的聚合物。脫乙酰殼多糖，一種用高濃度堿對殼多糖進行N-脫乙基化而制備的堿性多糖，已知具有比上述合成聚合物更優(yōu)越的細胞附著性、生物相容性、生物降解性、和可塑性。
由于具有這些優(yōu)點，已經(jīng)進行了一些嘗試用脫乙酰殼多糖作為細胞培養(yǎng)的基體。例如，戊二醛-交聯(lián)的脫乙酰殼多糖和果糖修飾的脫乙酰殼多糖用作培養(yǎng)肝細胞的基體(Yagi，等，Biological Pharmaceutical Bulletin，Vol.20，No.6，708-710 & Vol.20，No.12，1290-1294，1997)。這些脫乙酰殼多糖基體可以通過將戊二醛或果糖與純化的脫乙酰殼多糖混合制備，以增強細胞附著能力和形成所需的性狀。然而，用這些修飾的脫乙酰殼多糖基體進行的細胞培養(yǎng)不能超越二維培養(yǎng)系統(tǒng)，因為細胞僅被吸附在基體表面。
通過各種冷凍干燥技術(shù)研制出具有理想孔徑的脫乙酰殼多糖薄膜并用于組織培養(yǎng)工程(Madihally，S.V.等，Journal of Biomatials，Vol.20，1133-1142，1999)。這些脫乙酰殼多糖薄膜在提供理想尺寸的孔方面非常有意義，但仍然限于二維細胞培養(yǎng)技術(shù)。
另外，報道了通過冷凍干燥制備的脫乙酰殼多糖小珠(Tzu-Yang，等，Joumal of Industrial Engineering Chemical Research，Vol.36，3631-3638，1997)。通過將戊二醛交聯(lián)到脫乙酰殼多糖小珠的氨基殘基上而修飾脫乙酰殼多糖小珠，測定顯示對鎘離子具有高吸附率。
在來自USPTO，1999的Wolfgang，G.等的文件中還發(fā)現(xiàn)新的脫乙酰殼多糖小珠。他們報道使用非磁性琥珀酸酐使脫乙酰殼多糖小珠附帶羧基。將它們與FeCl2反應(yīng)，然后用過量水沖洗，提供磁性脫乙酰殼多糖小珠，其可以用于純化蛋白質(zhì)或吸附磁性材料。由于它們孔徑很小，這種多孔脫乙酰殼多糖被用于吸附和/或純化離子或磁性材料。然而，沒有發(fā)現(xiàn)使用多孔脫乙酰殼多糖小珠作為細胞培養(yǎng)的基體。
基于脫乙酰殼多糖的優(yōu)秀細胞吸附能力、生物相容性、生物降解性和可塑生，研究它用于制備具有均勻分布的大孔，從而可以很好培養(yǎng)細胞的大孔小珠。本發(fā)明人經(jīng)過完全深入的研究，發(fā)現(xiàn)脫乙酰殼多糖溶液在有機溶劑中發(fā)生相分離，從而大孔脫乙酰殼多糖小珠在其上和其內(nèi)能夠形成均勻的孔，因而完成本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的一個目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中出現(xiàn)的問題，提供在其上和其內(nèi)具有均勻孔的大孔脫乙酰殼多糖小珠。
本發(fā)明的另一個目的是提供具有較大表面積從而將細胞吸附到其上的大孔脫乙酰殼多糖小珠。
本發(fā)明的再一個目的是提供在細胞附著能力、生物相容性、和生物降解性方面表現(xiàn)優(yōu)越的大孔脫乙酰殼多糖小珠，因此用于細胞生長、血管發(fā)生和營養(yǎng)擴散。
本發(fā)明的再一個目的是提供制備大孔脫乙酰殼多糖小珠的方法。
本發(fā)明的進一步目的是提供用大孔脫乙酰殼多糖小珠培養(yǎng)動物細胞和植物細胞的方法。
圖2是細胞尚未在小珠表面和內(nèi)部培養(yǎng)前，本發(fā)明的多孔脫乙酰殼多糖小珠的橫截面的SEM照片。
圖3是將肝細胞在多孔脫乙酰殼多糖小珠表面和內(nèi)部培養(yǎng)10天后，本發(fā)明的多孔脫乙酰殼多糖小珠表面的SEM照片。
發(fā)明詳述在公開和描述本發(fā)明的大孔脫乙酰殼多糖小珠和其制備方法之前，應(yīng)當理解其中使用的術(shù)語僅是為了描述具體實施方式
的目的，不是為了限制目的。
本發(fā)明使用的術(shù)語“脫乙酰殼多糖溶液”意味著含脫乙酰殼多糖的乙酸水溶液。本發(fā)明使用的術(shù)語“脫乙酰殼多糖水溶液”意味著水溶性脫乙酰殼多糖在去離子水中的溶液。
另外，本發(fā)明使用的術(shù)語“脫乙酰殼多糖小珠”或“多孔脫乙酰殼多糖小珠”意味著從脫乙酰殼多糖溶液、脫乙酰殼多糖水溶液或其混合物制備的具有相對均勻孔的1-4mm的多孔脫乙酰殼多糖顆粒。
同時，本發(fā)明使用的術(shù)語“基體”或“細胞培養(yǎng)的基體”指固體支持物或載體，細胞附著其上，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)從而增殖。
一方面，本發(fā)明涉及用于細胞培養(yǎng)的多孔小珠，它具有優(yōu)秀的生物相容性、生物降解性、細胞附著能力和可塑性，并且它具有尺寸大而均勻的孔。由于具有這些優(yōu)點，多孔脫乙酰殼多糖小珠上非常有用的基體，各種動物細胞和植物細胞都能夠在其上培養(yǎng)。本發(fā)明的多孔脫乙酰殼多糖小珠能夠用作培養(yǎng)各種動物和植物細胞的基體，具體地用于培養(yǎng)肝細胞、成纖維細胞、成骨細胞、上皮細胞和病毒包裝細胞。
至于本發(fā)明的多孔脫乙酰殼多糖小珠的孔，它們優(yōu)選在1-500μm范圍內(nèi)，更優(yōu)選在5-200μm范圍內(nèi)。小珠大小優(yōu)選在0.1到10mm范圍內(nèi)，更優(yōu)選1到4mm。
另一方面，本發(fā)明涉及制備多孔脫乙酰殼多糖小珠的方法。從脫乙酰殼多糖溶液、脫乙酰殼多糖水溶液或其混合物開始制備脫乙酰殼多糖小珠。如上所述，脫乙酰殼多糖溶液通過將脫乙酰殼多糖溶解到乙酸水溶液中制備，而脫乙酰殼多糖水溶液通過將水溶性脫乙酰殼多糖溶解到去離子水中而制備。接下來，將上述溶液滴加到低溫的有機溶劑中或液氮中，得到小珠。最后，將脫乙酰殼多糖小珠冷凍干燥。
因為脫乙酰殼多糖在酸中是可溶的，水溶性脫乙酰殼多糖在水中表現(xiàn)良好溶解性。在本發(fā)明中有用的脫乙酰殼多糖具有平均分子量5,000-1,000,000。優(yōu)選的水溶性脫乙酰殼多糖的平均分子量范圍為5,000-1,000,000。對于溶解脫乙酰殼多糖，乙酸溶液優(yōu)選濃度為0.1-10％重量。溶解完成后，脫乙酰殼多糖在乙酸溶液中的優(yōu)選存在量以重量計為0.1-20％。當被溶解于去離子水時，水溶性脫乙酰殼多糖優(yōu)選濃度以重量計為0.5到1.5％。濃度越高導(dǎo)致孔徑越小。因此，當脫乙酰殼多糖的濃度高于4％時，形成非常小的孔，只能限于誘導(dǎo)和生長細胞。
如果脫乙酰殼多糖單獨與水溶性脫乙酰殼多糖一起使用，脫乙酰殼多糖優(yōu)選與水溶性脫乙酰殼多糖以1∶9-9∶1的重量比混合。水溶性脫乙酰殼多糖的比例越高，孔的尺寸越大。
本發(fā)明使用的有機溶劑的例子包括氯代環(huán)己烷、氯代戊烷、正己烷、二氯甲烷、氯仿、和乙酸乙酯。由于溶解性和溶解溫度方面的差異，這些低熔點而又不溶解脫乙酰殼多糖的有機溶劑在通過相分離固化脫乙酰殼多糖中非常有用。從不同有機溶劑對孔大小影響的試驗中可以看出，氯代戊烷比二氯代戊烷制成的孔更大。
優(yōu)選有機溶劑維持在穩(wěn)定的低溫條件下。如果維持恒定的溫度出現(xiàn)波動，多孔小珠表面突然溶解，從而失去了它的多孔性，以至于破壞了細胞附著和幫助細胞發(fā)揮它們功能必需的三維結(jié)構(gòu)。有機溶劑優(yōu)選維持在-5到-65℃，液氮在大約-198℃。例如，低溫導(dǎo)致較小孔徑。另一方面，如果有機溶劑維持太高溫度，基于溫度差異的相分離將不會發(fā)生。本發(fā)明最優(yōu)選的條件包括將1％脫乙酰殼多糖溶液加入溫度維持在-5到-25℃的氯代戊烷中和將1％脫乙酰殼多糖水溶液加入溫度維持在-5到-25℃的氯仿中。
為了維持有機溶劑的低溫，使用干冰或通過冷凍儀冷凍的冰乙醇。或者，可以使用約-198℃的液氮。
由此制備的多孔脫乙酰殼多糖小珠是大小均勻的，粒徑分布在1到4mm范圍內(nèi)。為了用作細胞培養(yǎng)的基體，多孔脫乙酰殼多糖小珠必須進行各種預(yù)處理，例如，冷凍干燥、中和以除去殘留的酸和有機溶劑、用乙醇消毒、填充培養(yǎng)基、然后再次冷凍干燥。
在進一步方面，本發(fā)明涉及用多孔脫乙酰殼多糖小珠培養(yǎng)動物細胞和植物細胞的方法。首先，將制成的多孔脫乙酰殼多糖小珠浸沒到培養(yǎng)基中后，進行預(yù)培養(yǎng)，以使細胞附著到多孔脫乙酰殼多糖小珠上。除去未附著細胞后，增殖附著細胞，同時用新鮮培養(yǎng)基更換老培養(yǎng)基。為細胞附著的預(yù)培養(yǎng)優(yōu)選進行4-6小時。優(yōu)選培養(yǎng)基每兩到三天更換一次。
在涉及脫乙酰殼多糖和乙酸的濃度以及有機溶劑的種類和溫度的多種條件下，制備多孔脫乙酰殼多糖小珠，并用作培養(yǎng)包括肝細胞、成纖維細胞、成骨細胞、內(nèi)皮細胞、和病毒包裝細胞在內(nèi)的各種細胞的基體。
結(jié)果，根據(jù)制備條件形成各種尺寸的孔。具體地說，當有機溶劑維持在較低溫度下或脫乙酰殼多糖溶液或脫乙酰殼多糖水溶液濃度增加時，發(fā)現(xiàn)多孔脫乙酰殼多糖小珠的孔變小。也就是說，脫乙酰殼多糖溶液或脫乙酰殼多糖水溶液發(fā)生相分離的溫度和脫乙酰殼多糖溶液或脫乙酰殼多糖水溶液的濃度確定孔大小。有機溶劑的種類也影響脫乙酰殼多糖小珠孔大小的確定。使用氯代戊烷時，測定的孔徑最大。另一方面，二氯代戊烷產(chǎn)生最小的孔。在使用脫乙酰殼多糖和水溶性脫乙酰殼多糖混合物時，當脫乙酰殼多糖和水溶性脫乙酰殼多糖的比例為4∶6時得到最大的孔。相同濃度的脫乙酰殼多糖和水溶性脫乙酰殼多糖之間的比較得出這樣的結(jié)論，即脫乙酰殼多糖比水溶性脫乙酰殼多糖在增加孔徑方面更為有利。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1％脫乙酰殼多糖水溶液和溫度為-5到-25℃的氯仿、或者1％脫乙酰殼多糖溶液和溫度為-5到-25℃的氯代戊烷能夠得到孔最大的脫乙酰殼多糖小珠。
與常規(guī)基體相比，通過本發(fā)明方法制備的多孔脫乙酰殼多糖小珠在吸附各種動物和植物細胞方面表現(xiàn)優(yōu)越性。當被吸附到多孔脫乙酰殼多糖小珠上后2-3天中，細胞生長到小珠內(nèi)部以及覆蓋小珠表面。另外，用本發(fā)明的基體培養(yǎng)的肝細胞通過各種生化試驗測定發(fā)現(xiàn)，維持了它們的細胞功能。
表1有機溶劑溫度變化對小珠孔徑大小的改變
如表1所示，當在除了有機溶劑的溫度以外所有參數(shù)相同的條件下應(yīng)用1％脫乙酰殼多糖制備多孔脫乙酰殼多糖小珠時，在更低溫度下得到的孔徑更小。實施例2應(yīng)用1％脫乙酰殼多糖和多種有機溶劑制備多孔小珠按照類似于實施例1的方法制備脫乙酰殼多糖小珠，除了使用含有1％重量脫乙酰殼多糖的1％乙酸水溶液，和各種有機溶劑如氯代戊烷、正己烷、二氯代戊烷、氯仿和乙酸乙酯，溫度維持在-5至-25℃。
借助掃描電子顯微鏡觀察脫乙酰殼多糖小珠，并測定孔徑。結(jié)果如下表2所示。
表2不同有機溶劑對小珠孔徑大小的改變
在除了有機溶劑以外所有參數(shù)相同的條件下，測定脫乙酰殼多糖小珠的平均孔徑大小為應(yīng)用氯仿的最小，應(yīng)用氯代戊烷的最大。實施例3應(yīng)用2％脫乙酰殼多糖和氯代戊烷制備多孔小珠按照類似于實施例1的方法制備脫乙酰殼多糖小珠，除了使用含有2％重量脫乙酰殼多糖的1％乙酸水溶液，和溫度維持在-5至-15℃和-15至-25℃的氯代戊烷。
借助掃描電子顯微鏡觀察脫乙酰殼多糖小珠，并測定孔徑。脫乙酰殼多糖的濃度對孔徑大小改變的結(jié)果如下表2所示。
表3脫乙酰殼多糖的濃度對孔徑大小改變
從表3可以明顯發(fā)現(xiàn)隨脫乙酰殼多糖溶液濃度的增加脫乙酰殼多糖小珠具有更小的平均孔徑。實施例4應(yīng)用在1-4％乙酸水溶液中的2％脫乙酰殼多糖溶液和氯代戊烷制備多孔小珠按照類似于實施例1的方法制備脫乙酰殼多糖小珠，除了使用在1、2、3和4％乙酸水溶液中的2％(wt)脫乙酰殼多糖和溫度維持在-15至-25℃的氯代戊烷。
借助掃描電子顯微鏡觀察顯示多孔脫乙酰殼多糖小珠的孔徑大小范圍在10至80μm。觀察結(jié)果以及實施例3的結(jié)果在下表4中給出。從表4發(fā)現(xiàn)乙酸溶液的濃度越高導(dǎo)致更大的孔徑。表4乙酸的濃度對孔徑大小改變
實施例5應(yīng)用2％脫乙酰殼多糖和液氮制備多孔小珠按照類似于實施例1的方法制備脫乙酰殼多糖小珠，除了使用在1％乙酸水溶液中的2％(wt)脫乙酰殼多糖和液氮。
借助掃描電子顯微鏡觀察顯示多孔脫乙酰殼多糖小珠的孔徑大小范圍在5至50μm。該觀察結(jié)果與實施例1的數(shù)據(jù)一致，其推導(dǎo)出的結(jié)論是低溫使孔徑變小，原因是液氮的溫度遠遠低于有機溶劑。實施例6應(yīng)用2％脫乙酰殼多糖和氯代環(huán)己烷制備多孔小珠按照類似于實施例1的方法制備脫乙酰殼多糖小珠，除了使用在1％乙酸水溶液中的2％(wt)脫乙酰殼多糖，和溫度維持在-5至-15℃、-15至-25℃和-25至-50℃的氯代環(huán)己烷。
借助掃描電子顯微鏡觀察顯示多孔脫乙酰殼多糖小珠的孔徑大小范圍在10至150μm。這些觀察結(jié)果在下表5中給出。表5應(yīng)用2％脫乙酰殼多糖得到的有機溶劑溫度變化對小珠孔徑大小的改變
如表5所示，在除了有機溶劑溫度以外所有參數(shù)相同的條件下，測定的脫乙酰殼多糖小珠的平均孔徑與應(yīng)用氯代戊烷得到的結(jié)果相似，即隨溫度下降孔徑變小。實施例7應(yīng)用脫乙酰殼多糖和水溶性脫乙酰殼多糖的混合物在氯代戊烷中制備多孔小珠按照類似于實施例1的方法制備脫乙酰殼多糖小珠，除了使用1％(wt)的脫乙酰殼多糖和水溶性脫乙酰殼多糖的混合物(Jakwang Co.Ltd.，Korea)的溶液，二者的比例分別為8∶2、6∶4、4∶6和2∶8，溫度維持在-5至-25℃和-25至-45℃的氯代戊烷。
借助掃描電子顯微鏡觀察顯示多孔脫乙酰殼多糖小珠的孔徑大小范圍在10至120μm?；旌衔锏谋壤陀袡C溶劑的溫度對孔徑大小的改變在下表6中給出。表6脫乙酰殼多糖和水溶件脫乙酰殼多糖的比例對小珠孔徑大小的改變
如表6所示，水溶性脫乙酰殼多糖的比例越高，使孔徑變大，而氯代戊烷的溫度幾乎不影響孔徑大小。特別是應(yīng)用脫乙酰殼多糖和水溶性脫乙酰殼多糖4∶6的混合物，脫乙酰殼多糖小珠顯示出最大的平均孔徑，其測定范圍在30至120μm。實施例8應(yīng)用水溶性脫乙酰殼多糖在氯代戊烷中制備多孔小珠按照類似于實施例1的方法制備脫乙酰殼多糖小珠，除了使用1％(wt)的水溶性脫乙酰殼多糖在去離子水中的溶液，和溫度維持在-5至-25℃、-25至-45℃和-45至-65℃的氯代戊烷。
借助掃描電子顯微鏡觀察顯示多孔脫乙酰殼多糖小珠的孔徑大小范圍在10至70μm。測定小珠的孔徑大小，結(jié)果在下表7中給出。表7應(yīng)用水溶性脫乙酰殼多糖得到的有機溶劑溫度變化對小珠孔徑大小的改變
從表7可明顯發(fā)現(xiàn)應(yīng)用水溶性脫乙酰殼多糖溶液制備的脫乙酰殼多糖小珠的孔徑尺寸小于脫乙酰殼多糖溶液制備的脫乙酰殼多糖小珠。此外，不像脫乙酰殼多糖溶液制備的脫乙酰殼多糖小珠，這些水溶性脫乙酰殼多糖溶液制備的脫乙酰殼多糖小珠孔徑隨溫度改變不大。實施例9應(yīng)用水溶性脫乙酰殼多糖和各種有機溶劑制備多孔小珠按照類似于實施例1的方法制備脫乙酰殼多糖小珠，除了使用1％(wt)的水溶性脫乙酰殼多糖在去離子水中的溶液，和各種有機溶劑如氯代戊烷、正己烷、二氯代戊烷、氯仿和乙酸乙酯，溫度維持在-5至-25℃。
借助掃描電子顯微鏡觀察顯示脫乙酰殼多糖小珠的孔徑大小范圍在20至200μm。當從水溶性脫乙酰殼多糖制備時，測定應(yīng)用各種溶劑制備的脫乙酰殼多糖小珠。結(jié)果在下表8中給出。
表8不同有機溶劑對水溶性脫乙酰殼多糖小珠孔徑大小的改變
如表8所示，對于從水溶性脫乙酰殼多糖溶液制備的脫乙酰殼多糖小珠，當應(yīng)用氯仿作為有機溶劑比應(yīng)用其它有機溶劑形成更大的孔徑。另一方面，從脫乙酰殼多糖溶液制備的脫乙酰殼多糖小珠應(yīng)用氯代戊烷得到最大的孔徑(表2)。根據(jù)這些結(jié)果，從脫乙酰殼多糖溶液或水溶性脫乙酰殼多糖溶液制備的脫乙酰殼多糖小珠的孔徑大小受到有機溶劑種類的影響。實驗實施例1肝細胞的培養(yǎng)實施例1制備的具有50-150μm孔的1-4mm多孔脫乙酰殼多糖小珠用5N氫氧化鈉/醇溶液中和，以去除殘留的酸和有機溶劑，然后用70％乙醇消毒。將脫乙酰殼多糖小珠浸泡過培養(yǎng)基(DMEM，pH 7.4，GibcoBRL，USA)后，再將其冷凍干燥。將冷凍干燥的脫乙酰殼多糖小珠浸沒到培養(yǎng)基中，然后來自大鼠的肝細胞在小珠上附著。為了該附著步驟，進行4-6小時的預(yù)培養(yǎng)。為了去除殘留的未附著的細胞，用新鮮培養(yǎng)基更換舊培養(yǎng)基。之后，每隔兩到三天更換一次培養(yǎng)基，連續(xù)1-10天，附著到脫乙酰殼多糖小珠上的肝細胞在37℃培養(yǎng)。成團后，在掃描電鏡下觀察細胞在脫乙酰殼多糖小珠孔中以及整個表面生長，如圖3所示。實驗實施例2NIH3T3細胞的培養(yǎng)用成纖維細胞NIH3T3(ATCC HB-11601，USA)，按照實驗實施例1的同樣方法進行細胞培養(yǎng)。
在掃描電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細胞牢固地附著在脫乙酰殼多糖小珠上，并且在孔中生長。另外，觀察到成纖維細胞生長迅速，并且彼此穩(wěn)定接觸。實驗實施例3MC3T3-E1細胞的培養(yǎng)用成骨細胞MC3T3-E1(漢城國立大學(xué)醫(yī)學(xué)院的韓國細胞系庫，漢城，韓國)細胞，按照實驗實施例1的同樣方法進行細胞培養(yǎng)。
在掃描電鏡下，觀察到這些細胞穩(wěn)定附著于脫乙酰殼多糖小珠并且生長良好。實驗實施例4CHO-K1細胞的培養(yǎng)用上皮細胞CHO-K1(ATCC CCL-61，USA)，按照實驗實施例1的相同方法，進行細胞培養(yǎng)。
在掃描電鏡下，觀察到這些細胞牢固附著于脫乙酰殼多糖小珠，并且生長良好。實驗實施例5PT67細胞的培養(yǎng)用包裝細胞PT67(漢城國立大學(xué)醫(yī)學(xué)院的韓國細胞系庫，漢城，韓國)，按照實驗實施例1中的同樣方法，進行細胞培養(yǎng)。
在掃描電鏡下，觀察到這些細胞不僅牢固附著于脫乙酰殼多糖小珠，同時大量分泌胞外基體，而且生長迅速。工業(yè)實用性如上所述，本發(fā)明的多孔脫乙酰殼多糖小珠在其上和其中具有均勻孔，因此它們能夠用作提供三維結(jié)構(gòu)用于幫助細胞發(fā)揮功能的基體。另外，與常規(guī)細胞培養(yǎng)的基體相比，本發(fā)明的多孔脫乙酰殼多糖小珠在細胞附著能力、生物相容性、和生物降解性，以及在細胞生長、血管發(fā)生和營養(yǎng)擴散方面都具有優(yōu)越性。由于具有這些優(yōu)點，本發(fā)明的多孔脫乙酰殼多糖小珠用作培養(yǎng)動物和植物細胞的基體。進而言之，本發(fā)明的多孔脫乙酰殼多糖小珠能夠有效地用于研究代謝組織例如肝臟和胰臟、或者軟骨或骨組織的替代品，以及用于研究生產(chǎn)生物有用材料，包括蛋白質(zhì)、抗生素、抗癌物質(zhì)、多糖、生物活性物質(zhì)、和動物和植物激素。
本發(fā)明已經(jīng)通過結(jié)合附圖
的方式描述，應(yīng)當理解，本發(fā)明使用的術(shù)語是描述的性質(zhì)而不是限制。根據(jù)上面的教導(dǎo)，對本發(fā)明作一些修改和改變是可能的。因此，應(yīng)當理解，在所附權(quán)利要求范圍內(nèi)，本發(fā)明在具體描述之外也可以實施。
權(quán)利要求
1.多孔脫乙酰殼多糖小珠，在其上和其中具有大小范圍為5到200μm的均勻孔。
2.一種用于細胞培養(yǎng)的基體，包括權(quán)利要求1的多孔脫乙酰殼多糖小珠。
3.如權(quán)利要求2所述的基體，其中細胞是選自肝細胞、成纖維細胞、成骨細胞、上皮細胞和包裝細胞的動物細胞，或者選自CEL、UV18和K-1細胞的植物細胞。
4.一種制備多孔脫乙酰殼多糖小珠的方法，包括以下步驟提供一種脫乙酰殼多糖溶解在乙酸水溶液中的脫乙酰殼多糖溶液，一種水溶性脫乙酰殼多糖溶解在去離子水中的脫乙酰殼多糖水溶液，或它們的混合物；將脫乙酰殼多糖溶液、脫乙酰殼多糖水溶液或它們的混合物逐滴加入低溫有機溶劑或液氮中，得到小珠；和冷凍干燥所述脫乙酰殼多糖小珠，其中通過控制溶劑的溫度進行相分離，使脫乙酰殼多糖小珠具有所需的孔徑。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中脫乙酰殼多糖具有平均分子量30,000到100,000，水溶性脫乙酰殼多糖具有平均分子量100,000到400,000。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中乙酸水溶液的濃度為1.0-4.0重量％。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其中脫乙酰殼多糖溶液中脫乙酰殼多糖的濃度為0.5-2.0重量％。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其中脫乙酰殼多糖水溶液中脫乙酰殼多糖的濃度為0.5-1.54重量％。
9.如權(quán)利要求4所述的方法，其中混合物中，脫乙酰殼多糖溶液與脫乙酰殼多糖水溶液的重量比為2∶8到8∶2。
10.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述有機溶劑選自氯代環(huán)己烷、氯代戊烷、正己烷、二氯甲烷、氯仿和乙酸乙酯。
11.如權(quán)利要求4所述的方法，其中有機溶劑維持在-5到-65℃。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中有機溶劑用借助干冰或冷凍儀維持在-5到-65℃的乙醇冷卻。
13.一種用權(quán)利要求1所述的多孔脫乙酰殼多糖小珠培養(yǎng)動物細胞或植物細胞的方法，包括以下步驟冷凍干燥多孔脫乙酰殼多糖小珠；中和多孔脫乙酰殼多糖小珠，去除酸和有機溶劑，然后對小珠消毒；將多孔脫乙酰殼多糖小珠預(yù)培養(yǎng)4-6小時，使細胞附著到多孔脫乙酰殼多糖小珠上；和定期更換附著到脫乙酰殼多糖小珠上的細胞的培養(yǎng)基。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中培養(yǎng)所述細胞，用以替代代謝組織例如肝臟和胰臟、或者軟骨或骨組織，以及生產(chǎn)生物有用材料，包括蛋白質(zhì)、抗生素、抗癌物質(zhì)、多糖、生物活性物質(zhì)、和動物和植物激素。
全文摘要
本發(fā)明涉及大孔脫乙酰殼多糖小珠，它具有大小為5－200μm的孔，這些孔相對較大且均勻分布到小珠表面和核區(qū)，以及所述小珠的制備方法包括下列步驟將脫乙酰殼多糖溶液、脫乙酰殼多糖水溶液或它們的混合物滴加到低溫有機溶劑或液氮中；通過由溫度差異所致的相分離法調(diào)整孔徑大小。本發(fā)明的大孔脫乙酰殼多糖小珠比現(xiàn)有基體使細胞培養(yǎng)更有效，因為由于這些小珠具有較大表面積而使細胞能夠有效地附著其上，由于這些小珠的三維結(jié)構(gòu)，注射到小珠中的細胞和附著于小珠的細胞能夠容易地長期存在，因此它們能夠用于研究生產(chǎn)蛋白質(zhì)、抗生素、抗癌物質(zhì)、多糖、生理活性物質(zhì)、動物激素、或植物激素，以及用于研究代謝器官，軟骨或骨的替代品。
文檔編號C12N5/00GK1411471SQ00817389
公開日2003年4月16日 申請日期2000年11月30日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月21日
發(fā)明者鄭曙榮, 裴恩姬, 權(quán)翊贊, 崔貴元 申請人:韓國科學(xué)技術(shù)研究院