專利名稱：HMG－CoA還原酶抑制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有抑制羥甲基戊二酸單酰CoA(HMG-CoA)還原酶、降低血清膽固醇作用的化合物的制備方法。
而且，上述放線菌和絲狀菌都具有形成孢子的能力。由于孢子比菌體容易飛散得多，而且具有在營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞易于死亡的條件下也能夠生存的能力，所以容易成為培養(yǎng)、精制步驟中的微生物污染源。
本發(fā)明人考慮到如果可以通過(guò)具有氫氧化活性，而且不具有孢子形成能力及不繁殖成菌絲狀的微生物進(jìn)行化合物(V-a)或(V-b)的氫氧化，則可以避免由于孢子飛散引起的制造工藝中的微生物污染和菌絲形成引起培養(yǎng)液不均勻造成的反應(yīng)效率低下等不良情況，有利于工業(yè)生產(chǎn)，并進(jìn)行了悉心的研究，從而完成了本發(fā)明。
也就是說(shuō)，本發(fā)明涉及下述(1)～(9)。
以下，只要沒(méi)有特別說(shuō)明，通式中的R1表示氫原子、取代或未取代的烷基或堿金屬，R2表示取代或未取代的烷基或者取代或未取代的芳基。
(1)化合物(II-a)或化合物(II-b)的制備方法，其特征在于，使用具有由通式(I-a)表示的化合物〔以下稱為化合物(I-a)〕或者通式(I-b)表示的化合物(I-a)的內(nèi)酯體〔以下稱為化合物(I-b)〕生成通式(II-a)表示的化合物〔以下稱為化合物(II-a)〕或者通式(II-b)表示的化合物(II-a)的內(nèi)酯體〔以下稱為化合物(II-b)〕的活性，而且不具有孢子形成能力及不繁殖成菌絲狀的微生物、該微生物的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源，使化合物(I-a)或化合物(I-b)存在于水性介質(zhì)中，在該水性介質(zhì)中生成、蓄積化合物(II-a)或化合物(II-b)，并由該水性介質(zhì)提取化合物(II-a)或化合物(II-b)。
(2)根據(jù)上述(1)的制備方法，其中化合物(I-a)為通式(III-a)表示的化合物〔以下稱為化合物(III-a)〕，化合物(I-b)為通式(III-b)表示的化合物〔以下稱為化合物(III-b)〕，化合物(II-a)為通式(IV-a)表示的化合物〔以下稱為化合物(IV-a)〕，化合物(II-b)為通式(IV-b)表示的化合物〔以下稱為化合物(IV-b)〕。
(3)根據(jù)上述(1)的制備方法，其中化合物(I-a)為通式(V-a)表示的化合物〔以下稱為化合物(V-a)〕，化合物(I-b)為通式(V-b)表示的化合物〔以下稱為化合物(V-b)〕，化合物(II-a)為通式(VI-a)表示的化合物〔以下稱為化合物(VI-a)〕，化合物(II-b)為通式(VI-b)表示的化合物〔以下稱為化合物(VI-b)〕。 (4)根據(jù)上述(1)的制備方法，其中化合物(I-a)為通式(VII-a)表示的化合物〔以下稱為化合物(VII-a)〕，化合物(I-b)為通式(VII-b)表示的化合物〔以下稱為化合物(VII-b)〕，化合物(II-a)為通式(VIII-a)表示的化合物〔以下稱為化合物(VIII-a)〕，化合物(II-b)為通式(VIII-b)表示的化合物〔以下稱為化合物(VIII-b)〕。 (5)根據(jù)上述(1)的制備方法，其中微生物培養(yǎng)物的處理物是從培養(yǎng)菌體、該菌體的干燥物、該菌體的冷凍干燥物、該菌體的表面活性劑處理物、該菌體的酶處理物、該菌體的超聲波處理物、該菌體的機(jī)械粉碎物、該菌體的溶劑處理物等菌體處理物，菌體的蛋白分離物，菌體和菌體處理物的固化物中選擇的處理物。
(6)根據(jù)上述(1)的制備方法，其中微生物是選自分枝桿菌屬(Mycobacterium)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、紅球菌屬(Rhodococcus)、戈登氏菌屬(Gordona)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、微球菌屬(micrococcus)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)的微生物。
(7)根據(jù)上述(1)的制備方法，其中微生物是選自草分枝桿菌(Mycobacterium phlei)、恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)、抗熱分枝桿菌(Mycobacterium thermoresistibile)、新金色分枝桿菌(Mycobacterium neoaurum)、副偶然分枝桿菌(Mycobacterium parafortuitum)、淺黃色分枝桿菌(Mycobacteriumgilvum)、圓紅球菌(Rhodococcus globerulus)、馬紅球菌(Rhodococcus equi)、紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)、紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)、椿象紅球菌(Rhodococcusrhodnii)、赤紅球菌(Rhodococcus ruber)、嗜糞紅球菌(Rhodococcuscoprophilus)、藤黃紅球菌(Rhodococcus fascians)、溝戈登氏菌(Gordona amarae)、暗紅戈登氏菌(Gordona rubropertinctus)、支氣管戈登氏菌(Gordona bronchialis)、痰戈登氏菌(Gordonasputi)、愛(ài)知戈登氏菌(Gordona aichiensis)、土生戈登氏菌(Gordona terrae)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、類真菌棒桿菌(Corynebacterium mycetoides)、變異棒桿菌(Corynebacterium variabilis)、產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)、成晶節(jié)桿菌(Arthrobactercrystallopoietes)、腸腫節(jié)桿菌(Arthrobacter duodecadis)、分枝節(jié)桿菌(Arthrobacter ramosus)、硫磺節(jié)桿菌(Arthrobactersulfureus)、金黃節(jié)桿菌(Arthrobacter aurescens)、檸檬節(jié)桿菌(Arthrobacter citreus)、球形節(jié)桿菌(Arthrobacterglobiformis)、乙酰短桿菌(Brevibacterium acetylicum)、擴(kuò)展短桿菌(Brevibacterium linens)、未定短桿菌(Brevibacteriumincertum)、碘短桿菌(Brevibacterium iodinum)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)、纖維化纖維單胞菌(Cellulomonas cellulans)、強(qiáng)壯纖維單胞菌(Cellulomonas cartae)、少動(dòng)鞘氨醇單胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)、粘連鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas adhaesiva)和土生鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas terrae)的微生物。
(8)根據(jù)上述(1)的制備方法，其中微生物是選自草分枝桿菌(Mycobacterium phlei)JCM5865、恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)JCM5866、抗熱分枝桿菌(Mycobacteriumthermoresistibile)JCM6362、新金色分枝桿菌(Mycobacteriumneoaurum)JCM6365、副偶然分枝桿菌(Mycobacteriumparafortuitum)JCM6367、淺黃色分枝桿菌(Mycobacterium gilvum)JCM6395、圓紅球菌(Rhodococcus globerulus)ATCC25714、馬紅球菌(Rhodococcus equi)ATCC21387、馬紅球菌(Rhodococcus equi)ATCC7005、紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)ATCC4277、紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC2 1430、紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC13808、椿象紅球菌(Rhodococcusrhodnii)ATCC35071、赤紅球菌(Rhodococcus ruber)JCM3205、嗜糞紅球菌(Rhodococcus coprophilus)ATCC29080、藤黃紅球菌(Rhodococcus fascians)ATCC12974、藤黃紅球菌(Rhodococcusfascians)ATCC35014、溝戈登氏菌(Gordona amarae)ATCC27808、暗紅戈登氏菌(Gordona rubropertinctus)IFM-33、暗紅戈登氏菌(Gordona rubropertinctus)ATCC14352、支氣管戈登氏菌(Gordonabronchialis)ATCC25592、痰戈登氏菌(Gordona sputi)ATCC29627、愛(ài)知戈登氏菌(Gordona aichiensis)ATCC33611、土生戈登氏菌(Gordona terrae)ATCC25594、谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032、谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC14020、谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC19240、類真菌棒桿菌(Corynebacteriummycetoides)ATCC21134、變異棒桿菌(Corynebacteriumvariabilis)ATCC15753、產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacteriumammoniagenes)ATCC6872、成晶節(jié)桿菌(Arthrobactercrystallopoietes)ATCC15481、腸腫節(jié)桿菌(Arthrobacterduodecadis)ATCC13347、分枝節(jié)桿菌(Arthrobacter ramosus)ATCC13727、硫磺節(jié)桿菌(Arthrobacter sulfureus)ATCC19098、金黃節(jié)桿菌(Arthrobacter aurescens)ATCC13344、檸檬節(jié)桿菌(Arthrobacter citreus)ATCC11624、球形節(jié)桿菌(Arthrobacterglobiformis)ATCC8010、乙酰短桿菌(Brevibacteriumacetylicum)ATCC953、擴(kuò)展短桿菌(Brevibacterium linens)ATCC19391、擴(kuò)展短桿菌(Brevibacterium linens)ATCC9172、未定短桿菌(Brevibacterium incertum)ATCC8363、碘短桿菌(Brevibacterium iodinum)IF03558、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)ATCC4698、玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)ATCC186、纖維化纖維單胞菌(Cellulomonas cellulans)ATCC15921、強(qiáng)壯纖維單胞菌(Cellulomonas cartae)ATCC21681、少動(dòng)鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas paucimobilis)ATCC29837、粘連鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas adhaesiva)JCM7370和土生鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas terrae)ATCC15098的微生物。
(9)根據(jù)上述(1)的制備方法，其中微生物是戈登氏菌屬(Gordona sp.)ATCC19067。以下詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
本發(fā)明中使用的酶源例如具有由上述化合物(I-a)或上述化合物(I-b)生成上述化合物(II-a)或上述化合物(II-b)的活性，而且不具有孢子形成能力及不繁殖成菌絲狀的微生物、該微生物的培養(yǎng)物、該培養(yǎng)物的處理物。
烷基是直鏈或支鏈狀的碳原子數(shù)為1～10，優(yōu)選1～6的烷基，如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、異己基、庚基、4，4-二甲基戊基、辛基、2，2，4-三甲基戊基、壬基、癸基、它們的各種支鏈異構(gòu)體等。
芳基如苯基、萘基等。
取代烷基中的取代基如相同或不同的1～3個(gè)鹵素、羥基、氨基、烷氧基、芳基等。
取代芳基中的取代基如相同或不同的1～3個(gè)鹵素、羥基、氨基、烷基、烷氧基等。
烷氧基中的烷基部分與上述烷基定義相同。
堿金屬表示鋰、鈉、鉀、銣、銫、鈁各元素。
上述微生物例如選自分枝桿菌屬(Mycobacterium)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、紅球菌屬(Rhodococcus)、戈登氏菌屬(Gordona)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、微球菌屬(Micrococcus)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)的微生物。
具體例如選自草分枝桿菌(Mycobacterium phlei)、恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)、抗熱分枝桿菌(Mycobacteriumthermoresistibile)、新金色分枝桿菌(Mycobacterium neoaurum)、副偶然分枝桿菌(Mycobacterium parafortuitum)、淺黃色分枝桿菌(Mycobacterium gilyum)、圓紅球菌(Rhodococcus globerulus)、馬紅球菌(Rhodococcus equi)、紅串紅球菌(Rhodococcuserythropolis)、紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)、椿象紅球菌(Rhodococcus rhodnii)、赤紅球菌(Rhodococcus ruber)、嗜糞紅球菌(Rhodococcus coprophilus)、藤黃紅球菌(Rhodococcusfascians)、溝戈登氏菌(Gordona amarae)、暗紅戈登氏菌(Gordonarubropertinctus)、支氣管戈登氏菌(Gordona bronchialis)、痰戈登氏菌(Gordona sputi)、愛(ài)知戈登氏菌(Gordonaaichiensis)、土生戈登氏菌(Gordona terrae)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、類真菌棒桿菌(Corynebacteriummycetoides)、變異棒桿菌(Corynebacterium variabilis)、產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)、成晶節(jié)桿菌(Arthrobacter crystallopoietes)、腸腫節(jié)桿菌(Arthrobacterduodecadis)、分枝節(jié)桿菌(Arthrobacter ramosus)、硫磺節(jié)桿菌(Arthrobacter sulfureus)、金黃節(jié)桿菌(Arthrobacteraurescens)、檸檬節(jié)桿菌(Arthrobacter citreus)、球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)、乙酰短桿菌(Brevibacteriumacetylicum)、擴(kuò)展短桿菌(Brevibacterium linens)、未定短桿菌(Brevibacterium incertum)、碘短桿菌(Brevibacteriumiodinum)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)、纖維化纖維單胞菌(Cellulomonascellulans)、強(qiáng)壯纖維單胞菌(Cellulomonas cartae)、少動(dòng)鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas paucimobilis)、粘連鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas adhaesiva)和土生鞘氨醇單胞菌(Sphingomonasterrae)的微生物。
更具體地說(shuō)，例如草分枝桿菌(Mycobacterium phlei)JCM5865、恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)JCM5866、抗熱分枝桿菌(Mycobacterium thermoresistibile)JCM6362、新金色分枝桿菌(Mycobacterium neoaurum)JCM6365、副偶然分枝桿菌(Mycobacterium parafortuitum)JCM6367、淺黃色分枝桿菌(Mycobacterium gilvum)JCM6395、圓紅球菌(Rhodococcusgloberulus)ATCC25714、馬紅球菌(Rhodococcus equi)ATCC21387、馬紅球菌(Rhodococcus equi)ATCC7005、紅串紅球菌(Rhodococcuserythropolis)ATCC4277、紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCC21430、紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)ATCCl3808、椿象紅球菌(Rhodococcus rhodnii)ATCC35071、赤紅球菌(Rhodococcus ruber)JCM3205、嗜糞紅球菌(Rhodococcuscoprophilus)ATCC29080、藤黃紅球菌(Rhodococcus fascians)ATCC12974、藤黃紅球菌(Rhodococcus fascians)ATCC35014、溝戈登氏菌(Gordona amarae)ATCC27808、暗紅戈登氏菌(Gordonarubropertinctus)IFM-33、暗紅戈登氏菌(Gordonarubropertinctus)ATCC14352、支氣管戈登氏菌(Gordonabronchialis)ATCC25592、痰戈登氏菌(Gordona sputi)ATCC29627、愛(ài)知戈登氏菌(Gordona aichiensis)ATCC33611、土生戈登氏菌(Gordona terrae)ATCC25594、戈登氏菌屬ATCC 19067、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC14020、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC19240、類真菌棒桿菌(Corynebacterium mycetoides)ATCC21134、變異棒桿菌(Corynebacterium variabilis)ATCC15753、產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)ATCC6872、成晶節(jié)桿菌(Arthrobacter crystallopoietes)ATCC15481、腸腫節(jié)桿菌(Arthrobacter duodecadis)ATCC13347、分枝節(jié)桿菌(Arthrobacter ramosus)ATCC13727、硫磺節(jié)桿菌(Arthrobactersulfureus)ATCC19098、金黃節(jié)桿菌(Arthrobacter aurescens)ATCC13344、檸檬節(jié)桿菌(Arthrobacter citreus)ATCC11624、球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)ATCC8010、乙酰短桿菌(Brevibacterium acetylicum)ATCC953、擴(kuò)展短桿菌(Brevibacterium linens)ATCC19391、擴(kuò)展短桿菌(Brevibacterium linens)ATCC9172、未定短桿菌(Brevibacteriumincertum)ATCC8363、碘短桿菌(Brevibacterium iodinum)IF03558、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)ATCC4698、玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)ATCC186、纖維化纖維單胞菌(Cellulomonas cellulans)ATCC15921、強(qiáng)壯纖維單胞菌(Cellulomonas cartae)ATCC21681、少動(dòng)鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas paucimobilis)ATCC29837、粘連鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas adhaesiva)JCM7370和土生鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas terrae)ATCC15098和戈登氏菌屬(Gordona sp.)ATCC 19069等。
另外，也可以使用這些微生物的繼代培養(yǎng)體、突變體或誘變體、通過(guò)基因重組技術(shù)制備的重組體等。
用于培養(yǎng)本發(fā)明中所用微生物的培養(yǎng)基如果是含有本發(fā)明的微生物能夠利用的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽類等，并可以有效進(jìn)行本發(fā)明微生物的培養(yǎng)的培養(yǎng)基即可，天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基均可以使用。
作為培養(yǎng)基中的碳源的具體實(shí)例，如葡萄糖、果糖、甘油、麥芽糖、淀粉、蔗糖等碳水化合物，醋酸、枸櫞酸等有機(jī)酸，糖蜜等。
作為氮源的具體實(shí)例，如氨，氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、硝酸銨、磷酸銨等各種無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸的銨鹽，胨、肉汁、玉米漿、酪蛋白水解產(chǎn)物、大豆粉、棉籽粕、魚(yú)粉、各種發(fā)酵菌體及其消化物等。
作為無(wú)機(jī)物的具體實(shí)例，如磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。
另外，根據(jù)需要也可以添加硫胺素、生物素等維生素，谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸，腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤等與核酸有關(guān)的物質(zhì)。
本發(fā)明中所用微生物的培養(yǎng)優(yōu)選在振蕩培養(yǎng)、通氣攪拌培養(yǎng)等有氧條件下進(jìn)行。通氣攪拌培養(yǎng)的情況下，為了防止發(fā)泡，優(yōu)選適量添加消泡劑。培養(yǎng)通常在20～50℃，優(yōu)選25～40℃下進(jìn)行6～120小時(shí)。培養(yǎng)中pH保持在5.0～10.0，優(yōu)選6.0～8.5。pH調(diào)節(jié)使用無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸、堿溶液、尿素、碳酸鈣、氨等進(jìn)行。
作為這樣得到的微生物培養(yǎng)物的處理物，如培養(yǎng)菌體、該菌體的干燥物、該菌體的冷凍干燥物、該菌體的表面活性劑處理物、該菌體的酶處理物、該菌體的超聲波處理物、該菌體的機(jī)械粉碎物、該菌體的溶劑處理物等菌體處理物，菌體的蛋白級(jí)分物，菌體和菌體處理物的固化物等。
由化合物(I-a)或化合物(I-b)轉(zhuǎn)變?yōu)榛衔?II-a)或化合物(II-b)的方法可以采用預(yù)先在培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基中添加化合物(I-a)或化合物(I-b)的方法，也可以采用在培養(yǎng)過(guò)程中添加化合物(I-a)或化合物(I-b)的方法。另外，也可以采用使酶源在水性介質(zhì)中作用于化合物(I-a)或(I-b)的方法。
在培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基中添加化合物(I-a)或化合物(I-b)時(shí)，在培養(yǎng)開(kāi)始或過(guò)程中每1ml培養(yǎng)基添加化合物(I-a)或化合物(I-b)0.1～10mg，優(yōu)選0.2～1mg。添加化合物(I-a)或化合物(I-b)時(shí)，也可以將化合物(I-a)或化合物(I-b)溶解于甲醇、乙醇等溶劑中再添加。
采用使酶源在水性介質(zhì)中作用于化合物(I-a)或化合物(I-b)的方法時(shí)，使用的酶的量根據(jù)該酶源的比活性等有所不同。例如使用微生物的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源時(shí)，每1mg化合物(I-a)或化合物(I-b)添加酶源5～1000mg，優(yōu)選10～400mg。反應(yīng)優(yōu)選在水性介質(zhì)中20～50℃下進(jìn)行，特別優(yōu)選在25～40℃下進(jìn)行。反應(yīng)時(shí)間根據(jù)使用的酶源的量和比活性等有所不同，通常為0.5～150小時(shí)，優(yōu)選1～72小時(shí)。
水性介質(zhì)例如水、磷酸緩沖液、HEPES(N-二羥乙基哌嗪-N-乙磺酸)緩沖液、Tris〔三(羥甲基)氨基甲烷〕鹽酸緩沖液等緩沖液。只要不阻礙反應(yīng)，也可以在該緩沖液中添加有機(jī)溶劑。有機(jī)溶劑例如丙酮、乙酸乙酯、二甲基亞砜、二甲苯、甲醇、乙醇、丁醇等。有機(jī)溶劑和水性介質(zhì)的混合液優(yōu)選在使用化合物(I-b)時(shí)使用。
采用上述制備方法可以由化合物(I-a)得到化合物(II-a)或化合物(II-a)和化合物(II-b)的混合物。
同樣，可以由化合物(I-b)得到化合物(II-b)或化合物(II-a)和化合物(II-b)的混合物。
而且，也可以由化合物(I-a)和化合物(I-b)的混合物得到化合物(II-a)和化合物(II-b)的混合物。
化合物(I-b)和化合物(II-b)可以按照下述舉例說(shuō)明的內(nèi)酯的開(kāi)環(huán)方法分別容易地轉(zhuǎn)變成化合物(I-a)和化合物(II-a)。另外，化合物(I-a)和化合物(II-a)可以按照下述舉例說(shuō)明的內(nèi)酯的生成方法分別容易地轉(zhuǎn)變成化合物(I-b)或化合物(II-b)。
內(nèi)酯的開(kāi)環(huán)方法例如將化合物(I-b)或化合物(II-b)溶解于水性介質(zhì)中，添加酸或堿的方法。水性介質(zhì)例如水、磷酸緩沖液、Tris緩沖液等含有不阻礙反應(yīng)的鹽類的水溶液。該水溶液中也可以含有不阻礙反應(yīng)的濃度的甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑。酸例如醋酸、鹽酸、硫酸等酸，堿例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨等。
內(nèi)酯的生成方法例如將化合物(I-a)或化合物(II-a)溶解于非水系的溶劑中，添加酸或堿催化劑的方法。作為非水系的溶劑，只要是實(shí)質(zhì)上不含水的有機(jī)溶劑，并且可以溶解化合物(I-a)或化合物(II-a)，任何一種溶劑均可使用。
非水系的溶劑例如二氯甲烷、乙酸乙酯等。作為催化劑，只要可以催化內(nèi)酯化反應(yīng)，并且不對(duì)基質(zhì)和反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)生內(nèi)酯化以外的作用，可以使用任何一種物質(zhì)。該催化劑例如三氟醋酸或?qū)妆交撬岬取７磻?yīng)溫度沒(méi)有特別的限定，優(yōu)選0～100℃，特別優(yōu)選20～80℃。
從反應(yīng)結(jié)束后的上述溶液中收集化合物(II-a)或化合物(II-b)可以采用通常有機(jī)合成化學(xué)中采用的方法，例如用有機(jī)溶劑萃取、結(jié)晶、薄層色譜法、高效液相色譜法等進(jìn)行。
本發(fā)明得到的化合物(II-a)或化合物(II-b)的確認(rèn)或定量方法只要是可以確認(rèn)或定量化合物(II-a)和/或化合物(II-b)的方法，可以采用任何一種方法。例如，可以采用13C-NMR光譜、1H-NMR光譜、質(zhì)譜、高效液相色譜法(HPLC)等方法進(jìn)行。
本發(fā)明中，有時(shí)化合物(I-a)、化合物(I-b)、化合物(II-a)和化合物(II-b)中可以存在光學(xué)異構(gòu)體等立體異構(gòu)體，本發(fā)明包括連同這些立體異構(gòu)體在內(nèi)的所有可能的異構(gòu)體及其混合物。
化合物(I-a)優(yōu)選化合物(III-a)，更優(yōu)選化合物(V-a)，特別優(yōu)選化合物(VII-a)。
化合物(I-b)優(yōu)選化合物(III-b)，更優(yōu)選化合物(V-b)，特別優(yōu)選化合物(VII-b)。
化合物(II-a)優(yōu)選化合物(IV-a)，更優(yōu)選化合物(VI-a)，特別優(yōu)選化合物(VIII-a)。
化合物(II-b)優(yōu)選化合物(IV-b)，更優(yōu)選化合物(VI-b)，特別優(yōu)選化合物(VIII-b)。
以下給出本發(fā)明的實(shí)施例，但是本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的限定。發(fā)明的最佳實(shí)施方式實(shí)施例1將化合物(VII-b)(Sigma公司生產(chǎn))100mg溶解于9.5ml的甲醇中后，加入1mol/l氫氧化鈉0.5ml，室溫下振蕩1小時(shí)。將得到的反應(yīng)液干燥固化后，加入去離子水5ml溶解，用1mol/l鹽酸約0.1ml將pH調(diào)節(jié)至約6.5～7.5，再加入去離子水4.9ml，得到最終濃度為10mg/ml的化合物(VII-a)〔通式(VII-a)中R1為鈉的化合物〕10ml。
將表1和表2所示的各種微生物分別涂覆在瓊脂培養(yǎng)基上〔胨(極東制藥工業(yè)生產(chǎn))1％、肉汁(極東制藥工業(yè)生產(chǎn))0.7％、NaCl 0.3％、酵母浸出物(日本制藥社生產(chǎn))0.2％、Bacto瓊脂(Difuco公司生產(chǎn))2％，用1mol/l氫氧化鈉調(diào)節(jié)為pH7.2〕，在表1和表2所示的各溫度下培養(yǎng)3天。將瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株各一鉑環(huán)分別接種在含有3mlLB培養(yǎng)基〔Bacto胰胨(Difuco公司生產(chǎn))1％、Bacto酵母浸出物束(Difuco公司生產(chǎn))0.5％，用1mol/l氫氧化鈉調(diào)節(jié)為pH7.2〕的試管中，在表1和表2所示的各溫度下振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。將培養(yǎng)后的培養(yǎng)液0.25ml接種到含有5ml TB培養(yǎng)基〔Bacto胰胨(Difuco公司生產(chǎn))1.4％、Bacto酵母浸出物束(Difuco公司生產(chǎn))2.4％、KH2PO40.231％、K2HPO41.251％，用1mol/l氫氧化鈉調(diào)節(jié)為pH7.4〕的試管中，在表1和表2所示的各溫度下振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。24小時(shí)后，將上述得到的化合物(VII-a)分別添加到試管中使終濃度達(dá)到0.4mg/ml，再在表1和表2所示的各溫度下振蕩48小時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。
反應(yīng)結(jié)束后，用醋酸將反應(yīng)液調(diào)節(jié)為pH3.5。向該反應(yīng)液0.5ml中加入乙酸乙酯1ml，振蕩1小時(shí)。振蕩后，以3000rpm的速度離心分離5分鐘，將反應(yīng)液分為2層，回收上清的乙酸乙酯層，在離心蒸發(fā)器中除去溶劑后，將殘?jiān)芙庠诩状?.5ml中。使用該甲醇溶液的一部分進(jìn)行HPLC分析〔柱Inertsil ODS-2(5μm，4×250mm，凝膠科學(xué)公司生產(chǎn))；柱溫度60℃；流動(dòng)相乙腈∶水∶磷酸＝55∶45∶0.05；流速0.9ml/分；檢測(cè)波長(zhǎng)237nm〕，對(duì)化合物(VIII-a)〔通式(VIII-a)中R1為鈉的化合物〕進(jìn)行檢測(cè)、定量。結(jié)果如表1和表2所示。
表1

表2

實(shí)施例2將淺黃色分枝桿菌(Mycobacterium gilvum)JCM6395株涂覆在與實(shí)施例1同樣的瓊脂培養(yǎng)基上，37℃下培養(yǎng)3天，將瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株接種在含有LB培養(yǎng)基3ml的4只試管中，37℃下振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。分別將該培養(yǎng)液1.25ml接種在8個(gè)含有25ml TB培養(yǎng)基的300ml錐形瓶中，37℃下振蕩培養(yǎng)。24小時(shí)后添加與實(shí)施例1同樣制備的化合物(VII-a)〔通式(VII-a)中R1為鈉的化合物〕使終濃度達(dá)到0.4mg/l，在37℃下振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，在4℃下，以3000rpm的速度離心分離10分鐘，分離得到上清液。用醋酸將上清液的pH調(diào)節(jié)為3.5，加入400ml的乙酸乙酯，在30℃下振蕩1小時(shí)后靜置，收回上清液。對(duì)于下層的水層也進(jìn)行同樣的操作，將得到的乙酸乙酯層與前面的上清液混合。在該乙酸乙酯層中添加飽和食鹽水100ml振蕩后，回收上清液。
其次，在該上清液中添加5g無(wú)水Na2SO4，在室溫下放置15分鐘后，減壓蒸發(fā)乙酸乙酯，干燥固化。將得到的殘?jiān)芙庥谌ルx子水5ml中，用氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)為9.0，在50ml的HP-20柱上進(jìn)行過(guò)柱。(25×100mm，三菱化學(xué)公司生產(chǎn))。用150ml去離子水洗滌柱子后，用丙酮含量為20％、30％、40％的丙酮水溶液100ml分級(jí)洗脫。對(duì)分離得到的部分進(jìn)行與實(shí)施例1同樣的HPLC分析，回收含有化合物(VIII-a)的組分。減壓條件下從該組分中除去乙腈，用lmol/l鹽酸將溶液的pH調(diào)節(jié)為3.0。在該溶液中加入360ml的乙酸乙酯振蕩，靜置后回收上清液。在該上清液中添加飽和食鹽水90ml，振蕩，靜置后回收上清液。
其次，向該上清液中添加4.5g無(wú)水Na2SO4，室溫下放置15分鐘后，減壓干燥固化。將得到的干燥固化物溶解在二氯甲烷中，加入1％三氟乙酸，使之內(nèi)酯化。使用分離用TLC〔硅膠板No.1.05744(200×200mm，0.5mm厚)MERCK公司制；展開(kāi)溶劑乙酸乙酯；顯色劑12.5％磷鉬酸·1％鈰/10％硫酸溶液〕分離該反應(yīng)物，得到0.8mg化合物(VIII-b)。得到的化合物(VIII-b)的質(zhì)譜和1H-NMR光譜的分析結(jié)果如下所示。
質(zhì)譜使用日本電子生產(chǎn)的JMS-HX/HX110A質(zhì)譜儀，使用間硝基苯甲醇作為基質(zhì)采用正向模式進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果在m/z 407處出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子峰(〔M+H〕+)，與根據(jù)化合物(VII-b)的結(jié)構(gòu)和分子量(406)期待的數(shù)值一致。
1H-NMR光譜使用日本電子制的JNM-α400型光譜儀，在重氯仿中，使用TMS作為內(nèi)標(biāo)，在400MHz下測(cè)定。其結(jié)果如下所示。該光譜數(shù)據(jù)與化合物(VIII-b)的已知數(shù)據(jù)〔三共研究所年報(bào)，37，147(1985)〕一致。
δppm(CDCl3)6.01(1H，d，J＝9.5Hz)，5.89(1H，dd，J＝9.5，5.9Hz)，5.58(1H，m)，5.41(1H，m)，4.60(1H，ddd，J＝10.6，7.3，5.4，2.8Hz)，4.40(1H，m)，4.38(1H，m)，2.74(1H，dd，J＝13.1，6.0，4.8，1.5Hz)，2.40(1H，m)，2.36(1H，m)，2.34(1H，m)，1.95(1H，dddd，J＝14.4，3.7，2.9，1.7Hz)，1.86(1H，dddd，J＝12.5，12.3，7.3，4.3Hz)，1.69(1H，m)，1.68(1H，m)，1.64(1H，m)，1.57(1H，m)，1.5～1.4(2H，m)，1.43(1h，m)，1.30(1H，m)，1.12(3H，d，J＝6.8Hz)，0.91(3H，d，J＝7.1Hz)，0.89(3H，t，J＝7.4Hz)工業(yè)實(shí)用性按照本發(fā)明能夠高效率地制備具有抑制HMG-CoA還原酶、降低血清膽固醇等作用的化合物。
權(quán)利要求
1.化合物(II-a)或化合物(II-b)的制備方法，其特征在于，使用具有由通式(I-a)表示的化合物〔以下稱為化合物(I-a)〕或者通式(I-b)表示的化合物(I-a)的內(nèi)酯體〔以下稱為化合物(I-b)〕生成通式(II-a)表示的化合物〔以下稱為化合物(II-a)〕或者通式(II-b)表示的化合物(II-a)的內(nèi)酯體〔以下稱為化合物(V-b)〕的活性，而且不具有孢子形成能力及不繁殖成菌絲狀的微生物、該微生物的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源，使化合物(I-a)或化合物(I-b)存在于水性介質(zhì)中，在該水性介質(zhì)中生成、蓄積化合物(II-a)或化合物(II-b)，并由該水性介質(zhì)收集化合物(II-a)或化合物(II-b)， 式中，R1表示氫原子、取代或未取代的烷基或堿金屬，R2表示取代或未取代的烷基或者取代或未取代的芳基， 式中，R2與上述定義相同， 式中，R1和R2與上述定義相同， 式中，R2與上述定義相同。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法，其中化合物(I-a)為通式(III-a)表示的化合物〔以下稱為化合物(III-a)〕，化合物(I-b)為通式(III-b)表示的化合物〔以下稱為化合物(III-b)〕，化合物(II-a)為通式(IV-a)表示的化合物〔以下稱為化合物(IV-a)〕，化合物(II-b)為通式(IV-b)表示的化合物〔以下稱為化合物(IV-b)〕， 式中，R1表示氫原子，取代或非取代的烷基或堿金屬，R2表示取代或未取代的烷基或取代或未取代的芳基， 式中，R2與上述定義相同， 式中，R1和R2與上述定義相同， 式中，R2與上述定義相同。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法，其中化合物(I-a)為通式(V-a)表示的化合物〔以下稱為化合物(V-a)〕，化合物(I-b)為通式(V-b)表示的化合物〔以下稱為化合物(V-b)〕，化合物(II-a)為通式(VI-a)表示的化合物〔以下稱為化合物(VI-a)〕，化合物(II-b)為通式(VI-b)表示的化合物〔以下稱為化合物(VI-b)〕， 式中，R1表示氫原子，取代或未取代的烷基或堿金屬， 式中，R1與上述定義相同，
4.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法，其中化合物(I-a)為通式(VII-a)表示的化合物〔以下稱為化合物(VII-a)〕，化合物(I-b)為通式(VII-b)表示的化合物〔以下稱為化合物(VII-b)〕，化合物(II-a)為通式(VIII-a)表示的化合物〔以下稱為化合物(VIII-a)〕，化合物(II-b)為通式(VIII-b)表示的化合物〔以下稱為化合物(VIII-b)〕， 式中，R1表示氫原子，取代或未取代的烷基或堿金屬， 式中，R1與上述定義相同，
5.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法，其中微生物培養(yǎng)物的處理物是從培養(yǎng)菌體、該菌體的干燥物、該菌體的冷凍干燥物、該菌體的表面活性劑處理物、該菌體的酶處理物、該菌體的超聲波處理物、該菌體的機(jī)械粉碎物、該菌體的溶劑處理物等菌體處理物，菌體的蛋白級(jí)分物，菌體和菌體處理物的固化物中選擇的處理物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法，其中微生物是選自分枝桿菌屬、棒桿菌屬、短桿菌屬、紅球菌屬、戈登氏菌屬、節(jié)桿菌屬、微球菌屬、纖維單胞菌屬和鞘氨醇單胞菌屬的微生物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法，其中微生物是選自草分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、抗熱分枝桿菌、新金色分枝桿菌、副偶然分枝桿菌、淺黃色分枝桿菌、圓紅球菌、馬紅球菌、紅串紅球菌、紫紅紅球菌、椿象紅球菌、赤紅球菌、嗜糞紅球菌、藤黃紅球菌、溝戈登氏菌、暗紅戈登氏菌、支氣管戈登氏菌、痰戈登氏菌、愛(ài)知戈登氏菌、土生戈登氏菌、谷氨酸棒桿菌、類真菌棒桿菌、變異棒桿菌、產(chǎn)氨棒桿菌、成晶節(jié)桿菌、腸腫節(jié)桿菌、分枝節(jié)桿菌、硫磺節(jié)桿菌、金黃節(jié)桿菌、檸檬節(jié)桿菌、球形節(jié)桿菌、乙酰短桿菌、擴(kuò)展短桿菌、未定短桿菌、碘短桿菌、藤黃微球菌、玫瑰色微球菌、纖維化纖維單胞菌、強(qiáng)壯纖維單胞菌、少動(dòng)鞘氨醇單胞菌、粘連鞘氨醇單胞菌和土生鞘氨醇單胞菌的微生物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法，其中微生物是選自草分枝桿菌JCM5865、恥垢分枝桿菌JCM5866、抗熱分枝桿菌JCM6362、新金色分枝桿菌JCM6365、副偶然分枝桿菌JCM6367、淺黃色分枝桿菌JCM6395、圓紅球菌ATCC25714、馬紅球菌ATCC21387、馬紅球菌ATCC7005、紅串紅球菌ATCC4277、紫紅紅球菌ATCC21430、紫紅紅球菌ATCC13808、椿象紅球菌ATCC35071、赤紅球菌JCM3205、嗜糞紅球菌ATCC29080、藤黃紅球菌ATCC12974、藤黃紅球菌ATCC35014、溝戈登氏菌ATCC27808、暗紅戈登氏菌IFM-33、暗紅戈登氏菌ATCC14352、支氣管戈登氏菌ATCC25592、痰戈登氏菌ATCC29627、愛(ài)知戈登氏菌ATCC33611、土生戈登氏菌ATCC25594、谷氨酸棒桿菌ATCC13032、谷氨酸棒桿菌ATCC14020、谷氨酸棒桿菌ATCC19240、類真菌棒桿菌ATCC21134、變異棒桿菌ATCC15753、產(chǎn)氨棒桿菌ATCC6872、成晶節(jié)桿菌ATCC15481、腸腫節(jié)桿菌ATCC13347、分枝節(jié)桿菌ATCC13727、硫磺節(jié)桿菌ATCC19098、金黃節(jié)桿菌ATCC13344、檸檬節(jié)桿菌ATCC11624、球形節(jié)桿菌ATCC8010、乙酰短桿菌ATCC953、擴(kuò)展短桿菌ATCC19391、擴(kuò)展短桿菌ATCC9172、未定短桿菌ATCC8363、碘短桿菌IF03558、藤黃微球菌ATCC4698、玫瑰色微球菌ATCC186、纖維化纖維單胞菌ATCC15921、強(qiáng)壯纖維單胞菌ATCC21681、少動(dòng)鞘氨醇單胞菌ATCC29837、粘連鞘氨醇單胞菌JCM7370和土生鞘氨醇單胞菌ATCC15098的微生物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法，其中微生物是戈登氏菌屬ATCC19067。
全文摘要
本發(fā)明涉及化合物(II－a)或化合物(II－b)的制備方法,其特征在于,使用具有將通式(I－a)表示的化合物[以下稱為化合物(I－a)]或者其封閉內(nèi)酯體[以下稱為化合物(I－b)]氫氧化的活性,而且不具有孢子形成能力及不繁殖成菌絲狀的微生物、該微生物的培養(yǎng)物或該培養(yǎng)物的處理物作為酶源,使之在水性介質(zhì)中對(duì)化合物(I－a)或化合物(I－b)作用,并由該水性介質(zhì)收集化合物(I－a)或化合物(I－b)的氫氧化物[以上稱為化合物(II－a)或化合物(II－b)]。(式中,R
文檔編號(hào)C12P17/06GK1344328SQ00805212
公開(kāi)日2002年4月10日 申請(qǐng)日期2000年1月20日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月20日
發(fā)明者橋本信一, 米谷良之, 尾崎明夫 申請(qǐng)人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社