專利名稱：原位生物芯片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于化學與生物分析儀器技術(shù)領(lǐng)域。
目前已有報道的生物芯片主要是采用原位合成法、化學噴射法或接觸式點涂法制備的、把寡核苷酸作為探針的基因芯片。如《生物工程進展》1999，Vol.19(No.4)33-37、和45-51發(fā)表的“生物芯片研究進展”和“基因芯片技術(shù)及應(yīng)用研究進展”兩篇文章，綜述了國內(nèi)外對生物芯片技術(shù)在加工制備、功能和應(yīng)用方面的主要研究成果。基因芯片目前主要用于高通量基因表達平行分析、大規(guī)模基因發(fā)現(xiàn)及序列分析、基因多態(tài)性分析和基因組研究等。另外，《Analytical Biochemistry》1994，Vol.270103-111發(fā)表的“用于基因表達和抗體篩選的蛋白質(zhì)微陣列”一文，首次把蛋白質(zhì)作為探針高密度地固定在聚雙氟乙烯膜上，對cDNA(反錄脫氧核糖核酸)克隆片段表達的產(chǎn)物進行檢測。另一方面，目前基因芯片檢測主要是利用熒光素等標記目的基因，即所謂熒光標記法。用計算機控制的高分辨熒光掃描儀獲得結(jié)合于芯片上目的基因的熒光信號進行分析測試。熒光掃描儀主要有靈敏度和分辨率較高、但掃描時間長的激光共聚焦顯微鏡，和掃描時間短、但靈敏度和分辨率較低的電荷藕合器件(CCD)攝像機兩大類。在基因芯片的雜交檢測中，為比較不同來源樣品的基因表達差異，或者為了提高基因芯片檢測的準確性和測量范圍，通常需要使用多色熒光技術(shù)，如《Nature Genetics》1999，21(Supplement)42-47發(fā)表的“采用寡核苷酸微陣列測序和突變分析”文章，把不同來源的靶基因用不同激發(fā)波長的熒光探針來修飾，并同時使它們與基因芯片雜交，通過比較芯片上不同波長的分布圖，獲得不同樣品中基因表達的差異。但熒光標記法也存在一些嚴重的不足，如檢測需在雜交反應(yīng)完成并洗脫未結(jié)合標記物后進行，不能對芯片上的反應(yīng)進行動態(tài)監(jiān)測，因而也不能獲取有關(guān)反應(yīng)動力學的信息，同時檢測設(shè)備復(fù)雜且成本高，對檢測條件有極其嚴格的要求，操作冗繁，難以實現(xiàn)自動化、小型化等等。目前還未可進行原位檢測的生物芯片技術(shù)的報導(dǎo)。
鑒于此，本發(fā)明的目的是針對已有生物芯片技術(shù)存在的上述問題，提供一種無須標記、能進行原位檢測實時獲取微陳列各探針的反應(yīng)信息，并具有自動、高速、高效，使用簡便，相關(guān)設(shè)備易于微型化、成本低廉的原位生物芯片及其制備方法。
本發(fā)明采用在半導(dǎo)體基片上制作結(jié)構(gòu)相同的微型傳感器陣列，在每一個傳感器上固化一種探針形成在傳感器陣列上有有機化合物、生物分子、細胞、微生物中的至少一種探針，形成檢測位點陣列，構(gòu)成在使用時能通過檢測預(yù)定的檢測位點對外加電信號的響應(yīng)，原位獲取該檢測位點探針與靶物質(zhì)的反應(yīng)信息的原位生物芯片來實現(xiàn)其目的；本發(fā)明采用大規(guī)模集成電路技術(shù)在基片上制作微型傳感器陣列、并在微型傳感器陣列上固化探針制成由檢測位點陣列構(gòu)成的本原位生物芯片來實現(xiàn)其目的。
本發(fā)明的原位生物芯片(參見附圖)，包含有SiO2膜層(5)的基片(1)，在SiO2膜層上有沿X坐標軸的M條X地址線和沿Y坐標軸的N條Y地址線相交錯，有在X地址線和Y地址線的交錯部的MN個能盛裝樣品溶液(6)的檢測池(12)，M、N為正整數(shù)，X地址線和Y地址線的一端分別與各檢測池的兩個電極(9、10)相連，另一端分別與X尋址邏輯電路(13)和Y尋址邏輯電路(14)相連，X尋址邏輯電路和Y尋址邏輯電路與檢測電路(15)相連，構(gòu)成MN個傳感器，組成傳感器陣列，在一個傳感器上固化一種探針(16)形成至少一種探針的探針陣列，構(gòu)成MN個檢測位點(7)，組成檢測位點陣列。
在上述SiO2膜層(5)下的基片(1)上，有分別與沿X坐標軸的M條RX地址線和沿Y坐標軸的N條RY地址線相連的X電阻和Y電阻(2)構(gòu)成的與傳感器陣列相對應(yīng)的電阻陣列，M、N為正整數(shù)，RX地址線和RY地址線的另一端分別與X電阻邏輯電路(3)和Y電阻邏輯電路(4)相連。上述RX地址線、RY地址線、X電阻、Y電阻2構(gòu)成的電阻陣列，連接X電阻邏輯電路3和Y電阻邏輯電路4，通過外加電壓于X、Y電阻交錯部分使其發(fā)熱，用于傳感器陣列上探針的定位合成。
上述的檢測位點(7)有至少一個圓孔形的檢測池(12)，檢測池的孔壁上有金屬化層(20)，上述的兩個電極(9、10)分別在孔壁的金屬化層上，檢測池的底面(18)和/或電極的表面呈波紋狀。
上述的檢測位點(7)有至少一個相互平行的槽形的檢測池(12)，上述的電極呈指狀，有至少一根位于檢測池上層的電極(8)和至少一根位于檢測池下層的電極(9)，在上層的電極與SiO2膜層(5)之間依次有粘接層(10)和Si3O4掩膜層(11)，在下層的電極與SiO2膜層之間有粘接層(10)，檢測池的底面(18)和/或電極的表面呈波紋狀。
上述的探針(16)是有機化合物探針、或生物分子探針、或細胞探針、或微生物探針，探針固化在檢測池(13)內(nèi)的電極(9、10)表面上、或固化在檢測池內(nèi)的固體支撐物上。
上述的X電阻邏輯電路(3)、Y電阻邏輯電路(4)、X尋址邏輯電路(13)、Y尋址邏輯電路(14)、檢測電路(15)集成在基片(1)上。
本發(fā)明的探針與靶物質(zhì)的反應(yīng)可通過在加入靶樣品溶液后給檢測池內(nèi)電極施加電壓來吸引樣品溶液中的靶物質(zhì)以加快反應(yīng)速度。沒有外加電壓時，樣品溶液中靶分子只有通過擴散到達探針，這種自由擴散過程效率極低；外加一電壓可將帶電靶分子直接吸引到聯(lián)結(jié)在電極上的探針，從而加快探針一靶的反應(yīng)速度。相反，外加一反向電壓，則有助于洗脫未反應(yīng)和錯配的靶分子，該技術(shù)適用于所有檢測位點內(nèi)置有電極的芯片。另外，可用外加電壓產(chǎn)生一沖擊電流，用于電極表面的清洗或鈍化。
適用于本發(fā)明的生物芯片的檢測對象即靶物質(zhì)，可以是無機或有機化合物、生物分子如DNA(脫氧核糖核酸)、RNA(核糖核酸)，抗體或抗-抗體，細胞或微生物。對于不同的靶物質(zhì)，需選用相對應(yīng)的探針進行檢測，對RNA或DNA靶物質(zhì)，探針可以是合成的寡核苷酸。由于一個檢測位點上對應(yīng)有一種探針，而由多個檢測位點構(gòu)成的陣列芯片上對應(yīng)有由多種探針構(gòu)成的探針組，因此可對包括相應(yīng)多種靶物質(zhì)的靶物質(zhì)組同時進行檢測。當將含有靶物質(zhì)的樣品溶液與本原位生物芯片接觸時，被置于在檢測位點上構(gòu)制出的檢測池中，靶物質(zhì)被相應(yīng)的探針捕獲。通過X尋址邏輯電路和Y尋址邏輯電路對每一檢測位點進行自動尋址，并通過經(jīng)X地址線、Y地址線與檢測位點相連的檢測電路測量該檢測位點的電參數(shù)，探針一靶的相互作用將導(dǎo)致檢測位點電參數(shù)的變化，由此，通過電尋址和電參數(shù)測量可對原位生物芯片內(nèi)每一檢測位點上特定的靶物質(zhì)-探針結(jié)合進行動態(tài)實時監(jiān)測，從而實現(xiàn)對靶物質(zhì)組成的測定。
本發(fā)明的原位生物芯片的制備方法如下1)制作基片(1)，2)在基片上用大規(guī)模集成電路技術(shù)制作微型傳感器陣列，(1)在基片(1)上制出沿X坐標軸的M條RX地址線和沿Y坐標的N條RY地址線，及分別與RX地址線和RY地址線相連的X電阻和Y電阻(2)構(gòu)成的電阻陣列，RX地址線和RY地址線的另一端分別與X電阻邏輯電路(3)、和Y電阻邏輯電路(4)相連，(2)采用化學汽相淀積法，在電阻陣列上制出SiO2膜層(5)，在SiO2膜層上，制出沿X坐標軸的M條X地址線和沿Y坐標軸的N條Y地址線，然后在SiO2膜層上制出Si3O4掩膜層(11)，(3)采用光刻法制出電極圖形，再采用反應(yīng)離子腐蝕法，按電極圖形腐蝕去除Si3O4掩膜層(11)制出位于X地址線和Y地址線交錯部的由各相互平行的槽形的穴孔(17)組成的穴孔組，(4)采用酸性緩沖液濕法腐蝕SiO2膜層(5)，將各穴孔(17)制出凹入的底面(18)，(5)采用電子束蒸發(fā)法，分別在各底面(18)的SiO2膜層(5)表面、和各余留Si3O4掩膜層(11)的表面，制出通常材料的粘接層(10)，然后在粘接層上制出金屬化層，從而分別制得由金屬化層形成的呈指狀的位于Si3O4掩膜層上的上層的電極(9)、和位于底面上的下層的電極(10)，制成各檢測池(12)；將各上層的電極和下層的電極分別與X地址線和Y地址線相連，X地址線和Y地址線的另一端分別與X尋址邏輯電路(13)和Y尋址邏輯電路(14)相連，再將X尋址邏輯電路和Y尋址邏輯電路與檢測電路(15)相連，構(gòu)成各傳感器，組成傳感器陣列，3)在各傳感器的電極(9、10)上固化探針(16)，構(gòu)成各檢測位點(7)，組成檢測位點陣列，制成本原位生物芯片。
本發(fā)明的原位生物芯片的制備也可以是如下的方法1)制作基片(1)，2)在基片上用大規(guī)模集成電路技術(shù)制作微型傳感器陣列，(1)在基片(1)上制出SiO2膜層(5)，(2)在SiO2膜層(5)上，制成沿X坐標軸的M條X地址線和沿Y坐標軸的N條Y地址線，再采用光刻法制出穴孔圖形，采用反應(yīng)離子腐蝕法腐蝕SiO2膜層，在各X地址線和Y地址線的交錯部制出圓孔的的穴孔(17)組成的穴孔組，(3)采用化學汽相淀積法在SiO2膜層(5)上制出多晶硅膜(19)，(4)采用反應(yīng)離子腐蝕法，將各穴孔(17)的底面和上表面的多晶硅膜(19)部分腐蝕去除，保留兩側(cè)壁面上的多晶硅膜，
(5)采用硅化反應(yīng)將各穴孔(17)的多晶硅膜制成金屬化層(20)，(6)采用化學鍍方法，在各穴孔(17)的金屬化層(20)上，形成在穴孔兩側(cè)壁上的Ni或Au材料的兩個電極(9、10)，將各穴孔的底面(18)和電極表面，制成波紋狀，構(gòu)成各檢測池(12)，(7)將各檢測池內(nèi)的兩個電極(9、10)分別與X地址線和Y地址線的一端相連，并將X地址線和Y地址線的另一端分別與X尋址邏輯電路(13)和Y尋址邏輯電路(14)相連，再將X尋址邏輯電路和Y尋址邏輯電路與檢測電路(15)相連，構(gòu)成各傳感器，組成傳感器陣列，3)在各傳感器的電極(9、10)上固定探針(16)，構(gòu)成各檢測位點(7)，組成檢測位點陣列，制成本原位生物芯片。
本發(fā)明的生物芯片，通過采用微電子、微機械、化學處理、生物操縱等制備工藝和過程，得到多個作為探針的有機分子、或生物分子、或細胞、或微生物的微陣列，能使成千上萬個與生命成藥物相關(guān)的信息集成在一塊厘米見方的芯片上。
本發(fā)明的與已有生物芯片及其制備方法相比較，具有如下的明顯優(yōu)點和顯著效果。
一、本發(fā)明采用微型傳感器，可以通過測量探針-靶結(jié)合所致的一種電信號或頻率變化(頻移)，原位、實時直接檢測探針-靶的相互作用，并可揭示相互作用的動態(tài)機制。探針或靶無須偶聯(lián)熒光素等標記物，只有當結(jié)合反應(yīng)的電信號或頻移極小或不存在時，可用帶電分子標記靶。
二、本發(fā)明采用的現(xiàn)有微電子技術(shù)可在1cm2芯片上作出上百萬個密度均勻、性能統(tǒng)一的微型化檢測位點陣列，其成本廉價，可與標準電子器件相當，而且這種微型傳感器陣列具有比其它方法更高的靈敏度和準確性。
三、本發(fā)明的原位生物芯片，可以采用電子檢測方法，由于是測量電信號隨頻率的變化，不存在傳感器陣列幅值特性受靶樣品溶液腐蝕的影響，因此本發(fā)明芯片可重復(fù)使用多次而不影響精度而且芯片還可涂敷獲得更長的使用壽命。
四、本發(fā)明將執(zhí)行檢測位點定位和檢測的電路集成在芯片上的結(jié)構(gòu)，使開關(guān)、信號處理和電源也都可以集成在同一芯片上，實現(xiàn)檢測系統(tǒng)的集成化、微型化、自動化，而且使用簡便。同時，可大批量生產(chǎn)，大大降低成本。
五、本發(fā)明的微型檢測位點陣列結(jié)構(gòu)，使用時由于一是不存在對未結(jié)合標記物的清洗，二是無須標記而減少了樣本制備時間，三是只要有足夠的結(jié)合量使電信號或頻移有明顯變化而無須等待反應(yīng)完成，四是采用微處理器控制本芯片可提供超高速陣列定位測量，因此可大大縮短檢測時間。
六、本發(fā)明采用有機化合物、生物分子、細胞、微生物中的至少一種作為探針組成探針陣列，能同時捕捉、檢測與多種探針相互作用的靶物質(zhì)，不限于現(xiàn)有生物芯片采用寡核苷酸探針僅應(yīng)用于DNA序列測定，還可應(yīng)用于同時鑒測多種特定有機化合物或生物分子或識別它們的混合物，尋找篩選具有生物作用的有機化合物或生物分子或細胞或微生物或它們的混合物，尋找發(fā)現(xiàn)有機化合物或生物分子或細跑或微生物或這些物質(zhì)混合物的生物功能。
本發(fā)明的生物芯片配用于化學與生物分析儀器，并借助已有的檢測技術(shù)，應(yīng)用于鑒測有機化合物或生物分子或它們的混合物，研究發(fā)現(xiàn)有機化合物或生物分子或細胞或微生物的生物功能，尋找、篩選、分離、鑒定具有生物功能的有機化合物或生物分子或細胞或微生物或這些物質(zhì)的混合物?？梢赃M行生命科學、醫(yī)學和藥學中所涉及的各種生物化學反應(yīng)及其檢測，從而獲取有關(guān)目標(靶)組分的成分、結(jié)構(gòu)、性狀、功能的一維或多維信息。以生物芯片為核心構(gòu)建的生物化學和藥物分析儀具有以下一些主要優(yōu)點，分析全過程自動化、生產(chǎn)成本低、芯片可一次性使用避免污染、分析速度可獲得成千上萬倍的提高、所需樣品量可獲得成百上千倍的減少、極高的多樣品處理能力、儀器體積小、重量輕、便于攜帶等。生物芯片技術(shù)可廣泛應(yīng)用于疾病診斷和治療、藥物篩選、農(nóng)作物的優(yōu)育優(yōu)選、司法鑒定、食品衛(wèi)生監(jiān)督、環(huán)境檢測、國防、航天等許多領(lǐng)域，它將為人類認識生命的起源、遺傳、發(fā)育與進化、為人類疾病的診斷、治療和防治開辟全新的途徑，為生物大分子的全新設(shè)計和藥物開發(fā)中先導(dǎo)化合物的快速篩選和藥物基因組學研究提供技術(shù)支撐平臺。
下面，再用實施例及其附圖對本發(fā)明作進一步地說明。
附圖的簡要說明。


圖1是本發(fā)明的一種原位生物芯片的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2是
圖1中一個檢測位點部的放大圖。
圖3是圖2中電極部分的放大圖。
圖4是圖3A-A局部的剖視圖。圖中30為電場。
圖5A-5D是一種檢測位點的主要制作步驟的示意圖。
圖6A-6H是另一種檢測位點的主要制作步驟的示意圖。
圖7是結(jié)合檢測位點(曲線A)和未結(jié)合檢測位點(曲線B)的損耗因子(D)與頻率對數(shù)(logf)的關(guān)系圖。
團8是一種采用波地址線的檢測位點平面示意圖。
圖9是一種采用輸入-頻率范圍為f1-f2的交流電壓Vi的檢測位點及其檢測系統(tǒng)示意圖。
圖10是圖9所示檢測位點測試系統(tǒng)導(dǎo)納(GAC)與輸?shù)娜腚妷篤i頻率(f)的關(guān)系圖。
圖11是幅值不變、頻率從低(f1)到高(f2)的輸入電壓(Vi)-時間(time)圖。
圖12是檢測位點對
圖11所示輸入電壓(頻率由低頻f1到高頻f2)響應(yīng)的輸出電壓(Vo)-時間(time)圖。
圖13是檢測位點對
圖11所示輸入電壓(頻率由高頻f2到低頻f1)響應(yīng)的輸出電壓(Vo)-時間(time)圖。
圖14是一種微機械諧振器式的檢測位點示意圖。
圖15是一種聲表面波檢測系統(tǒng)的示意圖。
實施例1本發(fā)明的一種原位生物芯片，如
圖1-5所示。由基片及其上的檢測位點陣列構(gòu)成。
上述的基片1，呈平片形。
在基片1上，如
圖1所示，有與沿X坐標軸的M條RX地址線即RX1、1X2、RX3…RXM地址線，和沿Y坐標軸的N條RY地址線即RY1、RY2、RY3…RYN地址線相連的X電阻和Y電阻2構(gòu)成的電阻陣列，上述M、N為正整數(shù)，各RX地址線和各RY地址線的一端分別與X電阻和Y電阻2相連，另一端分別與通常的X電阻邏輯電路3和Y電阻邏輯電路4相連，用于探針的定位合成。在電阻陣列上覆有一層SiO2膜層5。SiO2膜層上有與電阻陣列相對應(yīng)的由沿X坐標軸的M條X地址線即X1、X2、X3…XM地址線，和沿Y坐標軸的N條Y地址線即Y1、Y2、Y3…YN地址線相交錯，上述M、N為正整數(shù)。在X地址線和Y地址線的MN交錯部是MN個能盛裝樣品溶液6的檢測位點7。檢測位點中的電極，如圖3、4所示，有至少一根呈指狀條形的位于上層的電極8、和至少一根呈指狀條形的位于下層的電極9。在電極8與Si02+膜5之間依次有粘接層10和Si3O4掩膜層11，在電極9與SiO2膜5之間有粘接層10。多根電極8和多根電極9平行相間構(gòu)成叉指狀的電極組。在檢測位點中的相鄰的兩根上層的電極8與其間的下層的電極9之間構(gòu)成檢測池12，從而在檢測位點中形成多個檢測池。上述X地址線和Y地址線的一端分別與電極8和電極9相連、另一端分別與通常的X尋址邏輯電路13和Y尋址邏輯電路14相連。X尋址邏輯電路和Y尋址邏輯電路與通常的檢測電路15相連構(gòu)成多個傳感器，組成與上述電阻陣列相對應(yīng)的傳感器陣列。在一個傳感器中的檢測池內(nèi)的電極上固化一種探針16，傳感器陣列中各傳感器中的探針構(gòu)成探列陣列，在探針陣列中可以有有機化合物探針、生物分子探針、細胞探針、微生物探針中的至少一種。從而組成檢測位點陣列。上述X電阻邏輯電路3、Y電阻邏輯電路4、X尋址邏輯電路13、Y尋址邏輯電路14、檢測電路15均集成在基片1上。
本發(fā)明的上述原位生物芯片的制備方法如下。
1)上述的基片1，采用絕緣或半導(dǎo)體材料和通常的方法制成平片形，使用的材料可以是單晶硅、玻璃、石英、剛玉片等。
2)在基片上用大規(guī)模集成電路技術(shù)制作微型傳感器陣列。
(1)在基片1上蒸鍍或濺射電阻材料如鎳鉻合金、鎢或鉑金屬制出沿X坐標軸的M條RX地址線即RX1、RX2、RX2…RXM地址線，和沿Y坐標的N條RY地址線即RY1、RY2、RY3…RYN地址線，及分別與RX地址線和RY地址線相連的X電阻和Y電阻2構(gòu)成的電阻陣列，如
圖1所示。電阻2還可通過一些成熟技術(shù)如化學汽相淀積(CVD)，分子束外延(MBE)，金屬有機CVD(MOCVD)或其它半導(dǎo)體工藝，用摻雜多晶硅、鎢或鉭或鉑的硅化物或氮化物或氮氧化物制成。RX地址線和RY地址線的另一端分別與集成在基片上的通常的X電阻邏輯電路3、和Y電阻邏輯電路4相連。
(2)采用化學汽相淀積法，在電阻陣列上制出厚度約5000(埃)的SiO2膜層5，繼而在SiO2膜層上，制出沿X坐標軸的M條X地址線即X1、X2、X3…XM地址線，和沿Y坐標軸的N條Y地址線即Y1、Y2、Y3…YN地址線，然后在SiO2膜層上采用掩膜材料Si3O4制出厚度約500的Si3O4掩膜層11。
(3)采用光刻法制出電極圖形，再采用反應(yīng)離子腐蝕法，按電極圖形腐蝕去除Si3O4掩膜層11制出位于X地址線和Y地址線MN個交錯部的由多個相互平行的槽形的寬約2μm長條形的穴孔17組成的穴孔組，如圖5B所示。
(4)采用酸性緩沖液如HF緩沖液濕法腐蝕深度約4000SiO2膜層5，將各穴孔17制出凹入的底面18，如圖5C所示。
(5)采用電子束蒸發(fā)法，分別在各穴孔的底面18的SiO2膜層5表面、和各余留Si3O4掩膜層11的表面，制出厚度約300的粘接層10，然后在粘接層上制出金材料的厚度約2000的金屬化層，分別制得位于Si3O4掩膜層12上的由金屬化層形成的電極8、和位于底面18上的電極9，構(gòu)成由多個指狀條形的電極8和電極9相間構(gòu)成的叉指狀的電極組。各穴孔的底面和/或各電極表面，可以制成波紋狀表面，這種紋理構(gòu)形使檢測位點的表面積增大，從而可固定更多的探針以獲得更高的靈敏度。如圖3所示的一組叉指狀電極長約100μm、寬約100μm，各電極為寬約2μm的長條形，各電極間距約2μm。這種叉指設(shè)計可使其在基片上極小的區(qū)城內(nèi)有較大的與樣品接觸的電極表面積，從而具有較高的“樣品”電容與檢測位點電極引線所致寄生電容的比值。將各電極8和電極9分別與各X地址線和Y地址線相連，X地址線和Y地址線的另一端分別與集成在基片1上的X尋址邏輯電路13和Y尋址邏輯電路14相連，再將X尋址邏輯電路和Y尋址邏輯電路與集成在基片1上的檢測電路15相連，構(gòu)成MN個傳感器，組成傳感器陣列，圖5A-5D給出的只是基片1的一部分上的一個檢測位點7。采用現(xiàn)代半導(dǎo)體技術(shù)，可在一直徑3英寸的基片上加工出700萬個以上這樣的檢測位點。
3)在檢測位點上固定探針在檢測位點上的探針是根據(jù)欲測的靶物質(zhì)確定，可采用不同的探針，包括寡核苷酸、單或雙鏈DNA或RNA抗體或抗原—抗體復(fù)合物、腫瘤細胞以及其它任何可與靶物質(zhì)互相結(jié)合的物質(zhì)。如對RNA或DNA靶物質(zhì)，探針可以是合成的寡核苷酸。在一個檢測位點上對應(yīng)有一種探針，由多個檢測位點構(gòu)成的陣列芯片上對應(yīng)有由多種探針構(gòu)成的探針組。本發(fā)明采用有機化合物、生物分子、細胞、微生物中的至少一種作為探針組合成微陳列，同時捕捉、檢測與多種探針相互作用的靶物質(zhì)。即可對包括相應(yīng)的多種靶物質(zhì)的靶物質(zhì)組同時進行檢測。
如圖4所示，本發(fā)明的探針16直接固定在檢測位點7中的檢測池12內(nèi)的電極8和電極9上。探針也可固定在固體支撐物(圖中未顯示)上，在使用時將固體支撐物連同探針放入檢測池12內(nèi)。固體支撐物，可以是有機成無機物基體，如玻璃、聚苯乙烯、聚亞酰胺、二氧化硅以及氮化硅。固定探針的固體支撐物或電極需預(yù)先功能化以產(chǎn)生有利于與所選探針共價連接的表面化學。例如，當選用玻璃作固定支撐物時，可通過與環(huán)氧硅烷反應(yīng)使其環(huán)氧基功能化，在玻璃上的環(huán)氧基與5′-氨基-衍生寡核苷酸探針反應(yīng)，形成一仲胺共價聯(lián)接，而將探針聯(lián)接到玻璃的表面。如5′醛或羧酸、氨基和磷酸的衍生物可分別與酰肼、重氮化活化以及氮基修飾的聚苯乙烯結(jié)合。在固定探針的電極的表面也需預(yù)處理覆層上能與探針直接結(jié)合的材料，這些材料包括金、氧化鈮、氧化銥、鉑、鈦、鉭、鎢及其它金屬，這些金屬表面能通過與探針上的有機疏基連接形成穩(wěn)定的偶合物。如一5′或3′端標記上巰基的合成DNA探針可與金等金屬形成穩(wěn)定的偶合物。
探針的固定可在合成各種探針后，采用微量移液管或微噴頭或針頭將各種探針逐點分布在基片表面各相應(yīng)的檢測位點上。固定探針的方法有如下幾種。
(1)點樣固定探針法探針通過前述表面化學固定于由金或SiO2或其它材料構(gòu)成的檢測位點上。這種點樣法適合于制備低密度(每厘米約100個以下探針)的探針陣列。
(2)原位合成探針法直接在相應(yīng)檢測位點上合成固定各探針。探針的原位合成法是基于組合化學的合成原理。它通過一組定位模板來決定基片表面上不同化學單體的偶聯(lián)位點和次序，如由四組16塊模板定位合成得到256個不同的四核苷酸探針陣列。第一組中四個模板的陰影部分分別對應(yīng)于基片上四個不同位置，通過不同的模板把腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸嘧啶(A、C、G、T)四種不同堿基的核苷酸化學偶聯(lián)在相應(yīng)的陰影區(qū)內(nèi)。第二組摸板相對于第一組旋轉(zhuǎn)90，同樣的方法在上一層堿基上分別偶聯(lián)上四種堿基。在第二組合成結(jié)束時，在基片上共制備得16種不同的二核苷酸。第三、四組模板把上面的模板圖形進行細分，重復(fù)第一、二組的合成方法，可以產(chǎn)生256個不同的四核苷酸探針陣列。隨著模板圖形細分次數(shù)n的增加，芯片上可產(chǎn)生42n種2n個堿基的寡核苷酸探針。目前，已有多種模板技術(shù)用于DNA探針的原位合成，如光去保護并行合成法、光刻膠保護合成法、微流體模板固相合成撥術(shù)、分子印章多次壓印合成法等。原位合成法也可用于固相基片上鈦或其它大分子探針的合成，可以發(fā)揮微細加工技術(shù)的優(yōu)勢，很適合制作大規(guī)模探針陣列芯片，實現(xiàn)高密度芯片的標準化和規(guī)模化生產(chǎn)。
(3)探針定位合成法本發(fā)明是通過
圖1-4中電阻2，在不影響相鄰檢測位點的情況下加熱芯片的設(shè)定檢測位點，進行探針的定位合成。通過對所選電阻施加電壓，該檢測位點將原位熱活化探針如寡核苷酸鏈的合成。并且，可對除與合成反應(yīng)檢測池相鄰以外的所有電阻加一大電流，以使非合成檢測池的溫度保持在合成所需溫度以上，避免該檢測池內(nèi)發(fā)生合成反應(yīng)。同樣，本發(fā)明自動定位傳感器陣列可通過對其中設(shè)定檢測位點的電極施加電壓，在該檢測池內(nèi)進行定位電致或電催化合成反應(yīng)。
而且，對其中設(shè)定檢測位點的電極施加電壓還可用于吸引檢測池內(nèi)樣品溶液中的反應(yīng)物以加快反應(yīng)速度。如探針與靶分子的雜交反應(yīng)可通過在加入靶樣品溶液后給電極施加電壓來加快反應(yīng)，沒有外加電壓時，樣品溶液中靶分子只有通過擴散到達探針，由于這種擴散過程效率極低，通常需要1.5到2小時才有明顯的反應(yīng)，而且還有大部分沒有反應(yīng)的探針。外加一電壓可將帶電靶分子直接吸引到聯(lián)結(jié)在電極上的探針，從而加快反應(yīng)速度，并提高靶/探針反應(yīng)的數(shù)量。相反，外加一反向電壓，則有助于洗脫未反應(yīng)和錯配的靶分子，該技術(shù)適用于所有檢測位點內(nèi)置有電極的芯片。另外，可用外加電壓產(chǎn)生一沖擊電流，用以電極表面的清洗或鈍化。
實施例2本發(fā)明的一種原位生物芯片，如圖6A-6H所示，由基片及其上的檢測位點陣列構(gòu)成。參見
圖1，本實施例可保留或去除
圖1中的RX1、RX2、RX3…RXM地址線、RY1、RY2、RY3…RYN地址線、X電阻邏輯電路3、Y電阻邏輯電路4。
上述的基片1，與實施例1相同。在基片上覆有一層SiO2膜層5。在SiO2膜層上有由沿X坐標軸的M條X地址線即X1、X2、X3…XM地址線和沿Y坐標軸的N條Y地址線即Y1、Y2、Y3…YN相交錯。在X地址線和Y地址線的MN交錯部有與X地址線和Y地址線相連的檢測位點，上述M、N為正整數(shù)。各檢測位點有多個能盛裝樣品溶液6的凹入呈圓孔形的檢測池12。在各檢測池12的孔壁上覆有多晶硅膜19，在多晶硅膜上覆有金屬化層20，金屬化層上有電極8和電極9，檢測池12的底面18和/或電極呈波紋形表面。本實施例的傳感器、探針等的結(jié)構(gòu)與實施例1相同。
本發(fā)明的上述原位生物芯片的制備方法如下。
1)制作基片。采用的材料和方法與實施例1相同。
2)在基片上用大規(guī)模集成電路技術(shù)制作微型傳感器陣列。
(1)在基片1上制出厚度約5000的SiO2膜層5。
(2)在SiO2膜層5上，制成沿X坐標軸的M條X地址線和沿Y坐標軸的N條Y地址線，再采用光刻法制出穴孔圖形，采用反應(yīng)離子腐蝕法腐蝕SiO2膜層，在各X地址線和Y地址線的MN個交錯部制出凹入的圓孔形的穴孔17，組成穴孔陣列。各穴孔的孔深約0.5μm、孔徑約2μm、孔間距2μm。
(3)采用化學汽相淀積法在SiO2膜層5上制出厚度約2000的多晶硅膜19。
(4)采用反應(yīng)離子腐蝕法，將各穴孔17的底面和上表面的多晶硅膜19部分腐蝕去除，保留孔壁上的多晶硅膜。
(5)用W或Ti或Pt材料，采用硅化反應(yīng)將各穴孔17的孔壁的多晶硅膜金屬化，制成金屬化層20，(6)采用化學鍍方法，在各孔壁的金屬化層20上，形成Ni或Au材料的電極8和電極9，構(gòu)成各檢測池12，組成檢測池陣列。也可以將各穴孔的底面和/或各電極表面，制成波紋狀表面。
(7)將各檢測池的電極8和電極9分別與各X地址線和Y地址線的一端相連，并將X地址線和Y地址線的另一端分別與用通常方法集成在基片1上的通常的X尋址邏輯電路13和Y尋址邏輯電路14相連，再將X尋址邏輯電路和Y尋址邏輯電路與通常的檢測電路15相連，構(gòu)成各傳感器，組成傳感器陣列。
(8)在各傳感器的電極上，固定探針16。組成檢測位點陣列。
3)在檢測位點上固定探針的方法與實施例1相同。
使用本發(fā)明的原位生物芯片，如實施例1和實施例2的原位生物芯片對靶物質(zhì)進行檢測的傳感檢測有兩大類型一類是基于檢測位點兩電極間的介質(zhì)損耗、或是交流導(dǎo)納(阻抗)或是傳輸線射頻損耗的變化；另一類是基于用作檢測位點的微諧振器的諧振頻率或品質(zhì)因子(Q)的變化。在檢測過程中本發(fā)明的原位生物芯片有機化合物探針、生物分子探針、細胞探針、微生物探針中的至少一種組合成探針微陳列，可同時捕捉、檢測與多種探針相互作用的靶物質(zhì)。
使用本發(fā)明的原位生物芯片的電學雜交檢測方法本發(fā)明的原位生物芯片可作為基因傳感器陣列用于檢測各檢測位點7是否存在靶基因。在DNA解碼檢測應(yīng)用中，在每一檢測位點上固定大量的較短寡核苷酸鏈的探針16，探針鏈的一端與檢測位點表面相連。對一傳感器陣列，各檢測位點連有不同編碼序列的探針鏈，而每一檢測位點上所有探針鏈的編碼序列則是相同并且已知的。當在本發(fā)明的芯片的檢測位點的檢測池中注入含有未知(靶)DNA長鏈的樣品溶液6時，在理想情況下，靶DNA將只在含與其密碼序列部分互補序列的檢測位點上與寡核苷酸鏈的探針緊密結(jié)合，而不與其它任何檢測位點結(jié)合；實際上。往往會存在某些較弱的DNA錯配，但這些錯配可通過在適當?shù)碾x子濃度和溫度下采用適當?shù)臉悠啡芤呵逑礄z測池予以消除。因此，清洗后芯片上許多檢測池將含有結(jié)合成雜交的DNA，另外余下的檢測池則仍只含有原寡核苷酸鏈探針。通過每個檢測位點的電極8和9依序電訊問各檢測池，可找到并記錄下含有雜交DNA的檢測位點。當檢測位點上有無雜交DNA時，其電性質(zhì)將有明顯不同。如在DNA分子的諧振頻率下。前者樣品溶液介電常數(shù)約是后者的10-100倍。下述檢測方法(2)-(5)即是基于檢測各檢測位點變化而設(shè)計的。由此數(shù)據(jù)庫，通過“迭代”或“神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)”算法重構(gòu)出靶DNA的完整編碼序列。
(1)損耗因子法圖7是結(jié)合DNA(曲線B)與未結(jié)合DNA(曲線A)的損耗因子-頻率對數(shù)圖，該圖表明兩者損耗因子(D)隨頻率(f)的變化明顯不同，由此，可用于確定檢測位點上是否存在雜交DNA。損耗因子的檢測可采用十分成熟的儀器方法如阻抗儀，測量儀表通過X尋址邏輯電路13和Y尋址邏輯電路14依序與各檢測位點7接通。
(2)交流電導(dǎo)法各檢測位點上是否存在雜交DNA也可通過測量交流電導(dǎo)進行檢測，交流電導(dǎo)GAC＝εA/d，式中ε電極間介質(zhì)的介電常數(shù)、A為電極的有效面積、d為電極間的有效距離。對一DNA分子樣品溶液，在其弛豫頻率下，其交流電導(dǎo)是無DNA液的100倍以上。圖9是該方法的原理示意圖，在各檢測位點7的電極8和9間施加一脈沖或頻率掃描波，在每一電極上有探針16，在檢測位點的撿測池12中加有靶分子樣品溶液。如
圖10所示，檢測到在某一頻率(DNA諧振頻率)下GAC出現(xiàn)極大，表明存在雜交DNA?？捎米杩箖x在某一頻率下測量電導(dǎo)GL或電阻RL(RL＝1/GL)，也可如前對圖9、10的說明，在一定的頻率范圍測量電導(dǎo)與頻率的關(guān)系。
(3)傳輸-損耗檢測法在一傳軸線上信號損耗也對電極間介質(zhì)的介電常數(shù)ε的變化敏感。如圖8的一種采用波地址線的檢測位點平面示意圖所示，在各檢測位點X地址線和Y地址線間引入一傳輸線21，在每一檢測位點7，可通過分級測量一通過傳輸線的電磁波的射頻損耗，來完成DNA等雜交分子的電檢測。傳軸線可由一微型的條形線、微帶、波導(dǎo)管、共面波導(dǎo)管、縫隙線或共軸線構(gòu)成。為使該法有較高的靈敏度，檢測池12要比圖4中的檢測池寬或長，而且檢測池內(nèi)的傳輸線采取曲折的形式使其具有最大的長度。
(4)線性調(diào)頻脈沖檢測法如
圖11所示，在每一檢測位點的兩電極間施加一頻率掃描或電壓調(diào)制波形Vi，所得響應(yīng)波形V0示于
圖12或
圖13，圖中在某頻率(雜交DNA頻率)下，輸出電壓V0達到極大，表明有雜交DNA的存在。采用頻率掃描波形測量雜交DNA的弛豫頻率可得到有關(guān)雜交DNA性質(zhì)的共某些信息，如交聯(lián)與非交聯(lián)。
(5)微機械諧振器檢測法本法中，如
圖14所示，在基片1中制成一組由諧振器構(gòu)成的檢測位點。該諧振器由電極膜結(jié)構(gòu)的置于上層的電極8和置于下層的電極9及其中間的諧振腔(介質(zhì)一般為空氣)22構(gòu)成，電極9的材料為金屬，在基片1平面上沿X方向延伸，電極8的材料為氮化硅或金屬鉭，沿Y方向延伸，電極的尺寸一般為直徑或?qū)?長100μm。在電極8上構(gòu)制有一檢測池12，在池內(nèi)的電極8的表面固定探針16，靶DNA的樣品溶液6置于檢測池內(nèi)。電極8可采用CVD技術(shù)沉積一氮化硅薄膜，并可通過控制硅氮比和蒸發(fā)溫度調(diào)節(jié)室溫下膜的張力，可先在基片1上沉積氮化硅薄膜后，在基片無膜的一測23腐蝕出一窗口形成檢測池12。該諧振器的諧振頻率在數(shù)千赫茲到數(shù)兆赫茲間，有極狹小的諧振線寬。當一射頻倍號施加到諧振器時。將產(chǎn)生一高品質(zhì)因子Q值、窄線寬的響應(yīng)。在諧振器的電極8表面上的雜交分子將使其Q值或諧振頻率發(fā)生變化。
(6)聲波或電磁波檢測法也可采用表面波如表面聲波(SAW)或表面電磁波器件構(gòu)制成類似的諧振陣列檢測器。如
圖15所示，SAW檢測器的諧振結(jié)構(gòu)24由一聲學換能器25和一SAW反射器26構(gòu)成，換能器可采用在鈮酸鋰晶體或石英晶體基體27上蒸鍍叉指結(jié)構(gòu)的鋁簿膜，反射器可采用一鋁薄膜光柵，這些圖形結(jié)構(gòu)可采用標準的光刻和蒸鍍技術(shù)加工制作。由源28發(fā)射的一頻率掃描波W通過聲介質(zhì)的基體，反射器反回的反射波W′通過檢測池12，采用儀表29測量換能器的能量損耗。從而檢測由反射器感應(yīng)的離散腔諧振。在介質(zhì)上構(gòu)制檢測位點7，每一檢測位點可有一對應(yīng)的換能器和反射器，或用在此基體上構(gòu)制的一個多位開關(guān)將所有檢測位點與一個換能器相連。檢測位點上形成靶/探針對將改變其諧振頻率，由此可檢測出有結(jié)合探針的檢測位點。另外，經(jīng)過檢測位點后的SAW波相位可用傳輸線與基體中的參比傳輸線相比，由此測量表面結(jié)合反應(yīng)引起的相位變化，也可用來測定有結(jié)合分子的檢測位點。
權(quán)利要求
1.原位生物芯片，包含有SiO2膜層(5)的基片(1)，其特征在于在SiO2膜層上有沿X坐標軸的M條X地址線和沿Y坐標軸的N條Y地址線相交錯，有在X地址線和Y地址線的交錯部的MN個能盛裝樣品溶液(6)的檢測池(12)，M、N為正整數(shù)，X地址線和Y地址線的一端分別與各檢測池的兩個電極(9、10)相連，另一端分別與X尋址邏輯電路(13)和Y尋址邏輯電路(14)相連，X尋址邏輯電路和Y尋址邏輯電路與檢測電路(15)相連，構(gòu)成MN個傳感器，組成傳感器陣列，在一個傳感器上固化一種探針(16)形成有至少一種探針的探針陣列，構(gòu)成MN個檢測位點(7)，組成檢測位點陣列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原位生物芯片，其特征在于在SiO2膜層(5)下的基片(1)上，有分別與沿X坐標軸的M條RX地址線和沿Y坐標軸的N條RY地址線相連的X電阻和Y電阻(2)構(gòu)成的與傳感器陣列相對應(yīng)的電阻陣列，M、N為正整數(shù)，RX地址線和RY地址線的另一端分別與X電阻邏輯電路(3)和Y電阻邏輯電路(4)相連。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的原位生物芯片，其特征在于所說的檢測位點(7)有至少一個圓孔形的檢測池(12)，檢測池的孔壁上有金屬化層(20)，所說的兩個電極(9、10)分別在孔壁的金屬化層上，檢測池的底面(18)和/或電極的表面呈波紋狀。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的原位生物芯片，其特征在于所說的檢測位點(7)有至少一個相互平行的槽形的檢測池(12)，所說的電極呈指狀，有至少一根位于檢測池上層的電極(8)和至少一根位于檢測池下層的電極(9)，在上層的電極與SiO2膜層(5)之間依次有粘接層(10)和Si3O4掩膜層(11)，在下層的電極與SiO2膜層之間有粘接層(10)，檢測池的底面(18)和/或電極的表面呈波紋狀。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的原位生物芯片，其特征在于所說的探針(16)是有機化合物探針、或生物分子探針、或細胞探針、或微生物探針，探針固化在檢測池(13)內(nèi)的電極(9、10)表面上、或固化在檢測池內(nèi)的固體支撐物上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的原位生物芯片，其特征在于所說的X尋址邏輯電路(13)、Y尋址邏輯電路(14)、檢測電路(15)集成在基片(1)上。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的原位生物芯片，其特征在于所說的X電阻邏輯電路(3)、Y電阻邏輯電路(4)、X尋址邏輯電路(13)、Y尋址邏輯電路(14)、檢測電路(15)集成在基片(1)上。
8.原位生物芯片的制備方法，其特征在于1)制作基片(1)，2)在基片上用大規(guī)模集成電路技術(shù)制作微型傳感器陣列，(1)在基片(1)上制出沿X坐標軸的M條RX地址線和沿Y坐標的N條RY地址線，及分別與RX地址線和RY地址線相連的X電阻和Y電阻(2)構(gòu)成的電阻陣列，RX地址線和RY地址線的另一端分別與X電阻邏輯電路(3)、和Y電阻邏輯電路(4)相連，(2)采用化學汽相淀積法，在電阻陣列上制出SiO2膜層(5)，在SiO2膜層上，制出沿X坐標軸的M條X地址線和沿Y坐標軸的N條Y地址線，然后在SiO2膜層上制出Si3O4掩膜層(11)，(3)采用光刻法制出電極圖形，再采用反應(yīng)離子腐蝕法，按電極圖形腐蝕去除Si3O4掩膜層(11)制出位于X地址線和Y地址線交錯部的由各相互平行的槽形的穴孔(17)組成的穴孔組，(4)采用酸性緩沖液濕法腐蝕SiO2膜層(5)，將各穴孔(17)制出凹入的底面(18)，(5)采用電子束蒸發(fā)法，分別在各底面(18)的SiO2膜層(5)表面、和各余留Si3O4掩膜層(11)的表面，制出通常材料的粘接層(10)，然后在粘接層上制出金屬化層，從而分別制得由金屬化層形成的呈指狀的位于Si3O4掩膜層上的上層的電極(9)、和位于底面上的下層的電極(10)，制成各檢測池(12)；將各上層的電極和下層的電極分別與X地址線和Y地址線相連，X地址線和Y地址線的另一端分別與X尋址邏輯電路(13)和Y尋址邏輯電路(14)相連，再將X尋址邏輯電路和Y尋址邏輯電路與檢測電路(15)相連，構(gòu)成各傳感器，組成傳感器陣列，3)在各傳感器的電極(9、10)上固化探針(16)，構(gòu)成各檢測位點(7)，組成檢測位點陣列，制成本原位生物芯片。
9.原位生物芯片的制備方法，其特征在于1)制作基片(1)，2)在基片上用大規(guī)模集成電路技術(shù)制作微型傳感器陣列，(1)在基片(1)上制出SiO2膜層(5)，(2)在SiO2膜層(5)上，制成沿X坐標軸的M條X地址線和沿Y坐標軸的N條Y地址線，再采用光刻法制出穴孔圖形，采用反應(yīng)離子腐蝕法腐蝕SiO2膜層，在各X地址線和Y地址線的交錯部制出圓孔的的穴孔(17)組成的穴孔組，(3)采用化學汽相淀積法在SiO2膜層(5)上制出多晶硅膜(19)，(4)采用反應(yīng)離子腐蝕法，將各穴孔(17)的底面和上表面的多晶硅膜(19)部分腐蝕去除，保留兩側(cè)壁面上的多晶硅膜，(5)采用硅化反應(yīng)將各穴孔(17)的多晶硅膜制成金屬化層(20)，(6)采用化學鍍方法，在各穴孔(17)的金屬化層(20)上，形成在穴孔兩側(cè)壁上的Ni或Au材料的兩個電極(9、10)，將各穴孔的底面(18)和電極表面，制成波紋狀，構(gòu)成各檢測池(12)，(7)將各檢測池內(nèi)的兩個電極(9、10)分別與X地址線和Y地址線的一端相連，并將X地址線和Y地址線的另一端分別與X尋址邏輯電路(13)和Y尋址邏輯電路(14)相連，再將X尋址邏輯電路和Y尋址邏輯電路與檢測電路(15)相連，構(gòu)成各傳感器，組成傳感器陣列，3)在各傳感器的電極(9、10)上固定探針(16)，構(gòu)成各檢測位點(7)，組成檢測位點陣列，制成本原位生物芯片。
全文摘要
本發(fā)明涉及化學與生物分析儀器。旨在解決已有芯片不能進行原位和實時檢測的問題。本芯片包含基片及其上由相同微型傳感器構(gòu)成的傳感器陣列,采用在一個傳感器上固定一種探針,而有有機化合物、生物分子、細胞、微生物中的至少兩種探針構(gòu)成的檢測位點陣列。用于生命科學、醫(yī)藥學、環(huán)境科學、生物技術(shù)等領(lǐng)域,鑒測有機化合物或生物分子或細胞或微生物或這些物質(zhì)的混合物,研究發(fā)現(xiàn)其生物功能,尋找篩選具有生物功能的物質(zhì)。
文檔編號C12Q1/00GK1338519SQ00113110
公開日2002年3月6日 申請日期2000年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月18日
發(fā)明者莫志宏, 薜永新, 靳萍 申請人:莫志宏, 薜永新, 靳萍