一種在體外研究昆蟲共生菌經卵垂直傳播的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及昆蟲生理生化研究的技術領域，尤其涉及昆蟲與其共生菌互作的研究領域。
【背景技術】
[0002]昆蟲是自然界種類最多的動物，與人類的生產活動和身體健康密切相關。研究昆蟲的生理生化特征是利用或控制昆蟲的基礎。在一些昆蟲中，特別是以刺吸式口器吸食植物汁液的半翅目昆蟲中，存在一些與其生存與發(fā)育密切相關的共生菌，這些共生菌存在于昆蟲的脂肪體中，為宿主提供水稻汁液中所稀缺的一些必需氨基酸等營養(yǎng)物質，失去這些共生菌，昆蟲將不能存活。如在褐飛虱中，就存在大量的類酵母共生菌為褐飛虱提供組氨酸、精氨酸等必需氨基酸。而稻飛虱、蚜蟲、葉蟬等半翅目昆蟲，多是農林重要害蟲。因此，研究半翅目昆蟲與其共生菌的關系有著非常重要的意義。上述這類共生菌在半翅目昆蟲中通過宿主的卵巢-卵母細胞這種經卵垂直傳播方式從母代傳到子代，但是目前由于缺乏合適的研究模式，半翅目昆蟲共生菌的經卵垂直傳播機制一直不太明確。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種在體外研究昆蟲共生菌經卵垂直傳播的方法。
[0004]本發(fā)明目的是通過以下技術方案得以實現(xiàn)的。
[0005]—種在體外研究昆蟲共生菌經卵垂直傳播的方法，按以下操作步驟進行:
(1)昆蟲準備:用75%酒精對性成熟的雌成蟲表面消毒5分鐘后，再用無菌IXPBS(磷酸鹽緩沖液，PH = 6.4)清洗3遍，備用；
(2)獲取共生菌:將上述雌成蟲置于無菌的IXPBS中，用消毒過的顯微解剖鑷小心剖開蟲體腹部，在盡量不破壞蟲體腸道的情況下，收集游離的共生菌；
(3)共生菌的純化:將步驟(2)得到的共生菌液與Percoll分離液混勻得到含有70%Percol I的混合液，之后進行密度梯度離心純化，最終獲得共生菌懸液，并用血球計數(shù)板進行計數(shù)，計算共生菌懸液中共生菌的濃度；
(4)離體卵巢的獲得:取步驟(I)的成蟲，置于無菌的IX PBS中，用消毒過的顯微解剖鑷小心剖開蟲體腹部，在盡量不破壞蟲體腸道的情況下，獲得卵巢，并用I X PBS清洗卵巢，之后將卵巢置于含有昆蟲培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中；
(5)共生菌與卵巢共培養(yǎng):將步驟(3)純化得到的共生菌液加入到步驟(4)所述的含有卵巢的培養(yǎng)皿中，進行共生菌與卵巢的共培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為27°C，同時，以50轉/分鐘的速度旋轉培養(yǎng)皿；
(6)觀察:共生菌與卵巢共培養(yǎng)I天后，在倒置顯微鏡下，觀察共生菌進入卵巢的情況。
[0006]以上(I)至(5)步驟中解剖、加樣、取樣等操作均在超凈工作臺內無菌操作完成。
[0007]本發(fā)明的有益效果是:填補了在體外研究半翅目昆蟲共生菌經卵垂直傳播領域的空白，通過利用本方法，可以在共生菌-昆蟲卵巢共培養(yǎng)體系中添加待驗證的因子來判斷此因子是否影響共生菌進入卵巢，從而在體外研究共生菌經卵垂直傳播的機制。
【具體實施方式】
[0008]以下實施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明進行限制，在本發(fā)明的精神和權利要求的保護范圍內，對本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護范圍。
[0009]實施例:在體外研究褐飛虱類酵母共生菌經卵垂直傳播的方法該方法按如下步驟進行:
(1)昆蟲準備:取褐飛虱成熟雌成蟲，用75%酒精進行表面消毒5分鐘后，再用無菌IXPBS(磷酸鹽緩沖液，pH = 6.4)清洗3遍，備用；
(2)獲取共生菌:將上述褐飛虱雌成蟲30頭置于無菌的IXPBS中，用消毒過的顯微解剖鑷小心剖開蟲體腹部，在盡量不破壞蟲體腸道的情況下，用槍頭收集游離的類酵母共生菌；
(3)共生菌的純化:將步驟(2)得到的類酵母共生菌液與Percoll分離液混勻得到含有70% Percoll的混合液，之后進行密度梯度離心，離心后，小心吸取含有類酵母共生菌的上層液，在上述上層液中加入5倍體積以上的I XPBS，混勻后高速離心，獲得類酵母共生菌沉淀，用I X PBS重懸類酵母共生菌，再次高速離心，獲得類酵母共生菌沉淀，如此重復操作3次，盡量去除殘留的Percol I液，用I X PBS重懸類酵母共生菌沉淀，獲得類酵母共生菌懸液，在顯微鏡下用血球計數(shù)板對類酵母共生菌進行計數(shù)，計算類酵母共生菌濃度；
(4)離體卵巢的獲得:取步驟(I)中褐飛虱成熟雌成蟲10頭，置于無菌的IX PBS中，用消毒過的顯微解剖鑷小心剖開蟲體腹部，在盡量不破壞蟲體腸道的情況下，獲得褐飛虱卵巢，并用I XPBS清洗褐飛虱卵巢，之后將10個褐飛虱卵巢置于含有1.5 mL IPL-41 (Giboco,11405-081)昆蟲培養(yǎng)基、直徑為35mm的小培養(yǎng)皿中；
(5)共生菌與卵巢共培養(yǎng):將步驟(3)純化得到的類酵母共生菌液加入到步驟(4)所述的含有褐飛虱卵巢的小培養(yǎng)皿中，類酵母共生菌液終濃度為100000個/mL，將小培養(yǎng)皿放在50轉/分鐘的小搖床上，置于27°C培養(yǎng)箱中，進行類酵母共生菌與褐飛虱卵巢的共培養(yǎng)；
(6)觀察:類酵母共生菌液與褐飛虱卵巢共培養(yǎng)I天后，在倒置顯微鏡下，觀察類酵母共生菌進入褐飛虱卵巢的情況。結果顯示，10個褐飛虱卵巢中均發(fā)現(xiàn)有類酵母共生菌正在進入或已經進入。
[0010]上述步驟(I)至(5)的解剖、加樣、取樣等操作均在超凈工作臺內無菌操作完成。
【主權項】
1.本發(fā)明公開了一種在體外研究昆蟲共生菌經卵垂直傳播的方法，其特征在于所述昆蟲為半翅目類昆蟲。2.本發(fā)明公開了一種在體外研究昆蟲共生菌經卵垂直傳播的方法，其特征還在于該方法包括以下操作步驟: (1)昆蟲準備:用75%酒精對性成熟的雌成蟲表面消毒5分鐘后，再用無菌IXPBS(磷酸鹽緩沖液，PH = 6.4)清洗3遍，備用； (2)獲取共生菌:將上述雌成蟲置于無菌的IXPBS中，用消毒過的顯微解剖鑷小心剖開蟲體腹部，在盡量不破壞蟲體腸道的情況下，收集游離的共生菌； (3 )共生菌的純化:將步驟(2 )得到的共生菌液與P e r c ο 11分離液混勻得到含有7 O %Percol I的混合液，之后進行密度梯度離心純化，最終獲得共生菌懸液，并用血球計數(shù)板進行計數(shù)，計算共生菌懸液中共生菌的濃度； (4)離體卵巢的獲得:取步驟(I)的成蟲，置于無菌的IX PBS，用消毒過的顯微解剖鑷小心剖開蟲體腹部，在盡量不破壞蟲體腸道的情況下，獲得卵巢，并用I XPBS清洗卵巢，之后將卵巢置于含有昆蟲培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中； (5)共生菌與卵巢共培養(yǎng):將步驟(3)純化得到的共生菌液加入到步驟(4)所述的含有卵巢的培養(yǎng)皿中，進行共生菌與卵巢的共培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為27°C，同時，以50轉/分鐘的速度旋轉培養(yǎng)皿； (6)觀察:共生菌與卵巢共培養(yǎng)I天后，在倒置顯微鏡下，觀察共生菌進入卵巢的情況。3.本發(fā)明公開了一種在體外研究昆蟲共生菌經卵垂直傳播的方法，其特征還在于，以上(I)至(5)步驟中解剖、加樣、取樣等操作均在超凈工作臺內無菌操作完成。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種在體外研究昆蟲共生菌經卵垂直傳播的方法。該方法首先將共生菌從昆蟲體內取出離心純化，得到共生菌懸液，然后解剖蟲體獲得卵巢，置于細胞培養(yǎng)基中，之后將純化后的共生菌懸液加入到含有卵巢的細胞培養(yǎng)基中，進行共生菌和昆蟲卵巢的共培養(yǎng)，最后在顯微鏡下觀察共生菌進入卵巢的情況。本發(fā)明有助于在體外對昆蟲共生菌經卵垂直傳播的機制進行研究。
【IPC分類】A01K67/033
【公開號】CN105532581
【申請?zhí)枴緾N201510936490
【發(fā)明人】許益鵬, 韓善捷, 俞葉微, 俞曉平, 郝培應, 申屠旭萍, 張蓬軍, 劉光富, 付賢樹
【申請人】中國計量學院
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2015年12月16日