一種佛手參的快速繁殖方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種佛手參的快速繁殖方法，屬于生物領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]蘭科手參屬植物為多年生草本植物，全世界共10種，我國(guó)有5種，包括西南手參、手參、短距手參、蛾眉手參和角距手參。佛手參因具有可觀的藥用價(jià)值而被列入多部藏醫(yī)藥經(jīng)典。
[0003]蘭科植物的種子極小(每粒種子長(zhǎng)1~2 mm,直徑0.1~0.2 mm)，由于其胚發(fā)育不完全，缺乏供給營(yíng)養(yǎng)成分的胚乳，因此在自然條件下需要與生境中的真菌共生才能萌發(fā)，自然萌發(fā)率極低。蘭科植物依其生長(zhǎng)的環(huán)境可分為氣生蘭和陸生蘭，生長(zhǎng)于土壤中的陸生蘭為了適應(yīng)其分布地的生態(tài)環(huán)境，在長(zhǎng)期的進(jìn)化中發(fā)展了種皮厚及含有阻礙萌發(fā)的物質(zhì)等特征，其種子比氣生蘭種子更難以萌發(fā)。蘭科手參屬植物為陸生蘭類，佛手參的無(wú)性繁殖是由老手參根部?jī)H增生一個(gè)小手參，當(dāng)小手參長(zhǎng)大時(shí)，老手參枯死，平均繁殖倍數(shù)低于2，而種子的自然萌發(fā)率也極低。解決佛手參的種苗規(guī)?；敝呈菍?shí)現(xiàn)其人工栽培、藥用開(kāi)發(fā)及種質(zhì)資源保護(hù)的關(guān)鍵。
[0004]佛手參屬于陸生蘭類，其無(wú)性及有性繁殖均較為困難，人為的采挖導(dǎo)致了野生資源日益匱乏，迫切需要像天麻、石斛等藥用蘭科植物一樣進(jìn)行人工栽培，而種苗的規(guī)?；a(chǎn)是實(shí)現(xiàn)人工栽培的關(guān)鍵技術(shù)?，F(xiàn)有技術(shù)有人曾嘗試?yán)梅鹗謪⒌母⒀矿w和花梗為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)研究，設(shè)計(jì)了大量不同植物生長(zhǎng)物質(zhì)組合的培養(yǎng)基，但接種的150個(gè)塊根、150個(gè)花梗和20余個(gè)芽體無(wú)一例誘導(dǎo)成功，表明佛手參組織培養(yǎng)難度很大。該研究還首次對(duì)佛手參種子進(jìn)行了非共生萌發(fā)研究，種子萌發(fā)率可達(dá)到20%，這已經(jīng)是很重大的突破，但是萌發(fā)率還是非常低，而且將萌發(fā)后得到的原球莖進(jìn)一步進(jìn)行誘導(dǎo)分化處理，分化率最高僅僅為7%左右，而且后期分化得到的芽無(wú)法壯苗成活。
[0005]本發(fā)明旨在提供一種佛手參的快速繁殖方法，其利用多種物理和生物手段，成本低廉，操作方便，可以大幅提高種子的萌發(fā)率，原球莖的分化率，而且可以進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，煉苗后轉(zhuǎn)入溫室最終存活率高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]基于【背景技術(shù)】存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明針對(duì)【背景技術(shù)】存在的問(wèn)題，提供一種佛手參的快速繁殖方法，其利用多種物理和生物手段，成本低廉，操作方便，可以大幅提高種子的萌發(fā)率，原球莖的分化率，而且可以進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，煉苗后轉(zhuǎn)入溫室最終存活率高。
[0007]本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種佛手參的快速繁殖方法，其特征在于，步驟如下:
種子萌發(fā):
(1)預(yù)處理:
取佛手參中度成熟種子，未開(kāi)裂且易與胎座剝離的黃色種子，用流水沖洗30min，然后加入預(yù)處理液中，置于恒溫超聲波發(fā)生器(功率:25KHz)，在28°C恒溫處理3min ;
所述預(yù)處理液的配方為:蘋果酸lg/L，漆酶0.8g/L (酶活為5000u/g)，甘氨酸2g/L,其余為純凈水；
(2)萌發(fā)培養(yǎng)基培養(yǎng):
預(yù)處理后，使用中性洗滌劑清洗，然后用蒸餾水沖洗5遍，在無(wú)菌條件下將其轉(zhuǎn)至無(wú)菌瓶?jī)?nèi)；用無(wú)菌水沖洗3遍后，沖洗干凈后用75%的酒精進(jìn)行消毒20s，用無(wú)菌水沖洗5次，再加入0.1%汞溶液放在振蕩器上進(jìn)行振蕩消毒5min，然后用無(wú)菌水沖洗5次以上，瀝干水分；
用無(wú)菌手術(shù)刀片縱向割開(kāi)果莢，挑出種子，散鋪于萌發(fā)培養(yǎng)基中，接種后的種子在18 °(:黑暗條件下培養(yǎng)5 d后，升溫至25 °C黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)1 d，接著置于光照周期12 h.d-1,光照強(qiáng)度3.2 μπιο?.m 2.s 1的散光條件下培養(yǎng)；
所述萌發(fā)培養(yǎng)基的配方為:以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，蔗糖11.8g/L、瓊脂3.9g/L，復(fù)方中藥提取液 0.5g/L、椰汁 8g/L、6-BA 0.lmg/L, ρΗ6.5 ；
所述復(fù)方中藥提取液的制備方法為:
如下所述均為質(zhì)量份；
取6份羅漢果，3份天山雪蓮，1份黨參，1份淫羊藿，1.7份茯苓，0.8份連翹，上述藥物按傳統(tǒng)煎煮方法加300份煎煮至30份水時(shí)，過(guò)濾，紫外線滅菌于3°C備用；
實(shí)體鏡下觀察萌發(fā)情況并統(tǒng)計(jì)萌動(dòng)率和萌發(fā)率。萌動(dòng)指種子膨大；萌發(fā)指膨大的種子能夠形成原球莖。
[0008]結(jié)果:培養(yǎng)30d后，萌動(dòng)率達(dá)到99.8%，萌發(fā)率高達(dá)92.1%，這是對(duì)瀕危植物佛手參種子育苗研究的重大突破。
[0009]誘導(dǎo)佛手參原球莖分化:
(3)獲得佛手參種子萌芽得到的原球莖；
(4)愈傷組織形成:
將佛手參種子萌芽得到的原球莖移至誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基；
所述誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基的配方為:以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，蔗糖15.8 g/L、瓊脂3.9g/L，海藻糖 5 g/L,復(fù)方中藥提取液 0.3g/L、椰汁 5g/L、6-BA 0.lmg/L、pH6.5 ；
所述復(fù)方中藥提取液的制備方法為:
如下所述均為質(zhì)量份；
取5份黨參，2份天山雪蓮，1份青果，1份淫羊藿，1.6份積雪草，0.5份凌霄花，上述藥物按傳統(tǒng)煎煮方法加300份煎煮至30份水時(shí)，過(guò)濾，紫外線滅菌于3°C備用；
(5)待根狀莖和愈傷組織長(zhǎng)出以后，將根狀莖切為長(zhǎng)約0.2cm的節(jié)段，愈傷組織切成0.2cmX0.2cm小塊平鋪于新鮮的誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基上；置于溫度26°C，光照周期12h.d-1,光照強(qiáng)度22 μπιο?.πι2.s 1的條件下培養(yǎng)，每45 d繼代一次，繼代3次后的增殖倍數(shù)為4.1，分化率高達(dá)81.2%。
[0010]再生植株形成與生長(zhǎng)
(6)分化出芽后，很快在芽基部長(zhǎng)出多條根，這時(shí)轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基:
所述壯苗培養(yǎng)基的配方為:以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，蔗糖18.8-20.lg/L、瓊脂3.9g/L，膠原蛋白 0.2-0.5g/L、海藻糖 3-4g/L、椰汁 6g/L、6_BA 0.2-0.3mg/L、ρΗ6.5 ； 置于溫度26°C，光照周期12 h.d-1,光照強(qiáng)度25 μπιο?.m 2.s 1的條件下培養(yǎng)；
壯苗培養(yǎng)5周后，分化的芽發(fā)育形成健康的小苗，存活率為78.1-92.3%。
[0011]本發(fā)明利用多種物理和生物手段，成本低廉，操作方便，可以大幅提高種子的萌發(fā)率，原球莖的分化率，而且可以進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，成活率高，而且煉苗后轉(zhuǎn)入溫室最終存活率也很高。
[0012]本發(fā)明的有益之處在于:
本發(fā)明利用多種物理和生物手段，成本低廉，操作方便，可以大幅提高種子的萌發(fā)率，原球莖的分化率，而且可以進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，壯苗培養(yǎng)5周后，分化的芽發(fā)育形成健康的小苗，存活率為78.1-92.3%ο
[0013]，而且煉苗后轉(zhuǎn)入溫室最終存活率也很高。
【具體實(shí)施方式】
[0014]實(shí)施例1:
一種佛手參的快速繁殖方法，其特征在于，步驟如下:
種子萌發(fā):
(1)預(yù)處理:
取佛手參中度成熟種子，未開(kāi)裂且易與胎座剝離的黃色種子，用流水沖洗30min，然后加入預(yù)處理液中，置于恒溫超聲波發(fā)生器(功率:25KHz)，在28°C恒溫處理3min ;
所述預(yù)處理液的配方為:蘋果酸lg/L，漆酶0.8g/L (酶活為5000u/g)，甘氨酸2g/L,其余為純凈水；
(2)萌發(fā)培養(yǎng)基培養(yǎng):
預(yù)處理后，使用中性洗滌劑清洗，然后用蒸餾水沖洗5遍，在無(wú)菌條件下將其轉(zhuǎn)至無(wú)菌瓶?jī)?nèi)；用無(wú)菌水沖洗3遍后，沖洗干凈后用75%的酒精進(jìn)行消毒20s，用無(wú)菌水沖洗5次，再加入0.1%汞溶液放在振蕩器上進(jìn)行振蕩消毒5min，然后用無(wú)菌水沖洗5次以上，瀝干水分；
用無(wú)菌手術(shù)刀片縱向割開(kāi)果莢，挑出種子，散鋪于萌發(fā)培養(yǎng)基中，接種后的種子在18 °(:黑暗條件下培養(yǎng)5 d后，升溫至25 °C黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)1 d，接著置于光照周期12 h.d-1,光照強(qiáng)度3.2 μπιο?.m 2.s 1的散光條件下培養(yǎng)；
所述萌發(fā)培養(yǎng)基的配方為:以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，蔗糖11.8g/L、瓊脂3.9g/L，復(fù)方中藥提取液 0.5g/L、椰汁 8g/L、6-BA 0.lmg/L, ρΗ6.5 ；
所述復(fù)方中藥提取液的制備方法為:
如下所述均為質(zhì)量份；
取6份羅漢果，3份天山雪蓮，1份黨參，1份淫羊藿，1.7份茯苓，0.8份連翹，上述藥物按傳統(tǒng)煎煮方法加300份煎煮至30份水時(shí)，過(guò)濾，紫外線滅菌于3°C備用；
實(shí)體鏡下觀察萌發(fā)情況并統(tǒng)計(jì)萌動(dòng)率和萌發(fā)率。萌動(dòng)指種子膨大；萌發(fā)指膨大的種子能夠形成原球莖。
[0015]結(jié)果:培養(yǎng)30d后，萌動(dòng)率達(dá)到99.8%，萌發(fā)率高達(dá)92.1%，這是對(duì)瀕危植物佛手參種子育苗研究的重大突破。
[0016]誘導(dǎo)佛手參原球莖分化: (3)獲得佛手參種子萌芽得到的原球莖；
(4)愈傷組織形成:
將佛手參種子萌芽得到的原球莖移至誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基；
所述誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基的配方為:以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，蔗糖15.8 g/L、瓊脂3.9g/L，海藻糖 5 g/L,復(fù)方中藥提取液 0.3g/L、椰汁 5g/L、6-BA 0.lmg/L、pH6.5 ；
所述復(fù)方中藥提取液的制備方法為:
如下所述均為質(zhì)量份；
取5份黨參，2份天山雪蓮，1份青果，1份淫羊藿，1.6份積雪草，0.5份凌霄花，上述藥物按傳統(tǒng)煎煮方法加300份煎煮至30份水時(shí)，過(guò)濾，紫外線滅菌于3°C備用；
(5)待根狀莖和愈傷組織長(zhǎng)出以后，將根狀莖切為長(zhǎng)約0.2cm的節(jié)段，愈傷組織切成0.2cmX0.2cm小塊平鋪于新鮮的誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基上；置于溫度26°C，光照周期12h.d-1,光照強(qiáng)度22 μπιο?.πι2.s 1的條件下培養(yǎng)，每45 d繼代一次，繼代3次后的增殖倍數(shù)為4.1，分化率高達(dá)81.2%。
[0017]再生植株形成與生長(zhǎng)
(6)分化出芽后，很快在芽基部長(zhǎng)出多條根，這時(shí)轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基:
所述壯苗培養(yǎng)基的配方為:以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，蔗糖18.8g/L、瓊脂3.9g/L，膠原蛋白0.5g/L、海藻糖 3g/L、椰汁 6g/L、6_BA 0.3mg/L、pH6.5 ；
置于溫度26°C，光照周期12 h.d-1,光照強(qiáng)度25 μπιο?.m 2.s 1的條件下培養(yǎng)；
壯苗培養(yǎng)5周后，分化的芽發(fā)育形成健康的小苗，存活率為78.1%。
[0018]實(shí)施例2:
一種佛手參的快速繁殖方法，其特征在于，步驟如下:
種子萌發(fā):
(1)預(yù)處理:
取佛手參中度成熟種子，未開(kāi)裂且易與胎座剝離的黃色種子，用流水沖洗30min，然后加入預(yù)處理液中，置于恒溫超聲波發(fā)生器(功率:25KHz)，在28°C恒溫處理3min ;
所述預(yù)處理液的配方為:蘋果酸lg/L，漆酶0.8g/L (酶活為5000u/g)，甘氨酸2g/L,其余為純凈水；
(2)萌發(fā)培養(yǎng)基培養(yǎng):