開(kāi)放式植物組織培養(yǎng)的抑菌組合物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種應(yīng)用于組織培養(yǎng)的抑菌組合物，尤其涉及一種用植物提取物配制 成的用于開(kāi)放式的植物組織培養(yǎng)生根階段的抑菌組合物，本發(fā)明進(jìn)一步涉及該抑菌組合物 的制備方法，屬于開(kāi)放式植物組織培養(yǎng)的抑菌劑領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前組織培養(yǎng)技術(shù)是解決草莓病毒病最常用的技術(shù)之一，能使草莓種苗恢復(fù)原種 優(yōu)良性狀，達(dá)到優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的目的。近幾年，草莓組培苗工廠化生產(chǎn)在中國(guó)發(fā)展迅速，并取得 了顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。因傳統(tǒng)的植物組織培養(yǎng)對(duì)無(wú)菌環(huán)境要求苛刻，對(duì)操作人員 要求嚴(yán)格，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程操作繁瑣，導(dǎo)致草莓組培苗難以大規(guī)模推廣應(yīng)用。因此，尋找出能 解決以上問(wèn)題的方法，利于草莓組培苗的大規(guī)模生產(chǎn)。
[0003] 近年來(lái)新興了一種開(kāi)放式組培方法，其通過(guò)向培養(yǎng)基中添加抑（殺）菌劑替代高 壓滅菌、無(wú)菌接種和無(wú)菌培養(yǎng)，創(chuàng)造一個(gè)方便、快捷、可靠和低成本的組培方法。
[0004] 專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)為CN103329800A公開(kāi)了"一種植物開(kāi)放式組培時(shí)不用瓊脂的組培培 養(yǎng)基及其制備方法"，該培養(yǎng)基是以凱松（異噻唑啉酮）、氯化鎂、硝酸鎂、山梨酸鉀、苯鉀酸 鈉構(gòu)成抑菌混合液，此發(fā)明省略了造價(jià)昂貴的接種室、培養(yǎng)室，但是存在抑菌效果較差、制 備成本高等缺陷。專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)為CN104770293A公開(kāi)了"白芨開(kāi)放式組培育苗方法"是以凱 松（異噻唑啉酮）和尼泊金脂鈉構(gòu)成抑菌混合液，此發(fā)明設(shè)備投資少、操作簡(jiǎn)便、成本低、效 益高，但是對(duì)于其它的植物的組培滅菌效果較差。專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)為CN101946809A公開(kāi)了"一 種適用于植物組織培養(yǎng)的抑菌劑"是以ε-聚賴(lài)氨酸、異噻唑啉酮、中藥水提物、山梨酸鉀、 苯甲酸鈉構(gòu)成抑菌混合液，此發(fā)明可節(jié)約能源、降低組培苗的成本，提高效益，但是該滅菌 劑存在對(duì)于草莓組培的抑菌效果差的缺陷。
[0005] 迄今為止，尚缺乏一種安全環(huán)保，無(wú)任何毒害，不僅能有效抑菌，還能有效促進(jìn)草 莓試管苗生長(zhǎng)的抑菌組合物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是解決傳統(tǒng)植物組織培養(yǎng)對(duì)無(wú)菌環(huán)境要求苛刻，對(duì)操 作人員要求嚴(yán)格，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程操作繁瑣等多種因素綜合起來(lái)導(dǎo)致的包括草莓在內(nèi)的組培 苗難以大規(guī)模推廣應(yīng)用的問(wèn)題，提供一種安全環(huán)保、無(wú)任何毒害、用于生根階段的開(kāi)放式培 養(yǎng)的有效抑菌的抑菌組合物。
[0007] 為了解決以上問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：
[0008] 用于植物組織培養(yǎng)生根階段的開(kāi)放式培養(yǎng)的抑菌組合物，由以下各原料制成：見(jiàn) 血飛、顛茄草和通城虎；
[0009] 優(yōu)選的，各原料的重量份是：見(jiàn)血飛12-25份、顛茄草2-10份、通城虎1-8份；
[0010] 更優(yōu)選的，各原料的重量份是：見(jiàn)血飛16-20份、顛茄草3-5份、通城虎4-6份。
[0011] 更優(yōu)選的，各原料的重量份是：見(jiàn)血飛18份、顛茄草4份、通城虎5份。
[0012] 見(jiàn)血飛（AlstoniamaireiLev)為夾竹桃科（Apocynaceae)雞骨常山屬 (Alstonia)植物，別名為羊角棉、雞舌頭樹(shù)。民間多用其根、莖、葉治療刀傷出血和瘡毒。
[0013] 顛前草為前科植物顛前（AtropabelladonnaL.)的干燥全草。為多年生草本植物， 屬于茄科茄族枸杞亞族顛茄屬中的一個(gè)種，全草入藥。原產(chǎn)歐洲中、南部及小亞細(xì)亞。顛茄 俗名"野山茄"，主要用于胃痙攣，胃、十二指腸潰瘍病，膽絞痛，輸尿管結(jié)石等引起的腹痛， 胃炎及胃痙攣引起的嘔吐和腹瀉，迷走神經(jīng)興奮導(dǎo)致的多汗、流涎、心率慢、頭暈、暈服等。
[0014] 通城虎，別名：五虎通城、定心草、萬(wàn)丈藤、大散血、血筠，拉丁文名：Aristolochia fordianaHemsl.馬兜鈴科、馬兜鈴屬草質(zhì)藤本。根供藥用。味苦、辛，性溫，有小毒。有解 毒消腫、祛風(fēng)鎮(zhèn)痛、行氣止咳之效。民間治療胃痛、胸腹脹痛、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，外用治療毒，濕 疹、疥癬等。
[0015] 為了提供一種安全環(huán)保、無(wú)任何毒害、用于生根階段的開(kāi)放式培養(yǎng)的有效抑菌的 抑菌組合物，本發(fā)明將見(jiàn)血飛、顛茄草、通城虎、肉蓯蓉、玉米須、四棱豆、三花槍刀藥、管花 馬兜鈴、洋金花以及樗葉花椒進(jìn)行三元復(fù)配得到不同處理的抑菌組合物以篩選得到抑菌效 果好且能有效促進(jìn)植物試管苗生長(zhǎng)的抑菌組合物。
[0016] 組分篩選試驗(yàn)結(jié)果表明：將見(jiàn)血飛、顛茄草和通城虎按一定比例混合煎煮，得到的 藥液與生根培養(yǎng)基混合，制得的抑菌培養(yǎng)基相比于其它的組合，不僅能抑菌，還能極顯著的 增加株高，促進(jìn)根長(zhǎng)和增加根條數(shù)。
[0017] 鑒于植物配伍成分影響非常復(fù)雜，可能存在增效、拮抗等多種影響，可能存在二元 復(fù)配優(yōu)于三元復(fù)配的情況。所以根據(jù)試驗(yàn)例1的情況設(shè)計(jì)二元復(fù)配試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可 見(jiàn)，將見(jiàn)血飛、顛茄草和通城虎按一定比例混合煎煮，得到的藥液與生根培養(yǎng)基混合，制得 的抑菌培養(yǎng)基的效果顯著優(yōu)于其它的復(fù)配方案（即處理2-20,差異達(dá)極顯著水平），結(jié)合試 驗(yàn)例1綜合考慮，將見(jiàn)血飛、顛茄草和通城虎按一定比例混合煎煮的復(fù)配效果要明顯優(yōu)于 其它的復(fù)配方案，這表明該復(fù)配方案中的見(jiàn)血飛、顛茄草和通城虎的煎煮液間有明顯的協(xié) 同增效功效。
[0018] 在經(jīng)過(guò)試驗(yàn)確定了由見(jiàn)血飛、顛茄草和通城虎組成的組合物具有協(xié)同增效的抑菌 以及促進(jìn)試管苗生長(zhǎng)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，見(jiàn)血飛、顛茄草和通城虎的不同用量配 比，對(duì)于抑菌以及促進(jìn)生長(zhǎng)的影響也非常顯著。本發(fā)明通過(guò)大量的篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，三種成分 按照以下用量范圍進(jìn)行配伍具有更好的協(xié)同效果：
[0019] 將見(jiàn)血飛、顛茄草和通城虎按照16-20:3-5:4-6的質(zhì)量比例進(jìn)行配伍，該復(fù)配方 案在增加株高、促進(jìn)根長(zhǎng)、增加根條數(shù)和抑制培養(yǎng)基污染等方面的效果顯著優(yōu)于其它方案； 其中，綜合各項(xiàng)指標(biāo)，將見(jiàn)血飛、顛茄草和通城虎按照18:4:5的質(zhì)量比例進(jìn)行配伍，制得 的抑菌培養(yǎng)基的效果是復(fù)配方案中最好的，顯著優(yōu)于該復(fù)配方案中的其它配方（即：處理 2-14,差異達(dá)顯者水平）。
[0020] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種制備所述抑菌組合物的方法，該方法包括：
[0021] (1)稱(chēng)取見(jiàn)血飛、顛茄草和通城虎；
[0022] (2)將見(jiàn)血飛、顛茄草和通城虎混合均勻后用水煎煮；煎煮液過(guò)濾，取濾液，即得。
[0023] 優(yōu)選的，步驟（2)中按照g/ml計(jì)，見(jiàn)血飛、顛茄草和通城虎組成的抑菌組合物與水 的比例為1:10-30,更優(yōu)選為1:20 ;
[0024] 所述的煎煮是60°C煎煮0· 5_4h，優(yōu)選為2h。
[0025] 本發(fā)明抑菌組合物能夠應(yīng)用于植物組培生根階段的開(kāi)放式培養(yǎng)的各步驟的消毒， 包括制備抑菌培養(yǎng)基（對(duì)生根培養(yǎng)基進(jìn)行消毒）、培養(yǎng)容器的消毒、試管苗的消毒以及試管 苗的培育等。
[0026] 優(yōu)選的，所述的培養(yǎng)基是生根培養(yǎng)基，更優(yōu)選為草莓的生根培養(yǎng)基；最優(yōu)選的，所 述草莓的生根培養(yǎng)基的成分包括：1/2MS、NAA、瓊脂和蔗糖；
[0027] 作為一種參考，所述抑菌生根培養(yǎng)基的制備可參考下述方法：
[0028] 生根培養(yǎng)基的制備：稱(chēng)取5. 7gl/2MS培養(yǎng)粉、24g蔗糖和8. 4g瓊脂，混合均勻，放 入1. 2L水中，加熱煮沸，備用；
[0029] 抑菌生根培養(yǎng)基的制備：將按照上述方法制備的抑菌組合物放入2L燒杯中，用生 根培養(yǎng)基定容至1L，然后加入500mg/LNAA母液2ml，混勻，制得抑菌培養(yǎng)基。
[0030] 所述的培養(yǎng)容器的消毒包括：將制備的抑菌組合物與無(wú)菌水按1:30的比例稀釋?zhuān)?制得稀釋液；將培養(yǎng)容器放入稀釋液中充分浸泡4h，晾干，備用。
[0031] 所述的試管苗的消毒包括：將制備的抑菌組合物與無(wú)菌水按1:30的比例稀釋?zhuān)?得稀釋液，備用；先用75%酒精消毒試管苗30s，無(wú)菌水沖洗3遍，再用2%次氯酸鈉浸泡 2min，無(wú)菌水沖洗5遍，然后放入稀釋液中充分浸泡2h，晾干，備用。
[0032] 所述的試管苗的培育包括：在開(kāi)放的自然環(huán)境中，將按照上述消毒方式消毒后的 試管苗用濾紙吸干，接種于抑菌培養(yǎng)基中，放在自然環(huán)境中培養(yǎng)。
[0033] 本發(fā)明首先通過(guò)組分篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將見(jiàn)血飛、顛茄草和通城虎配伍在一起得到的 抑菌組合物，相比于其它的組合，不僅能有效抑菌，還能顯著增加試管苗的株高、促進(jìn)根長(zhǎng) 和增加根條數(shù)。在確定了由見(jiàn)血飛、顛茄草和通城虎組成的抑菌組合物具有協(xié)同增效的基 礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，將見(jiàn)血飛、顛茄草和通城虎按照16-20:3-5:4-6的質(zhì)量比例進(jìn)行 配伍具有更佳的協(xié)同效果，尤其是按照18:4:5的比例進(jìn)行配伍時(shí)，三者之間具有極顯著的 協(xié)同增效功效，不僅能有效抑制生根培養(yǎng)基的污染，在增加株高、促進(jìn)根長(zhǎng)和增加根條數(shù)等 促進(jìn)試管苗生長(zhǎng)等方面的效果也更顯著。本發(fā)明設(shè)備投資少、環(huán)境要求低、操作簡(jiǎn)單、效益 尚。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié) 和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0035] 實(shí)施例1抑菌組合物的制備
[0036] 按以下質(zhì)量稱(chēng)取各成分（單位：g):見(jiàn)血飛18,顛茄草4,通城虎5,加水540ml， 100°C煎煮2h;將煎煮液過(guò)濾，棄藥渣，取濾液（簡(jiǎn)稱(chēng)A液），即得。
[0037] 實(shí)施例2抑菌組合物的制備
[0038] 按以下質(zhì)量稱(chēng)取各成分（單位：g):見(jiàn)血飛20,顛茄草3,通城虎6,加水580ml， 100°c煎煮3h，將煎煮液過(guò)濾，棄藥渣，取濾液（簡(jiǎn)稱(chēng)A液），即得。
[0039] 實(shí)施例3抑菌組合物的制備
[0040] 按以下質(zhì)量稱(chēng)取各成分（單位：g):見(jiàn)血飛16,顛茄草5,通城虎4,加水500ml， 100°C煎煮lh;將煎煮液過(guò)濾，棄藥渣，取濾液（簡(jiǎn)稱(chēng)A液），即得。
[0041] 實(shí)施例4抑菌組合物用于制備抑菌培養(yǎng)基
[0042] 生根培養(yǎng)基配方組成：1/2MS、NAA、瓊脂、蔗糖。
[0043] 生根培養(yǎng)基的制備：稱(chēng)取5. 7gl/2MS培養(yǎng)粉、24g蔗糖和8. 4g瓊脂，混合均勻，放 入1. 2L水中，加熱煮沸，備用。
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