一種萬(wàn)代蘭原球莖快速增殖培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及蘭花組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種萬(wàn)代蘭原球莖快速增殖培養(yǎng) 基。
【背景技術(shù)】
[0002] 萬(wàn)代蘭，別名萬(wàn)帶蘭，屬蘭科萬(wàn)代蘭屬。萬(wàn)代蘭花朵大，花色鮮艷，尤以藍(lán)色花朵最 為突出?？捎糜谂柙曰虻跖栌^賞，也可以擺放在客廳、書房或懸掛于窗臺(tái)、陽(yáng)臺(tái)。由于花期 長(zhǎng)，耐貯運(yùn)，常用作切花觀賞、制作新娘捧花和貴賓禮儀花束，深受國(guó)內(nèi)外人民喜愛(ài)。
[0003] 近年來(lái)，蘭花組織培養(yǎng)技術(shù)及試管苗工廠化生產(chǎn)取得了迅猛的發(fā)展，但萬(wàn)代蘭的 褐化問(wèn)題，特別是原球莖增殖褐化問(wèn)題嚴(yán)重制約萬(wàn)代蘭的組培增殖，使萬(wàn)代蘭的生產(chǎn)越來(lái) 越難以滿足不斷增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求?，F(xiàn)有的萬(wàn)代蘭增殖培養(yǎng)基通常在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添 加15%的椰子汁、lmg/L的6-BA、0. 5mg/L的ΝΑΑ、0· 7%的瓊脂粉、20g/L的蔗糖，并沒(méi)有能明 顯抑制萬(wàn)代蘭原球莖增殖時(shí)褐化的手段，導(dǎo)致大量萬(wàn)代蘭原球莖褐化死亡，嚴(yán)重影響增殖 效率，造成大量的浪費(fèi)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 基于此，有必要針對(duì)萬(wàn)代蘭原球莖增殖時(shí)褐化嚴(yán)重而影響增殖效率的問(wèn)題，提供 一種能抑制褐化的萬(wàn)代蘭快速增殖培養(yǎng)基，以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加有ZT (玉米 素)、2, 4-D (2, 4-二氯苯氧乙酸)、還原型谷胱甘肽、瓊脂粉、蔗糖，能夠加快萬(wàn)代蘭增殖速 度，提高增殖系數(shù)和抑制增殖褐化，降低褐化率。
[0005] 基于此，有必要針對(duì)萬(wàn)代蘭原球莖增殖時(shí)褐化嚴(yán)重而影響增殖效率的問(wèn)題，提供 一種能抑制褐化的萬(wàn)代蘭快速增殖培養(yǎng)基。
[0006] 一種萬(wàn)代蘭快速增殖培養(yǎng)基，以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加有ZT (玉米素)、 2, 4-D (2, 4-二氯苯氧乙酸)、還原型谷胱甘肽、瓊脂粉、蔗糖。
[0007] -種萬(wàn)代蘭快速增殖培養(yǎng)基，附加 ZT (玉米素)1~5mg/L，2, 4-D (2, 4-二氯苯氧 乙酸）的濃度為〇. 2~0. 6mg/L，還原型谷胱甘肽的濃度為50~150mg/L，瓊脂粉的濃度為 7~8g/L，鹿糖的濃度為20~30g/L。
[0008] 一種萬(wàn)代蘭快速增殖培養(yǎng)基，附加 ZT (玉米素）3mg/L，2, 4-D (2, 4-二氯苯氧乙 酸）的濃度為〇. 4mg/L，還原型谷胱甘肽的濃度為100mg/L，瓊脂粉的濃度為7. 5g/L，蔗糖的 濃度為25g/L。
[0009] 一種萬(wàn)代蘭快速增殖培養(yǎng)基，其配制完成后最終pH值為6. 0~7. 0。
[0010] -種萬(wàn)代蘭快速增殖培養(yǎng)基，其配制完成后最終pH值為6. 5。
[0011] -種萬(wàn)代蘭快速增殖培養(yǎng)基，其配制方法包括以下步驟： 步驟S001 :配制MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加蔗糖、2, 4-D (2, 4-二氯苯氧乙酸)、瓊脂粉， 120~121 C尚溫滅囷20~21分鐘，備用； 步驟S002 :用無(wú)水乙醇溶解ZT (玉米素)，再用純化水稀釋至所需濃度，還原型谷胱甘 肽用純化水溶解并稀釋至所需濃度，過(guò)濾滅菌，備用； 步驟S003 :待高溫滅菌后的MS培養(yǎng)基溫度下降至50~60°C時(shí)加入已過(guò)濾滅菌的ZT(玉 米素）和還原型谷胱甘肽，混勻，冷卻凝固。
[0012] 本發(fā)明的萬(wàn)代蘭快速增殖培養(yǎng)基，通過(guò)玉米素、2, 4-二氯苯氧乙酸、還原型谷胱甘 肽聯(lián)合作用于萬(wàn)代蘭原球莖，能有效抑制萬(wàn)代蘭原球莖增殖褐化，提高增殖系數(shù)。其中，玉 米素是一種天然的細(xì)胞分裂素，能促進(jìn)原球莖細(xì)胞快速分裂，且對(duì)萬(wàn)代蘭原球莖無(wú)任何副 作用；2, 4-二氯苯氧乙酸是一種人工合成的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑能促進(jìn)原球莖細(xì)胞快速增長(zhǎng)， 且因人工合成而價(jià)格便宜；還原型谷胱甘肽是一種由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成的三 肽，其含有一個(gè)活潑的巰基-SH，具有強(qiáng)還原性，可以阻止酚類物質(zhì)氧化成褐色的醌類物質(zhì) 并將醌類物質(zhì)還原成酚類物質(zhì)，另外谷胱甘肽能與酚類物質(zhì)結(jié)合，從而減少游離的酚類物 質(zhì)，抑制褐化；瓊脂作為固體培養(yǎng)平臺(tái)，為原球莖提供養(yǎng)分、水分與透氣的效用，并添加蔗 糖，為萬(wàn)代蘭原球莖增殖生長(zhǎng)提供碳源。
[0013] 本發(fā)明的萬(wàn)代蘭快速增殖培養(yǎng)基中，玉米素的濃度優(yōu)選為1~5mg/L，若其用量過(guò) 少，則不能充分促進(jìn)原球莖細(xì)胞分裂，導(dǎo)致增殖效果差，若其用量過(guò)多，則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增長(zhǎng) 過(guò)快，容易造成變異；2, 4-二氯苯氧乙酸的濃度優(yōu)選為0. 2~0. 6mg/L，若其用量過(guò)少，會(huì)導(dǎo) 致促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)效率差，細(xì)胞生長(zhǎng)速度慢，影響增殖效果，若其用量過(guò)多，反而會(huì)抑細(xì)胞生 長(zhǎng)，產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)；還原型谷胱甘肽的濃度優(yōu)選為50~150mg/L，若其用量過(guò)少，則抑制褐化 效果差，造成大量原球莖褐化死亡，影響增殖系數(shù)，若其用量過(guò)多，不會(huì)有更明顯的抑制褐 化效果，造成浪費(fèi)，增加成本。
[0014] 本發(fā)明的萬(wàn)代蘭快速增殖培養(yǎng)基中，通過(guò)玉米素和2, 4-二氯苯氧乙酸的互作效 應(yīng)，分別從細(xì)胞分裂和細(xì)胞生長(zhǎng)入手，提高原球莖的增殖率。另外再添加谷胱甘肽抑制褐 化，減少原球莖因褐化死亡而做成的損失，提高增殖效率和減少損失雙管齊下，極大地提高 了萬(wàn)代蘭的增殖數(shù)量。
[0015] 本發(fā)明的萬(wàn)代蘭快速增殖培養(yǎng)基，將pH值控制在6. 5,呈弱酸性環(huán)境，有利于原球 莖的增殖，從而提增殖率。
[0016] 實(shí)施例一：本發(fā)明所述的萬(wàn)代蘭快速增殖培養(yǎng)基的制備 根據(jù)表1所示的MS培養(yǎng)基配方以及表2所示的萬(wàn)代蘭快速增殖培養(yǎng)基配方，制備本發(fā) 明所述的萬(wàn)代蘭快速增殖培養(yǎng)基。
[0017] 按配制llOOmL培養(yǎng)基的量，分別稱取MS培養(yǎng)基中的各成分以及2, 4-二氯苯氧乙 酸、瓊脂粉、蔗糖，置于三角瓶中，加入適量純化水，攪拌溶解，定容至l〇〇〇mL，并調(diào)節(jié)pH值 至6. 5。將三角瓶封口，置于高壓滅菌鍋中，于121 °C滅菌20min，然后置于超凈工作臺(tái)中自 然冷卻，得到滅菌培養(yǎng)基母液，備用。
[0018] 按配制llOOmL培養(yǎng)基的量，分別稱取玉米素和還原型谷胱甘肽，加入適量純化水 溶解，混勻，在超凈工作臺(tái)中過(guò)濾滅菌，備用。
[0019] 在超凈工作臺(tái)中，待滅菌培養(yǎng)基母液冷卻至60°C后，加入滅菌后的玉米素和還原 型谷胱甘肽溶液，定容至1100ml，混勻，制得llOOmL兜蘭種子萌發(fā)培養(yǎng)基。
[0020] 取所制得的萬(wàn)代蘭快速增殖培養(yǎng)基，分裝至組織培養(yǎng)瓶中，晾涼，待其凝固后將組 織培養(yǎng)瓶封口，備用。
[0021] 表1 MS培養(yǎng)基的成分及其用量。
[0022] 表2萬(wàn)代蘭快速增殖培養(yǎng)基的成分及其用量。
[0023] 實(shí)施例二：本發(fā)明所述的萬(wàn)代蘭快速增殖培養(yǎng)基的測(cè)試 根據(jù)表1所示的MS培養(yǎng)基配方以及表3所示的萬(wàn)代蘭快速增殖培養(yǎng)基配方，參照實(shí)施 例一所述的培養(yǎng)基制備方法，分別制備各試驗(yàn)組、對(duì)照組的萬(wàn)代蘭快速增殖培養(yǎng)基。
[0024] 表3萬(wàn)代蘭快速增殖培養(yǎng)基。
[0025] 備注：對(duì)照組1為現(xiàn)有技術(shù)對(duì)照組，配方為常規(guī)萬(wàn)代蘭增殖培養(yǎng)基配方。
[0026] 選取無(wú)褐化、無(wú)玻璃化無(wú)、無(wú)污染且生長(zhǎng)健康的萬(wàn)代蘭初代原球莖，切成厚度約為 2~3cm的小塊，接種于表3所示各試驗(yàn)組、對(duì)照組的培養(yǎng)基中，每瓶接種20塊，然后于光暗 周期為12h光照/12h黑暗、光照強(qiáng)度為ISOOlux、溫度為26±2°C的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng) 50天后統(tǒng)計(jì)原球莖褐化率、增長(zhǎng)系數(shù)和增殖系數(shù)，結(jié)果如表4所示。
[0027] 表4萬(wàn)代蘭快速增殖培養(yǎng)基測(cè)試結(jié)果。
[0028] 備注：1·綜合評(píng)分 y = (c*0. 6_a*0. 3/100+b*0. 1)*10 ; 2.增長(zhǎng)系數(shù)=總增殖量/接種量增殖系數(shù)=有效增殖量/接種量。
[0029] 由表4的試驗(yàn)結(jié)果可知，采用本發(fā)明所述的萬(wàn)代蘭快速增殖培養(yǎng)基，能夠顯著提 高萬(wàn)代蘭原球莖增殖系數(shù)，并降低其褐化率，縮短萬(wàn)代蘭的增值時(shí)間。由對(duì)照組4和試驗(yàn) 組5對(duì)比可以看出原球莖褐化死亡嚴(yán)重影響萬(wàn)代蘭原球莖的增殖，由對(duì)照組2、3和試驗(yàn)組 5對(duì)比可以看出玉米素和2, 4-二氯苯氧乙酸存在互作效應(yīng)，兩者混用比單獨(dú)使用起到更好 的促進(jìn)作用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種萬(wàn)代蘭快速增殖培養(yǎng)基，其特征在于：以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加有ZT (玉米素)、2, 4-D (2, 4-二氯苯氧乙酸)、還原型谷胱甘肽、瓊脂粉、蔗糖。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的萬(wàn)代蘭快速增殖培養(yǎng)基，其特征在于：ZT (玉米素)1~5mg/ L，2, 4-D (2, 4-二氯苯氧乙酸）的濃度為0. 2~0. 6mg/L，還原型谷胱甘肽的濃度為50~ 150mg/L，瓊脂粉的濃度為7~8g/L，蔗糖的濃度為20~30g/L。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的萬(wàn)代蘭快速增殖培養(yǎng)基，其特征在于：ZT (玉米素）3mg/L， 2, 4-D (2, 4-二氯苯氧乙酸）的濃度為0. 4mg/L，還原型谷胱甘肽的濃度為100mg/L，瓊脂粉 的濃度為7. 5g/L，蔗糖的濃度為25g/L。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3的其中之一所述的萬(wàn)代蘭增殖培養(yǎng)基，其特征在于：所述萬(wàn)代 蘭增殖培養(yǎng)基的pH值為6. 0~7. 0。5. 根據(jù)權(quán)利要求4的所述的萬(wàn)代蘭增殖培養(yǎng)基，其特征在于：所述萬(wàn)代蘭增殖培養(yǎng)基 的pH值為6. 5。6. 根據(jù)權(quán)利要求1至3的其中之一所述的萬(wàn)代蘭增殖培養(yǎng)基，其特征在于：所述的萬(wàn) 代蘭增殖培養(yǎng)基的配制方法包括以下步驟： 步驟SOOl :配制MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加蔗糖、2, 4-D (2, 4-二氯苯氧乙酸)、瓊脂粉， 120~121 C尚溫滅囷20~21分鐘，備用； 步驟S002 :用無(wú)水乙醇溶解ZT (玉米素)，再用純化水稀釋至所需濃度，還原型谷胱甘 肽用純化水溶解并稀釋至所需濃度，過(guò)濾滅菌，備用； 步驟S003 :待高溫滅菌后的MS培養(yǎng)基溫度下降至50~60°C時(shí)加入已過(guò)濾滅菌的ZT(玉 米素）和還原型谷胱甘肽，混勻，冷卻凝固。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種萬(wàn)代蘭原球莖快速增殖培養(yǎng)基。本發(fā)明所述的萬(wàn)代蘭原球莖快速增殖培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加有ZT（玉米素）、2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、還原型谷胱甘肽、瓊脂粉、蔗糖，能夠加快萬(wàn)代蘭增殖速度，提高增殖系數(shù)和抑制增殖褐化，降低褐化率。
【IPC分類】A01H4/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105230498
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510843185
【發(fā)明人】黃慶梅
【申請(qǐng)人】廣東粵三胖農(nóng)業(yè)科技有限責(zé)任公司
【公開(kāi)日】2016年1月13日
【申請(qǐng)日】2015年11月26日