用于治療神經(jīng)變性的細(xì)胞療法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本公開(kāi)描述細(xì)胞組合物和用于治療神經(jīng)變性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)變性是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡的病理狀態(tài)。盡管神經(jīng)變性的成因可能多種多樣而 且并不總能確定，但是許多神經(jīng)病癥都具有神經(jīng)變性作為共同的病理狀態(tài)。例如，阿爾茲海 默癥、帕金森癥、亨廷頓癥和肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS)都引起慢性神經(jīng)變性，其特征在于神 經(jīng)細(xì)胞在若干年期間緩慢且逐漸死亡，而急性神經(jīng)變性的特征在于由缺血（例如，中風(fēng)）或 創(chuàng)傷（例如，創(chuàng)傷性腦損傷）導(dǎo)致的，或者由例如因脊椎受傷或多發(fā)性硬化而引起的脫髓鞘 或創(chuàng)傷造成的軸索切斷（axonal transection)導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞死亡的突然發(fā)作。
[0003] 各種各樣的由例如酗酒、藥物成癮、暴露于神經(jīng)毒素和輻射所導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損 傷也可引發(fā)神經(jīng)變性。神經(jīng)變性的跡象甚至在癡呆、癲癇、各種精神病癥中都可發(fā)現(xiàn)，而且 也是正常老化過(guò)程的一部份。
[0004] 無(wú)論根本原因是什么，越來(lái)越多證據(jù)表明，一旦引發(fā)神經(jīng)變性，所有這些病癥的結(jié) 局始終相同 神經(jīng)細(xì)胞的最終死亡。
[0005] 中風(fēng)涉及由通向大腦或大腦內(nèi)的血管的阻塞（缺血性中風(fēng)）或破裂（出血）導(dǎo) 致的急性神經(jīng)變性（中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細(xì)胞快速損耗并伴隨功能喪失）。由于中風(fēng)可以引 起永久性神經(jīng)損害、全身并發(fā)癥和甚至死亡，因此中風(fēng)通常構(gòu)成醫(yī)療急診。在美國(guó)和歐洲， 中風(fēng)是成人致殘的主要原因，也是世界范圍內(nèi)的第二死因。在美國(guó)，每十五人中有超過(guò)一 人死于中風(fēng)，而且中風(fēng)在所有死因中排名第三，僅次于心臟病和癌癥（美國(guó)心臟協(xié)會(huì)，心臟 疾病與中風(fēng)統(tǒng)計(jì)資料_ 2009年更新版，美國(guó)德州達(dá)拉斯：美國(guó)心臟協(xié)會(huì)；2009 ;R〇sam〇nd 等，心臟疾病與中風(fēng)統(tǒng)計(jì)資料-2007年更新版：來(lái)自美國(guó)心臟協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)委員會(huì)和中風(fēng)統(tǒng)計(jì) 小組委員會(huì)的報(bào)告，Circulation，2007 ;115 :e69-el71)。每三次中風(fēng)就有一個(gè)致死結(jié)果 (.H聶tie.illl等，Risk factors of stroke incidence and mortality,A 12-year follow-up of the Oslo Study，Stroke，199324(10;1484-0)。65 歲以下的所有死亡中有約 6%和 65 歲以上的所有死亡中有10%是由于中風(fēng)（Donnan等，Stroke，Lancet，2008;317(9624): 1612-23)。因此統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)證明了對(duì)于許多中風(fēng)受害者來(lái)說(shuō)，嚴(yán)重致殘是不幸但卻太過(guò)頻繁 發(fā)生的結(jié)果。實(shí)際上，中風(fēng)是用于長(zhǎng)期成人護(hù)理的住院患者醫(yī)保理賠的第一原因。在美國(guó) 和其他主要工業(yè)國(guó)，與中風(fēng)治療和康復(fù)相關(guān)的總成本現(xiàn)已超過(guò)每年4500萬(wàn)美元，并且毫無(wú) 疑問(wèn)地持續(xù)促成醫(yī)保成本的總體增加。
[0006] 缺血性中風(fēng)是最常見(jiàn)的中風(fēng)形式，占所有中風(fēng)的超過(guò)80%。缺血性中風(fēng)由動(dòng)脈堵 塞引起，而動(dòng)脈堵塞通常是因?yàn)檠ㄐ纬苫蛘卟惶Ｒ?jiàn)地是因?yàn)樗ㄈ?。發(fā)作通常是突發(fā)性 的，并且通常接著發(fā)生局部神經(jīng)功能缺損。約20%的患者在數(shù)天內(nèi)死亡，特別是如果梗塞很 大的話(huà)。另外10%的患者在初次中風(fēng)的數(shù)周內(nèi)死亡。不幸地是，存活者通常嚴(yán)重致殘。取 決于受影響的腦部面積，癥狀包括單側(cè)面部或肢體虛弱和感覺(jué)障礙以和認(rèn)知和語(yǔ)言障礙。 受影響的腦部面積越大，越多的功能可能受損。一些功能改善可在數(shù)天內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)，并且 常見(jiàn)在數(shù)月期間進(jìn)一步恢復(fù)。然而，恢復(fù)的程度是不可預(yù)期的，并且通常是不完全的。根 據(jù)美國(guó)中風(fēng)協(xié)會(huì)，中風(fēng)存活者中有15%至30%的人永久致殘，20%的人在發(fā)作后需要三個(gè) 月的機(jī)構(gòu)護(hù)理（Harmsen 等，Long-term risk factors for stroke: twenty-eight years of follow-up of 7457 middle-aged men in G〇teb〇rg, Sweden, Stroke, 2006 ；37 (7)： 1663-7)〇
[0007]缺血性中風(fēng)導(dǎo)致核心病變（core lesion)和周?chē)陌氚祹В╬enumbra)，在核心病 變內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞在數(shù)分鐘內(nèi)缺氧而死亡，周?chē)陌氚祹Ы邮盏揭恍┭饕蚨邮盏揭恍┭?氣，但仍少于正常情況。在缺血半暗帶中，細(xì)胞死亡進(jìn)行得較為緩慢，一般在數(shù)小時(shí)內(nèi)死亡， 并且由多變性缺氧癥（variable anoxia)和缺血級(jí)聯(lián)反應(yīng)與所述核心病變內(nèi)釋放的谷氨酸 鹽產(chǎn)生的毒性物質(zhì)引起。因此目前的治療干預(yù)主要著重于緩和中風(fēng)半暗帶中的有害情況。
[0008] 然而，用于急性缺血性中風(fēng)的療法仍然有限。
[0009] 由于腦損傷的發(fā)生是流向腦部的血液減少的結(jié)果，目前的療法致力于通過(guò)溶解凝 塊（血栓溶解）或者通過(guò)機(jī)械性地除去凝塊（血栓切除術(shù)）來(lái)除去動(dòng)脈堵塞。血流恢復(fù)越 快，腦細(xì)胞死亡越少，可以避免永久性后遺癥的機(jī)會(huì)越大。
[0010] 目前，只有兩種療法在美國(guó)經(jīng)FDA批準(zhǔn)用于中風(fēng)：
[0011] ?重組組織纖溶酶原活化劑（rt-PA ;Genentech)，溶解動(dòng)脈凝塊的藥物；和
[0012] ?梅西恢復(fù)系統(tǒng)（Merci Retrieval System) (Concentric Medical Inc.)和 Penumbra系統(tǒng)（Penumbra Inc.)，機(jī)械性去除血栓的裝置。
[0013] 上述所有治療方法都具有主要限制。
[0014] 為求有效，使用溶栓劑的療法必須在癥狀發(fā)作的3到4. 5小時(shí)內(nèi)進(jìn)行，這表示僅有 約3%的患有急性缺血性中風(fēng)的患者接受有效的rt-PA治療。此外，溶栓療法具有實(shí)質(zhì)上增 加的腦出血風(fēng)險(xiǎn)，這進(jìn)一步限制了其在一些個(gè)體中的使用。
[0015] 基于上述理由，本領(lǐng)域中對(duì)于緩和和/或預(yù)防神經(jīng)變性，特別是由缺血引起的神 經(jīng)變性的安全且有效的療法存在尚未得到滿(mǎn)足而又迫切的需求。
[0016] 發(fā)明簡(jiǎn)沐
[0017] 因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種通過(guò)以下方法制備的異質(zhì)性骨髓（BM) 細(xì)胞亞群，該方法包括：
[0018] a)從未處理的骨髓獲得骨髓細(xì)胞群；
[0019] b)將骨髓細(xì)胞群以低密度接種在塑料表面上；
[0020] c)洗滌接種的細(xì)胞群以除去未附著的細(xì)胞；
[0021] d)在含血清的培養(yǎng)基中將附著的細(xì)胞群培養(yǎng)至接近匯合；
[0022] e)將培養(yǎng)的細(xì)胞群連續(xù)傳代不超過(guò)約七次連續(xù)傳代，其中，在每次傳代時(shí)，以低密 度接種培養(yǎng)的細(xì)胞；和
[0023] f)獲得異質(zhì)性骨髓細(xì)胞亞群，其中有效量的異質(zhì)性骨髓細(xì)胞亞群有效治療神經(jīng)變 性。
[0024] 在一個(gè)方面，有效量的異質(zhì)性骨髓細(xì)胞亞群有效治療由缺血引起的神經(jīng)變性。
[0025] 在一個(gè)方面，異質(zhì)性骨髓細(xì)胞亞群在含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0026] 在一個(gè)方面，骨髓細(xì)胞群以約102_106個(gè)細(xì)胞/cm 2的密度接種。
[0027]在一個(gè)方面，在傳代時(shí)，培養(yǎng)的細(xì)胞以約750個(gè)細(xì)胞/cm2或更小的密度接種。
[0028] 未處理的骨髓可以從沒(méi)有使用任何調(diào)控細(xì)胞分裂的試劑預(yù)治療的受試者獲得，所 述試劑例如是用于化療的抗腫瘤藥物，包括抗代謝藥物，如5-氟尿嘧啶。
[0029] 在一個(gè)方面，異質(zhì)性骨髓細(xì)胞亞群不能通過(guò)密度分離法如Fi coll?或Perco 11?梯 度或者通過(guò)ACK (銨-氯化物-鉀）裂解液來(lái)分離。
[0030] 在本發(fā)明的進(jìn)一步的方面，異質(zhì)性骨髓細(xì)胞亞群進(jìn)一步在由缺血引起的神經(jīng)變性 的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭袦y(cè)試，其中僅選擇顯示治療神經(jīng)變性的能力的那些細(xì)胞群。該由缺血引起的 神經(jīng)變性的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂梢允茄?葡萄糖剝奪（0GD)細(xì)胞培養(yǎng)模型或中風(fēng)動(dòng)物模型。在一個(gè) 方面，該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂梢允茄?葡萄糖剝奪（0GD)細(xì)胞培養(yǎng)模型和隨后的中風(fēng)動(dòng)物模型。
[0031] 在另一個(gè)方面，在注射至血流中后，異質(zhì)性亞群中的細(xì)胞迀移至神經(jīng)變性位置。
[0032] 在一個(gè)方面，由缺血引起的神經(jīng)變性是缺血性中風(fēng)。
[0033] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供一種治療由缺血引起的神經(jīng)變性的方法，包 括將上述異質(zhì)性骨髓細(xì)胞亞群注射至患有神經(jīng)變性的哺乳動(dòng)物的血流中，其中異質(zhì)性骨髓 細(xì)胞亞群的注射減少由神經(jīng)變性造成的神經(jīng)功能缺損。
[0034] 當(dāng)神經(jīng)變性由缺血性中風(fēng)引起時(shí)，該方法可還包括用于增加通過(guò)阻塞血管的血流 的附加治療，其中注射異質(zhì)性骨髓細(xì)胞亞群與附加治療的組合導(dǎo)致比單獨(dú)的附加治療或者 注射異質(zhì)性骨髓細(xì)胞亞群但不使用附加治療后的神經(jīng)功能缺損的更大減少。
[0035] 在一個(gè)方面，用于增加通過(guò)阻塞血管的血流的附加治療與注射異質(zhì)性骨髓細(xì)胞亞 群同時(shí)進(jìn)行。
[0036] 在另一個(gè)方面，在注射異質(zhì)性骨髓細(xì)胞亞群前，進(jìn)行用于增加通過(guò)阻塞血管的血 流的附加治療。
[0037] 當(dāng)神經(jīng)變性由缺血性中風(fēng)引起時(shí)，血管可以被血塊阻塞。血塊可以由動(dòng)脈粥樣硬 化斑塊的破裂產(chǎn)生。
[0038] 當(dāng)神經(jīng)變性由缺血性中風(fēng)引起時(shí)，用于增加通過(guò)阻塞血管的血流的附加治療可包 括施用溶栓劑。溶栓劑可以是鏈激酶、尿激酶和重組組織纖溶酶原活化劑中的至少一個(gè)。而 且，該重組組織纖溶酶原活化劑可以是阿替普酶、瑞替普酶、去氨普酶或替奈普酶。
[0039] 在另一個(gè)方面，當(dāng)神經(jīng)變性由缺血性中風(fēng)引起時(shí)，用于增加通過(guò)阻塞血管的血流 的附加治療可包括從阻塞血管機(jī)械性除去血塊。
[0040] 在進(jìn)一步的方面中，可以使用過(guò)濾器捕捉血塊。
[0041] 在另一個(gè)方面，當(dāng)神經(jīng)變性由缺血性中風(fēng)引起時(shí)，用于增加通過(guò)阻塞血管的血流 的附加治療可包括進(jìn)行血管成形術(shù)和/或血管支架手術(shù)。
[0042] 異質(zhì)性骨髓細(xì)胞亞群可以通過(guò)靜脈、動(dòng)脈（例如注射至頸動(dòng)脈中）或腦內(nèi)注射。
[0043] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供一種治療由缺血引起的神經(jīng)變性的方法，包 括將異質(zhì)性骨髓細(xì)胞亞群注射至患有由缺血引起的神經(jīng)變性的哺乳動(dòng)物的血流中，其中異 質(zhì)性骨髓細(xì)胞亞群的注射減少由缺血引起的梗塞的體積。
[0044] 當(dāng)神經(jīng)變性由缺血性中風(fēng)引起時(shí)，該方法可還包括用于增加通過(guò)阻塞血管的血流 的附加治療，其中注射異質(zhì)性骨髓細(xì)胞亞群與附加治療的組合導(dǎo)致比單獨(dú)的附加治療或者 注射異質(zhì)性骨髓細(xì)胞亞群但不使用附加治療后的梗塞體積的更大減少。
[0045] 在一個(gè)方面，當(dāng)神經(jīng)變性由缺血性中風(fēng)引起時(shí)，所述用于增加通過(guò)阻塞血管的血 流的附加治療包括施用溶栓劑。溶栓劑可以是鏈激酶、尿激酶和重組組織纖溶酶原活化劑 中的至少一個(gè)。而且，重組組織纖溶酶原活化劑可以是阿替普酶、瑞替普酶、去氨普酶或替 奈普酶。
[0046] 在另一個(gè)方面，當(dāng)神經(jīng)變性由缺血性中風(fēng)引起時(shí)，用于增加通過(guò)阻塞血管的血流 的附加治療可包括進(jìn)行血管成形術(shù)和/或支架手術(shù)。
[0047] 在另一個(gè)方面，當(dāng)神經(jīng)變性由缺血性中風(fēng)引起時(shí)，用于增加通過(guò)阻塞血管的