越南奇楠沉香組織培養(yǎng)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)的方法，具體涉及涉及一種越南奇楠沉香 crassfla Pierre.組織培養(yǎng)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 越南奇楠沉香（J識(shí)/iiaria crawfla Pierre.)是瑞香科沉香屬植物，天然分布于 越南、柬埔寨、老撾、泰國(guó)等海拔300~900m、年降雨量1200mm左右的丘陵、山地，是東南 亞國(guó)家生產(chǎn)高品質(zhì)沉香木和沉香油的主要樹(shù)種。由于過(guò)度砍伐，該樹(shù)種在許多天然林中已 涉Ii臨滅絕，《顏臨絕種野生動(dòng)植物國(guó)際貿(mào)易公約》（CITES，Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora)將越楠奇楠沉香列為及危品 種。在廣東部分區(qū)域有香農(nóng)從越南引種越南奇楠沉香進(jìn)行栽培，但種苗價(jià)格極高，一株奇楠 沉香樹(shù)苗價(jià)格高達(dá)10~20元不等。
[0003] 越南奇楠沉香需生長(zhǎng)6~8年開(kāi)始開(kāi)花，而優(yōu)良的種子必須采自樹(shù)齡15年以上的 母樹(shù)。奇楠沉香的種子壽命又極短，如果不經(jīng)過(guò)特別處理，只能儲(chǔ)存1周左右。即使在最佳 保存條件下(濕度為25%，溫度為8°C )保存一個(gè)月，發(fā)芽率也從41%降至22%。因此，越南奇 楠沉香人工種植所需要的種苗極其匱乏。
[0004] 種子繁殖只能繁殖常規(guī)苗木，不能繁殖無(wú)性系苗木。林木基因組雜合程度高，實(shí)生 苗造林分化大。越南奇楠沉香也不例外，采用實(shí)生苗造林，會(huì)存在分化大，結(jié)香率及結(jié)香品 質(zhì)參差不齊的問(wèn)題，影響了種植收益。越南奇楠沉香在自然條件下自然結(jié)香的比例是極低 的，必須要經(jīng)過(guò)人工誘導(dǎo)結(jié)香，才能保證有較高的結(jié)香率，但如果采用種子苗進(jìn)行人工誘導(dǎo) 結(jié)香，由于個(gè)體間遺傳差異大，同樣的方法所誘導(dǎo)的結(jié)香效果不一樣，導(dǎo)致沉香的產(chǎn)量極不 穩(wěn)定，嚴(yán)重影響了香農(nóng)種植的積極性。
[0005] 要想人工栽培的越南奇楠沉香有高品質(zhì)和穩(wěn)定的結(jié)香率，必須通過(guò)組培快繁技術(shù) 走越南奇楠沉香無(wú)性系化的道路。用無(wú)性系苗進(jìn)行人工誘導(dǎo)結(jié)香，才能獲得最好最穩(wěn)定的 人工誘導(dǎo)結(jié)香技術(shù)，才能獲得得香率高而均一、品質(zhì)優(yōu)良的沉香，才能產(chǎn)生高效的經(jīng)營(yíng)效 率。
[0006] 越南奇楠沉香是從越南引進(jìn)的珍貴樹(shù)種，種質(zhì)資源極其匱乏，少量已有的人工栽 培奇楠沉香樹(shù)由于來(lái)自種子苗，得香率也不穩(wěn)定，如果奇楠沉香的種植不解決組培快繁的 技術(shù)問(wèn)題，不走無(wú)性系化的道路，將難以做到經(jīng)營(yíng)的集約化，生產(chǎn)的高效性，也無(wú)法滿足市 場(chǎng)對(duì)越南奇楠沉香種苗的大量需求。也將嚴(yán)重制約奇楠沉香無(wú)性系育種、良種的中試和良 種的推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種越南奇楠沉香crasMa Pierre.組織培養(yǎng) 的方法。
[0008] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種越南奇楠沉香crasma Pierre.組織培養(yǎng)的方法，包括以下步驟： 1) 外植體的消毒：將越南奇楠沉香種子進(jìn)行消毒處理； 2) 叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：將上步消毒后的種胚接種至叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每培養(yǎng)28~32天 后將種胚轉(zhuǎn)接至新的叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接3~4次，奇楠沉香種胚即可被誘導(dǎo)出多個(gè)叢 芽； 3) 增殖培養(yǎng)：將上步誘導(dǎo)出叢芽的越南奇楠沉香組培苗接種到繼代增殖培養(yǎng)基中，每 培養(yǎng)28~32天將奇楠沉香增殖苗轉(zhuǎn)接至新的繼代增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)； 4) 生根培養(yǎng)：將增殖培養(yǎng)中高度達(dá)2cm以上的單芽切下接種至生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 15~20天，當(dāng)至少70%的增殖苗開(kāi)始生根后進(jìn)入煉苗階段； 5) 煉苗：將上步獲得的奇楠沉香生根芽苗在光強(qiáng)3000~6000 Lx、溫度26~30°C條 件下煉苗10~20天； 6) 移植及苗期管理：將煉苗后的苗木移植到土壤中，進(jìn)行田間栽培管理。
[0009] 進(jìn)一步的，步驟1)中所述種子消毒處理具體方法為：將越南奇楠沉香種子用無(wú)菌 水清洗干凈后，用〇. 8~I. 2g/L升汞消毒28~32min，再用無(wú)菌水清洗干凈。
[0010] 進(jìn)一步的，步驟2)中所述叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含有0. 58~0. 62mg/L6-BA和0. 08~ 0· 12 mg/L IBA 的 MS 培養(yǎng)基。
[0011] 進(jìn)一步的，步驟2)、步驟3)和步驟4)的培養(yǎng)條件均為：溫度24~26°C、光照8~ IOh · d \ 光照強(qiáng)度 2500 ~3500Lx。
[0012] 進(jìn)一步的，步驟3)中所述增殖培養(yǎng)基為含有0· 18~0· 22mg/L 6-BA和0· 08~ 0· 12 mg/LIBA 的 MS 培養(yǎng)基。
[0013] 進(jìn)一步的，步驟4)中所述生根培養(yǎng)基為含有0. 08~0. 12mg/L NAA的MS培養(yǎng) 基，并且其中大量元素的含量為正常MS的0. 24~0. 26倍，微量元素的含量為正常MS的 0· 45 ~0· 55 倍。
[0014] 進(jìn)一步的，步驟6)中所述的土壤含有68~72%黃泥和28~32%泥炭土基質(zhì)。
[0015] 進(jìn)一步的，步驟6)中所述田間栽培管理的具體方法為：移植后先在遮陽(yáng)率為90~ 95%，相對(duì)濕度為85%~90%，溫度為25~33°C的條件下培養(yǎng)12~14天；然后將苗木置于 遮陽(yáng)率為75%~80%，濕度為75%~80%，溫度為25~33°C的條件下培養(yǎng)13~15天；最后 將苗木置于遮陽(yáng)率為40~60%的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)苗木高度多25cm后，將其完全在自然 環(huán)境條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0016] 進(jìn)一步的，步驟6)中移植的時(shí)間為3~6月或9~11月。
[0017] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明建立了一種能夠獲得大量越南奇楠沉香無(wú)性系苗木的組織培養(yǎng)方法，其中，本 發(fā)明通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)越南奇楠沉香叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有0. 58~0. 62mg/L6-BA和0. 08~ 0· 12 mg/L IBA、增殖培養(yǎng)基含有 0· 18 ~0· 22mg/L 6-BA 和 0· 08 ~0· 12 mg/LIBA，生根培 養(yǎng)基含有〇. 08~0. 12mg/L NAA，且生根培養(yǎng)基的大量元素的含量為正常MS的0. 24~0. 26 倍，微量元素的含量為正常MS的0. 45~0. 55倍，才能確保越南奇楠沉香無(wú)性系苗木的高 產(chǎn)率，生長(zhǎng)快，且苗木健壯。
[0018] 本發(fā)明方法獲得越南奇楠沉香無(wú)性系苗木的產(chǎn)率高，時(shí)間快，且所獲得的苗木健 壯，這些苗木一是可以解決種植行業(yè)越南奇楠沉香苗木缺乏的問(wèn)題；二是用越楠奇楠沉香 的無(wú)性系苗進(jìn)行人工誘導(dǎo)結(jié)香，能探索出最好最穩(wěn)定的人工誘導(dǎo)結(jié)香技術(shù)，容易得到得香 率高而均一、品質(zhì)優(yōu)良的沉香，能產(chǎn)生高效的經(jīng)營(yíng)效率；三是將推進(jìn)越南奇楠沉香無(wú)性系育 種、良種的中試和良種的推廣。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為大量元素的含量（以MS為單位）對(duì)越南奇楠沉香如?/iJaria crasma Pierre.生根率的影響； 圖2為微量元素的含量（以MS為單位）對(duì)越南奇楠沉香J識(shí)/iJaria Pierre. 生根率的影響； 圖3為NAA的濃度（mg/L)對(duì)越南奇楠沉香crassfla Pierre.生根率的影 響。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。
[0021] 實(shí)施例1 本實(shí)施從越南引進(jìn)少量的越南奇楠沉香crasma Pierre.優(yōu)樹(shù)種子，經(jīng)過(guò) 組織培養(yǎng)繁殖，獲得了 20個(gè)無(wú)性系，并繁殖組培瓶苗苗木5萬(wàn)株供熱帶林業(yè)研究所森林培 育與技術(shù)研究首席專家組營(yíng)造無(wú)性系示范林。具體操作步驟如下： 1)外植體的消毒 將越南奇楠沉香種子用無(wú)菌水清洗2次，然后用lg/L升汞消毒30分鐘，再用無(wú)菌水清 洗干凈，其洗4次，前3次每次5分鐘，最后一次10分鐘，即可。
[0022] 2)叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 將600粒消過(guò)毒的種胚接種至叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含有0. 6mg/L 6-BA和0.1 mg/L IBA的MS培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25± 1°C、光照8~ IOh · d \光照強(qiáng)度2500~35001x，培養(yǎng)30天后，獲430個(gè)無(wú)污染的種胚，消毒成功率為 71. 7% ;將無(wú)菌種胚再轉(zhuǎn)接到新叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，30天后獲得170個(gè)萌發(fā)種胚；將萌發(fā)種 胚接種到新叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30天后再轉(zhuǎn)接至新叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，再培養(yǎng)30天后 獲得113顆誘導(dǎo)出正常叢芽的奇楠沉香苗，叢芽誘導(dǎo)率為66. 5%。
[0023] 即在叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中，將消毒后的種胚每培養(yǎng)28~32天后轉(zhuǎn)接至新的叢芽 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接3~4次后，奇楠沉香種胚即可被誘導(dǎo)出多個(gè)叢芽。
[0024] 3)增殖培養(yǎng) 將上步誘導(dǎo)出叢芽的奇楠沉香苗接種到繼代增殖培養(yǎng)基上，每培養(yǎng)28~32天將種胚 轉(zhuǎn)接至新的繼代增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；增殖轉(zhuǎn)接時(shí)以3~4個(gè)叢芽為1叢，每200mL培 養(yǎng)瓶接種3~4叢。
[0025] 為了研究激素濃度及種類對(duì)越南沉香增殖苗的影響，對(duì)增殖培養(yǎng)基中的激素濃度 及