一種適用于單粒子微束裝置的秀麗小桿線蟲固定方法
【專利說明】
[0001]技術(shù)領域:
本發(fā)明涉及一種秀麗小桿線蟲的固定方法，具體地說提供了一種適用于單粒子微束裝置定點輻射線蟲不同身體組織的蟲體麻醉方法，屬于輻射生物學技術(shù)領域。
[0002]【背景技術(shù)】:
輻射生物學是研宄電離輻射與細胞、組織及生物體相互作用的學科。傳統(tǒng)的輻射生物學認為輻射損傷僅發(fā)生在直接受輻射的細胞、組織或機體中，而輻射旁效應的出現(xiàn)則打破了這一傳統(tǒng)觀點，并為廣大的研宄者所重視，隨之出現(xiàn)了許多用于輻射旁效應研宄的實驗裝置、實驗模型和實驗方法。單粒子微束裝置由于其能精確對一定區(qū)域內(nèi)的機體組織、單個細胞甚至細胞內(nèi)的特定亞細胞結(jié)構(gòu)實現(xiàn)定點、定量輻射而廣泛應用于輻射旁效應的研宄中，同時輻射旁效應的實驗模型亦由最初的離體細胞培養(yǎng)體系、離體組織研宄體系發(fā)展到了如今的個體實驗模型。秀麗小桿線蟲已被廣泛應用于輻射生物學研宄的各個領域，因其蟲體透明，身體組織器官在活體狀態(tài)下清晰可辨，且其成蟲體長約I毫米，與旁效應損傷信號轉(zhuǎn)導的有效距離非常相符，從而成為研宄輻射旁效應過程及機理的有力活體動物模型。
[0003]但將秀麗小桿線蟲應用于輻射旁效應的研宄卻存在著幾個方面的問題，首先，線蟲在活體狀態(tài)下其身體不停地運動，在線蟲這種運動狀態(tài)下無法進行單粒子微束裝置的定點、定量輻射，這就需要研發(fā)可行的線蟲活體狀態(tài)下的固定方法；其次，線蟲個體微小，離開線蟲培養(yǎng)基僅能存活幾秒鐘，而單粒子微束輻射在液體存在條件下由于液體分子的阻力，無法精確計算到達線蟲個體組織的輻射劑量，因此，如何在輻射過程中在無液體或極少液體存在的條件下保持線蟲的存活狀態(tài)亦成為其中的一個難題；再者，線蟲經(jīng)過固定和單粒子微束輻射雙重處理的作用下，如何有效地恢復線蟲的活力也是線蟲用于輻射旁效應研宄的一個難題。中國專利申請?zhí)枮?01110065496.7，申請日為2011年03月18日，發(fā)明創(chuàng)造名稱為:基于微閥的秀麗隱桿線蟲長期培養(yǎng)及雙檢測微流控芯片，該申請案利用PDMS聚合物，采用PDMS軟刻蝕及不可逆封接技術(shù)構(gòu)建了線蟲微流控芯片，雖然可以將此微流控芯片通過適當?shù)恼{(diào)整應用于單粒子微束輻射研宄中，但由于單粒子微束輻射研宄中要求線蟲身體基本處于不動的狀態(tài)，因而芯片容納線蟲的通路尺寸很難控制，且易發(fā)生堵塞，增加實驗的難度。中國專利申請?zhí)枮?01210189484.X，申請日為2012年06月08日，發(fā)明創(chuàng)造名稱為:用于線蟲培養(yǎng)和/或觀察的微流芯片和設備及其應用，所述的微流芯片雖然也可用于單粒子微束輻射研宄中，但仍存在著上述專利相同的問題。中國專利申請?zhí)枮?01110242704.6，申請日為2011年08月23日，發(fā)明創(chuàng)造名稱為:一種動物麻醉劑的復方拮抗劑及其應用，以及中國專利號為ZL 96226348.6，授權(quán)公告日為1997年10月29日，實用新型名稱為:大白鼠乙醚麻醉器，這兩個專利均是通過麻醉的方法固定實驗動物模型，雖然其中的麻醉劑配方、用量以及麻醉裝置并不適宜于線蟲的麻醉處理，但卻為我們尋找線蟲的活體固定方法開拓了思路。
[0004]基于上述理論基礎，結(jié)合秀麗小桿線蟲自身的特點以及單粒子微束裝置所需的實驗條件，通過反復的嘗試和實驗驗證，本發(fā)明創(chuàng)造了一種適用于單粒子微束裝置的秀麗小桿線蟲固定方法。該發(fā)明借助市售的5毫升離心管，通過簡單的操作，自制了簡易的線蟲固定裝置，并利用揮發(fā)性的乙醇和乙醚混合麻醉劑固定線蟲，且在線蟲固定的過程中使用2%的Agar A凝膠片進行線蟲的保濕，有效提高了線蟲的恢復率和蟲體成像的清晰度。本發(fā)明充分滿足了利用秀麗小桿線蟲為活體動物模型開展單粒子微束輻射研宄的需求，并為秀麗小桿線蟲在輻射生物學領域的研宄提供新的固定方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中以秀麗小桿線蟲為活體動物模型，利用單粒子微束輻射裝置開展輻射旁效應研宄中關(guān)于線蟲的固定問題，提供了一種適用于單粒子微束裝置的秀麗小桿線蟲固定方法。通過自制的簡易線蟲固定裝置，利用揮發(fā)性的乙醇和乙醚混合麻醉劑，并使用2%的Agar A凝膠片進行蟲體的保濕，解決了單粒子微束輻射過程中線蟲固定難、固定狀態(tài)持續(xù)時間短、輻射實驗后蟲子活力恢復慢、恢復率低等現(xiàn)存問題，有效提高了單粒子微束輻射線蟲組織器官實驗的精確性和準確性。
[0006]技術(shù)方案
為解決以秀麗小桿線蟲為活體動物模型，利用單粒子微束輻射裝置開展輻射旁效應研宄中關(guān)于線蟲的固定的難題，本發(fā)明的技術(shù)步驟具體為:
步驟一、秀麗小桿線蟲的培養(yǎng)過程
將秀麗小桿線蟲進行同步化處理，獲得發(fā)育一致的LI期幼蟲。將同步化的LI期幼蟲接種于NGM線蟲固體培養(yǎng)基上，于20攝氏度恒溫條件下持續(xù)培養(yǎng)至實驗所需的時期。
[0007]步驟二、簡易線蟲固定裝置的自制過程
取一 5毫升離心管，在其管蓋(管蓋A)內(nèi)面覆三層Mylar膜，再將管蓋蓋緊，獲得良好的密封效果；將該離心管從中間部位切斷，丟棄管底部分，保留上部1.8厘米的高度，并修平切口，形成一端密封的圓柱形小管；然后剪取另一 5毫升離心管管蓋(管蓋B)作為該圓形小管另一端的密封蓋，完成線蟲固定裝置的自制過程。
[0008]步驟三、線蟲保濕的凝膠片制備過程
稱取2克Agar A分散于100毫升已滅菌的去離子水，利用微波加熱使得Agar A完全溶解，配成2%的Agar A溶液；立即吸取2.5毫升2%的Agar A溶液均勻平鋪于60毫米的塑料培養(yǎng)皿底部，待Agar A溶液自然凝固后，封口膜密封放置12小時備用；實驗時，用滅菌后的手術(shù)刀將整塊凝膠分割成邊長約0.6厘米凝膠片，完成線蟲保濕的凝膠片制備過程。
[0009]步驟四、線蟲的固定過程
首先在自制簡易線蟲固定裝置覆蓋Mylar膜一端的底部放入小拇指大小的脫脂棉球，備用；使用滅菌后的手術(shù)刀片挑一凝膠片于管蓋B內(nèi)，為了獲得平滑的表面，凝膠片接觸培養(yǎng)皿的一面朝上；吸取0.6微升的M9緩沖液于凝膠片中心，在解剖鏡下使用鉑金絲挑蟲針從NGM培養(yǎng)基上挑取線蟲20條于M9緩沖液中；吸取60微升揮發(fā)性的乙醇和乙醚混合麻醉劑于自制簡易線蟲固定裝置底部的脫脂棉球上，并將其倒扣于管蓋B上，形成一個密閉空間；2.0-3.5分鐘后取下管蓋B，解剖鏡下觀察管蓋B內(nèi)凝膠片上的線蟲是否已被麻醉。
[0010]步驟五、單粒子束輻射樣品的準備過程
使用已滅菌處理的手術(shù)刀片挑起管蓋B內(nèi)的凝膠片，倒扣于事先準備好的輻射板中心的Mylar膜上，完成單粒子束輻射樣品的準備過程。
[0011]步驟六、輻射結(jié)束后線蟲的恢復和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)過程
在輻射盤中間Mylar膜上凝膠片放置的位置滴加約0.5毫升的M9緩沖液，使得M9緩沖液將凝膠片完全包裹；再將凝膠片挑離Mylar膜，使所有的蟲體與M9緩沖液直接接觸；放置10-15分鐘，待蟲子全部復蘇后，使用10微升的移液槍將所有的蟲子轉(zhuǎn)移至NGM培養(yǎng)基上，待下一步的檢測。
[0012]有益效果
本發(fā)明所表述的實驗方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下特點:
本發(fā)明所表述的一種適用于單粒子微束裝置的秀麗小桿線蟲固定方法，利用市面上現(xiàn)有的5毫升離心管為材料，通過簡單的實驗室操作，自制了簡易的簡易線蟲固定裝置。該裝置制作成本低，僅用了兩個5毫升的離心管，制作過程簡單、便利、耗時短，解決了現(xiàn)有技術(shù)裝備成本高、制作過程復雜等問題；
本發(fā)明所表述的一種適用于單粒子微束裝置的秀麗小桿線蟲固定方法，使用揮發(fā)性的乙醇和乙醚混合麻醉劑，線蟲在自制簡易的線蟲固定裝置中密封2-3.5分鐘即可實現(xiàn)蟲體的完成麻醉，且麻醉狀態(tài)時間可持續(xù)可達10-15分鐘，滿足單粒子微束同時進行20條蟲子的輻射所需的時間，且該線蟲的固定過程簡單，固定快，易操作；
本發(fā)明所表述的一種適用于單粒子微束裝置的秀麗小桿線蟲固定方法，在線蟲的固定、輻照過程中均采用2%的Agar A凝膠片進行蟲體的保濕，有效解決了線蟲離開培養(yǎng)后由于水分快速蒸發(fā)造成蟲子的死亡，同時有效提高了線蟲長時間麻醉固定以及輻射處理后蟲子的恢復率；
本發(fā)明所表述的一種適用于單粒子微束裝置的秀麗小桿線蟲固定方法，蟲體保濕所用的2% Agar A凝膠片透光率好，使得蟲體成像清晰，蟲體內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰易辨，有利于單粒子微束輻射的精確定位，減少實驗誤差，大大提高了實驗的準確性和精確性。
【附圖說明】
[0013]圖1為適用于單粒子微束裝置的秀麗小桿線蟲固定方法的示意圖；
圖2為自制簡易線蟲固定裝置實物圖；
圖3為輻射后線蟲復蘇實物圖；
圖4為實施例1和2中線蟲不同組織輻射定位圖。
【具體實施方式】
[0014]為進一步解釋本發(fā)明的內(nèi)容，一下結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體步驟做詳細描述。
[0015]實施例1: L1/L2期幼蟲陰門組織的單粒子微束輻射處理
本實施例表述的是以L1/L2期幼蟲為實驗模型，利用自制的簡易線蟲固定裝置，使用揮發(fā)性的乙醇和乙醚混合劑麻醉固定后，對線蟲的陰門組織進行單粒子微束的輻射處理，其詳細的步驟描述如下。
[0016]步驟一、秀麗小桿線蟲的培養(yǎng)
將秀麗小桿線蟲進行同步化處理(同步化試劑:5 mo I/L NaOH和NaC1)，將蟲卵置于3毫升的M9緩沖液中于20攝氏度恒溫條件下孵育24小時。解剖鏡下觀察線蟲的卵，待有95%以上卵孵化為L