一種抑制八角蓮?fù)庵搀w污染和褐變的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抑制外植體污染和褐變的方法，尤其涉及一種抑制八角蓮?fù)庵搀w污染和褐變的組織培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]藥用植物八角蓮隸屬于小檗科鬼臼屬多年生草本，是依托泊苷和替尼泊苷等抗癌藥物合成前體-鬼白毒素的傳統(tǒng)主要植物來源之一。由于過度采挖、生境破壞和植物自身生長緩慢等原因，八角蓮野生資源幾近枯竭，物種瀕危，目前已被列為國家珍稀瀕危三級保護(hù)植物。因此，通過采用藥用植物組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)來獲得八角蓮愈傷組織或無菌苗，既可緩解八角蓮的資源壓力，也可以為工業(yè)生產(chǎn)提供可利用的無菌材料。
[0003]藥用植物組織培養(yǎng)的最大優(yōu)點在于短期內(nèi)能用較少的材料繁殖大量優(yōu)質(zhì)種苗，具有用材少、周期短、速度快和不受季節(jié)限制等特點。因此，利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速育苗已成為許多藥用植物商品化育苗的重要途徑。
[0004]有關(guān)八角蓮的組培快繁技術(shù)的研宄報道較少，其主要問題是八角蓮的組織培養(yǎng)過程中易產(chǎn)生嚴(yán)重的細(xì)菌污染，污染率達(dá)100% ;同時，由于八角蓮含有大量的酚類物質(zhì)，非常容易產(chǎn)生褐變現(xiàn)象；切割后的莖、葉組織從表面向培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì)，此時培養(yǎng)基逐漸變成褐色，外植體也逐漸變褐而死亡，不能存活。
[0005]褐變是植物組織培養(yǎng)過程中經(jīng)常遇到的問題，如解決方法不當(dāng)，往往會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。關(guān)于褐變機(jī)理的研宄表明，植物細(xì)胞中含有較多的酚類化合物，可在多酚氧化酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)轷愇镔|(zhì)，在外植體受傷部位積累，并向其它組織和培養(yǎng)基中擴(kuò)散，破壞正常的代謝過程，使植體生長受到抑制甚至死亡。近來年的研宄表明，多酚氧化酶是一種含銅的蛋白質(zhì)，其氧化活性依賴于銅的氧化還原作用。金屬螯合劑如EDTA作為抑制劑，可以把Cu2+從酶中螯合出來，形成穩(wěn)定的螯合物，使多酚氧化酶失去活性，從而達(dá)到抑制褐變的作用。
[0006]因此，為了建立高效的八角蓮組培快繁技術(shù)體系，首要解決八角蓮?fù)庵搀w的污染和褐變冋題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。
[0008]本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
[0009]一種抑制八角蓮?fù)庵搀w污染和褐變的方法，包括以下步驟:
[0010](I)選取5年生以上的野生八角蓮根莖作為母株，將母株移栽到干凈的河沙基質(zhì)上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)I個月至長出新的莖和葉；
[0011](2)采取步驟⑴生長健壯、無病蟲害的莖段或幼嫩葉片，先放置于N-長鏈硫代羧酸型甜菜堿中浸泡5min，再用蒸餾水沖洗I小時，沖洗過程中用軟毛刷洗刷所述外植體表面污垢；
[0012](3)將步驟⑵處理后的外植體利用負(fù)離子光觸媒處理10-15min，再用濃度為
2.5%的次氯酸鈉滅菌4.5min-7min,并用無菌水沖洗3次，每次沖洗時間為2min，再用無菌濾紙吸干所述外植體表面的水分，將材料切割成IcmX Icm的方塊或Icm長的莖段；
[0013](4)采用濃度為0.1 % -1 %的重金屬絡(luò)合劑浸泡步驟(3)切好的莖段或方塊I小時；
[0014](5)將步驟(4)處理后的材料接種于MS改良培養(yǎng)基，pH值調(diào)節(jié)為5.8，在250C ±1°C的溫度下，1.5個大氣壓的條件下暗培養(yǎng)2周；
[0015](6)將步驟(5)處理后的外植體轉(zhuǎn)到光照強(qiáng)度為1000-2000Lux，光照時間為1h/d，溫度為25°C ±1°C的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。
[0016]優(yōu)選地，步驟(I)中所述河沙的濕度為65% -85%。
[0017]優(yōu)選地，步驟(3)中所述負(fù)離子光觸媒是由T12和壓電晶體電氣石的納米級粉體制成的中性液體。
[0018]優(yōu)選地，步驟(3)中利用負(fù)離子光觸媒處理所述外植體的步驟為將外植體放置于涂有負(fù)離子光觸媒的罐體中10_15min，在罐體內(nèi)通入氮?dú)夂统粞踬|(zhì)量比為10: I的混合氣體，負(fù)離子光觸媒受外界光線激發(fā)而產(chǎn)生大量具有殺菌作用的氫氧基等離子，從而對外植體進(jìn)行殺菌處理。
[0019]優(yōu)選地，所述的重金屬絡(luò)合劑為植酸和二乙烯三胺五甲叉膦酸按質(zhì)量比1: 3混合的溶液。
[0020]優(yōu)選地，步驟(4)中利用重金屬絡(luò)合劑處理外植體的步驟為將外植體放置于10-15°C的濃度為0.1 % -1 %的重金屬絡(luò)合劑中，每15分鐘更換一次重金屬絡(luò)合劑，遮光培養(yǎng)I小時。
[0021]優(yōu)選地，步驟(5)中所述MS改良培養(yǎng)基的成分包括不含有銅離子的MS培養(yǎng)基、2mg/L水解酪蛋白、2mg/L活性炭、0.02mg/L生物素和0.8mg/L藤酸。
[0022]優(yōu)選地，步驟(6)中采用紅色LED光與藍(lán)色LED光比例為4: I的混合光照明。
[0023]本發(fā)明提供了一種抑制八角蓮?fù)庵搀w污染和褐變的方法。本發(fā)明的優(yōu)點是:
[0024]第一、本發(fā)明選用五年生以上的八角蓮植株，是提供優(yōu)質(zhì)外植體、減少培養(yǎng)過程中褐化現(xiàn)象的基礎(chǔ)，相比3年生的八角蓮，五年生以上的八角蓮植株的根莖更大，所形成的外植體也更強(qiáng)壯。
[0025]第二、本發(fā)明選用N-長鏈硫代羧酸型甜菜堿浸泡，N-長鏈硫代羧酸型甜菜堿具有良好的抗菌性，可以抑制革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌以及部分真菌的生長繁殖，同時N-長鏈硫代羧酸型甜菜堿表面活性高，刺激性很低，濕潤性能十分出色，可以有效清除污垢，不會對外植體造成損害，且安全無殘留。
[0026]第三、本發(fā)明對外植體采用負(fù)離子光觸媒處理外植體，負(fù)離子光觸媒在光的照射下，會產(chǎn)生類似光合作用的光催化反應(yīng)，產(chǎn)生出氧化能力極強(qiáng)的自由氫氧基和活性氧，具有很強(qiáng)的光氧化還原功能，可氧化分解各種有機(jī)化合物和部分無機(jī)物，能破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜和固化病毒的蛋白質(zhì)，可殺滅細(xì)菌和分解有機(jī)污染物，把有機(jī)污染物分解成無污染的水和二氧化碳，具有極強(qiáng)的殺菌、防污自潔的功能，在常溫、常壓條件下實現(xiàn)快速、高效地殺菌，不會損傷外植體，且安全環(huán)保。
[0027]第四、本發(fā)明采用由植酸和二乙烯三胺五甲叉膦酸按質(zhì)量比1: 3混合的溶液浸泡外植體，由于植酸中含多個磷酸基團(tuán)，植酸的絡(luò)合要比EDTA更廣范和穩(wěn)定；二氨基乙烷四乙酸鈉螯合力比EDTA類、磷酸鹽類等都要強(qiáng)，絡(luò)合容量高，絡(luò)合穩(wěn)定常數(shù)大，金屬離子等被絡(luò)合后不容易解離，而且耐化學(xué)穩(wěn)定性好，無毒且易生物降解，無公害污染。因此通過添加植酸和二氨基乙烷四乙酸鈉，將Cu2+從多酚氧化酶中螯合出來，形成穩(wěn)定的螯合物，使多酚氧化酶失去活性，從而達(dá)到抑制褐變的作用。
[0028]第五、本發(fā)明在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加水解酪蛋白、活性炭、生物素和菸酸，水解絡(luò)蛋白是一種有機(jī)附加物質(zhì)，其對八角蓮植物細(xì)胞的生長發(fā)育具有促進(jìn)作用，且有助于抑制外植體愈傷組織誘導(dǎo)過程中褐化的形成；活性碳作為一種吸附劑使用，可吸附微量物質(zhì)和微小顆粒，對于防止外植體褐化有積極的作用；生物素是植物生長發(fā)育中相當(dāng)重要的營養(yǎng)物質(zhì)，它參與植物的多種新陳代謝活動，有助于培育優(yōu)質(zhì)的八角蓮幼苗。
[0029]第六、本發(fā)明中步驟(6)中采用紅色LED光與藍(lán)色LED光比例為4: I的混合光照明，LED具有體積小、重量輕、固態(tài)、壽命長、波長特殊、驅(qū)動電壓較低、光效率尚、能耗小、安全、可靠耐用、不容易色衰的優(yōu)點，當(dāng)紅藍(lán)光比例為4: I時，八角蓮?fù)庵搀w的誘導(dǎo)率最高。
[0030]第七、本發(fā)明得到的無菌外植體，經(jīng)過誘導(dǎo)單芽增殖系數(shù)達(dá)3.5倍以上，通過進(jìn)一步擴(kuò)繁、壯苗和生根培養(yǎng)，組培苗生根率達(dá)85%以上，移栽基質(zhì)后成活率在90%以上。本發(fā)明提供的八角蓮的組織培養(yǎng)方法能夠快速繁殖出大量適合移栽的優(yōu)良八角蓮種苗，滿足生產(chǎn)上的需要。
【具體實施方式】
[0031]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施。
[0032]實施例1:
[0033]一種抑制八角蓮?fù)庵搀w污染和褐變的方法，包括以下步驟:
[0034](I)選取5年生以上的野生八角蓮根莖作為母株，將母株移栽到濕度為65%的河沙基質(zhì)上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)I個月至長出新的莖和葉；
[0035](2)采取步驟(I)生長健壯、無病蟲害的莖段或幼嫩葉片，先放置于N-長鏈硫代羧酸型甜菜堿中浸泡5min，再用蒸餾水沖洗I小時，沖洗過程中用軟毛刷洗刷所述外植體表面污垢；
[0036](3)將步驟⑵處理后的外植體放置于涂有T12和壓電晶體電氣石的納米級粉體制成的中性涂層的罐體中l(wèi)Omin，并在罐體內(nèi)通入氮?dú)夂统粞踬|(zhì)量比為10: I的混合氣體，再用濃度為2.5%的次氯酸鈉滅菌4.5min，并用無菌水沖洗3次，每次沖洗時間為2min，再用無菌濾紙吸干所述外植體表面的水分，將材料切割成IcmX Icm的方塊或Icm長的莖段；