專利名稱：棉花植株的轉化的制作方法
技術領域：
本申請涉及植物遺傳學領域，特別是涉及棉花的轉化。
背景技術：
棉花是具有巨大商業(yè)價值的植物。除了棉花纖維在生產紡織品中的應用，棉花的其它用途包括用棉籽油制備食品和從棉花粗粉和種子外殼衍生動物飼料。
盡管棉花具有作物的重要性，但是由于沒有能夠從棉花外植體快速或高頻率地再生有器官的組織，例如整個植株或幼芽的可靠的組織培養(yǎng)方法，棉花的育種和遺傳工程進展速度非常緩慢。當育種者能夠以從非常高比例的外植體快速產生整個植株或其部分的方式在組織培養(yǎng)中生長植物細胞，則可以更容易和快速地獲得改善的作物。
從外植體再生整個植株包括幾個生長階段。通常，將已經從成年植株或正在繁殖的幼苗切下的組織外植體，在無菌條件下置于化學定義的培養(yǎng)基。通過在所述受控條件下生長外植體一段時間，可以形成稱作為愈傷組織即初級愈傷組織的未分化的細胞群。
通過在合適的條件下例如營養(yǎng)液，光照，溫度，濕度培養(yǎng)該初級愈傷組織，和通過提供合適結合和濃度的植物生長調節(jié)劑，已經將一些植物種類的愈傷組織進行誘導產生了胚發(fā)生愈傷組織，依次可以以已知用于形成胚胎的方法誘導形成體細胞胚胎。
體細胞胚胎是有器官的組織群，它類似于種子的胚。通過體細胞胚胎發(fā)生形成的胚和種子中的胚兩者都具有發(fā)育為整個植株的能力。由體細胞胚胎發(fā)生形成的胚是二極性的，在根和幼苗頂點含有分生組織。因此，通過體細胞胚胎的繁殖，獲得小植株。
植物組織培養(yǎng)文獻描述了用于產生棉花愈傷組織的幾種技術，包括胚發(fā)生的和非胚發(fā)生的，并且從棉花愈傷組織產生胚組織。通常這些早期的實驗使用了來自于棉花幼苗下胚軸和子葉的外植體，并且逐級轉移到含有愈傷組織起始培養(yǎng)基的平板上。
現存的棉花體細胞胚胎發(fā)生技術有幾種缺點。在外植體中出現胚胎發(fā)生的頻率通常是低的。另外，該技術僅在非常有限量的棉花栽培品種中有效。此外，用于棉花體細胞胚胎發(fā)生的大多數現存的技術在體細胞胚胎發(fā)生之前，需要較長的生長時期，即通常高于4個月。
若能夠直接和急速地從置于愈傷組織起始培養(yǎng)基上的棉花外植體誘導胚胎發(fā)生(和從而啟動形成整個植株的過程)，則可產生幾個優(yōu)點。這些優(yōu)點包括降低借助于克隆繁殖再生植株所需的時間，這允許通過體細胞克隆變異快速產生遺傳的多樣性，允許生產沒有病原體的原種，和使稀有的或難于再生的棉花品種進行繁殖。
相關文獻Price和Smith(1983)在植物細胞培養(yǎng)手冊，第487-510頁提供了用于獲得棉花愈傷組織的技術的綜述。
Davidonis和Hamilton，在植物科學信函(1983)，3289-93中報道了棉花的體細胞胚胎發(fā)生。在愈傷組織于含有萘乙酸(NAA)和細胞分裂素的培養(yǎng)基上生長2年以后發(fā)育形成胚。外植體來自于陸地棉的子葉。
美國專利4,672,035描述了從陸地棉愈傷組織再生棉花的方法，所述愈傷組織首先在含有萘乙酸(NAA)和細胞分裂素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，隨后轉移到沒有NAA和細胞分裂素的第二種培養(yǎng)基上。
Shoemaker等人，在植物細胞報道，(1986)3178-181描述了由來源于陸地棉的幼苗下胚軸外植體的愈傷組織進行棉花體細胞胚胎發(fā)生，所述外植體在含有NAA和細胞分裂素，和腺嘌呤的培養(yǎng)基上生長。
Firoozabady等人，在植物分子生物學，(1987)10105-116描述了由根癌農桿菌進行的陸地棉幼苗子葉的轉化。從來源于轉化的子葉的愈傷組織獲得了體細胞的胚胎發(fā)生。
美國專利5,004,863和5,159,135描述了通過與根癌農桿菌在含有激素，植物生長激素和細胞激動素的培養(yǎng)基上共培養(yǎng)而轉化陸地棉幼苗下胚軸的方法。
Trolinder和Goodin，在植物細胞報道，(1987)6231-234描述了在從幼苗下胚軸啟動的愈傷組織誘導體細胞胚胎發(fā)生。所使用的生長培養(yǎng)基含有植物生長激素和細胞激動素。
Trolinder和Goodin，植物細胞，組織和器官培養(yǎng)(1988)1231-42描述了由來源于從成熟的陸地棉產生的種子的整個胚胎軸制備的外植體的愈傷組織進行的體細胞胚胎發(fā)生。所使用的培養(yǎng)基含有植物生長激素和細胞激動素。
Finer在植物細胞報道，(1988)7399-402描述了從愈傷組織懸浮液培養(yǎng)物生產胚，其中愈傷組織已經由陸地棉的幼苗子葉衍生。愈傷組織培養(yǎng)物是在含有合成植物生長激素的培養(yǎng)基中建立的。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了借助于從連續(xù)地保持于培育培養(yǎng)基上的外植體的體細胞胚胎發(fā)生而再生棉花植株的原理，所述培育培養(yǎng)基不含有生長調節(jié)激素。當具有棉花組織的外植體的培育培養(yǎng)基中含有激素時，如在現有技術中使用的，棉花的體細胞胚胎發(fā)生受到抑制或阻止，未分化的初級愈傷組織形成。
通過在沒有激素的培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)，并且與在含有激素的培養(yǎng)基上的培養(yǎng)不同，可以更快速地生產胚，并且獲得更高百分數的體細胞胚(每個外植體)。另外，本發(fā)明不僅能用在Coker類型的棉花栽培品種中，而且能在由Coker類型遺傳的栽培品種中應用。本發(fā)明也能夠用現存的方法不能再生的其它(非Coker)栽培品種進行體細胞胚胎發(fā)生，所述現存的方法包括在置于激素的條件下起始愈傷組織的形成。
在沒有激素的組織培育培養(yǎng)基上的體細胞胚胎發(fā)生可以提供幾個其它的優(yōu)點，包括從Coker，Coker衍生的栽培品種更有效地生產轉基因植物，以及從更大量的棉花栽培品種生產轉基因植物。在一個優(yōu)選的實施方案中，對由傳統技術難于再生的棉花栽培品種進行誘導以在沒有激素的培養(yǎng)基上產生體細胞胚胎。本發(fā)明提供了Stoneville 84-828品種的可再生的棉花株。
本發(fā)明也提供了可以將難于用傳統方法再生的組織進行誘導以產生體細胞胚胎的原理。在一個優(yōu)選的實施方案中，能夠用葉組織產生胚發(fā)生愈傷組織和體細胞胚胎。
本發(fā)明的另一個優(yōu)點是降低了勞動成本。勞動成本的降低來源于生產轉基因棉花所需的時間框架降低，從而降低了在組織培養(yǎng)中生產轉基因棉花的栽培品種的開發(fā)成本。
本發(fā)明還有的優(yōu)點是以更加簡單的方法用于篩選可再生的棉花栽培品種，不需要在起始之后多次轉移組織。根據本發(fā)明方法可在12星期或不到12星期獲得最終結果。在利用有激素的培養(yǎng)基的以前的方案中，這樣的篩選至少需要將初級愈傷組織向再生條件進行一次另外的轉移，完成篩選需要長達24個星期。相對再生性指示了用何種棉花栽培品種可以有效地產生轉基因植物，以及需要多少外植體以獲得靶數量的再生的轉基因植物。
通過利用沒有激素的培育以獲得難操作(recalcitrant)的栽培品種的胚發(fā)生組織，然后借助于轟擊轉化胚發(fā)生組織，本發(fā)明提供了另一種轉化手段以生產難操作栽培品種的轉化的植株。以前由于其它栽培品種不能在標準方案(農桿菌的轉化，隨后在含有激素的選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)轉基因組織，在含有激素或具有類似于激素的作用的物質(例如羧芐青霉素)的培養(yǎng)基上再生植株)的條件下再生，僅Coker，類似于Coker的栽培品種，和以前再生(R1S1)的栽培品種系已經被有效地轉化。
在由本發(fā)明方法再生之前，可以實現轉化?？梢岳脦追N植物細胞轉化技術，包括與根癌農桿菌共培養(yǎng)，微粒轟擊等等。對于共培養(yǎng)的情況，優(yōu)選的是制備沒有植物激素的共培養(yǎng)培養(yǎng)基。
附圖簡述


圖1圖解描述了現有技術的利用激素的再生方法，和獲得本發(fā)明的體細胞胚胎發(fā)生的沒有激素的方法。
圖2顯示了含有激素的愈傷組織起始培養(yǎng)基的接觸時間對棉花再生的作用的資料。
特定實施方案的描述本發(fā)明的主要特征是利用沒有激素的培養(yǎng)基以從轉化的棉花外植體直接產生胚發(fā)生愈傷組織。棉花的定義是屬于棉屬的植物品種，包括種間和栽培品種間雜交。
所提供的組織培養(yǎng)技術是唯一已知可用于從棉花外植體產生胚發(fā)生愈傷組織和體細胞胚胎的技術，所述棉花外植體在沒有應用外源植物生長調節(jié)劑或激素例如植物生長激素和細胞激動素的條件下進行培養(yǎng)。盡管已知現有技術中的方法可以從胚發(fā)生組織產生體細胞胚，但以前認為必需在含有激素的初級培養(yǎng)基上首先培養(yǎng)外植體組織以誘導未分化的愈傷組織的形成并且在一段時間之后在一系列初級或次級培養(yǎng)基上轉移該愈傷組織，并且培養(yǎng)足夠長的時間以便出現胚發(fā)生愈傷組織，之后將未分化的愈傷組織或胚發(fā)生愈傷組織轉移到次級培養(yǎng)基，所述次級培養(yǎng)基不含有激素以促使形成體細胞胚。利用借助于體細胞胚胎發(fā)生的現有技術的方法不能使除Coker(和由Coker遺傳的栽培品種)以外的棉花栽培品種再生。
圖1提供了從棉花獲得體細胞胚胎的已知方法與本發(fā)明的沒有激素的方法的比較結果，所述已知方法特異地使用激素以獲得棉花的體細胞胚胎發(fā)生。在所述新的方法中，利用頭孢噻肟而不是利用羧芐青霉素，因為羧芐青霉素顯示某些類似于細胞激動素的作用。
發(fā)現沒有激素的體細胞胚胎發(fā)生的優(yōu)點之一是與用于愈傷組織形成的已知方法相比降低了用于繁殖植株的時間，采用所述已知方法，在非胚胎發(fā)生或未分化的初級愈傷組織的形成期間，需要在含有激素的培養(yǎng)基上進行基本生長時期。本發(fā)明提供了用于從外植體快速誘導次級胚發(fā)生愈傷組織，降低或去除非胚發(fā)生愈傷組織的形成的方法。通過快速誘導胚發(fā)生愈傷組織，避免了在初級培養(yǎng)基轉移非胚發(fā)生愈傷組織階段的勞動，因為不需要誘導和保持大量的未分化的愈傷組織而等待胚發(fā)生愈傷組織的出現。
另一個優(yōu)點是從相對高百分數的外植體產生胚發(fā)生愈傷組織，和更快速形成胚發(fā)生愈傷組織。目前公開的體細胞胚胎發(fā)生方法可以用于各種各樣的棉花栽培品種，包括至今不適應誘導體細胞胚胎發(fā)生計劃的栽培品種。
沒有激素的培養(yǎng)基更易進行胚胎發(fā)生，其中用傳統手段再生率非常低或不可能再生的某些品種的再生目前是可能的。因此，本發(fā)明的系統將某些品種加入到能夠被轉化和再生為植株的棉花名單中。用于本發(fā)明的外植體可以從除Coker，類似于Coker的栽培品種以外的棉花栽培品種衍生獲得。
已經從一種難操作的品種，Stoneville 84-828品種獲得了體細胞胚胎，表明該方法也可以應用到各種各樣棉花栽培品種，包括難操作的栽培品種。難操作的棉花栽培品種是指至今不能進行體細胞胚胎發(fā)生的品種，即除了Coker類型品種以外的栽培品種。
由于能夠轉化除Coker類型以外的栽培品種，通過降低繁殖得到的轉化植物成所需的品種所必要的回交次數，可以降低用于研制有商用價值的轉基因棉花的勞動和時間。由于在擴大的栽培品種范圍內(包括非Coker栽培品種)能獲得體細胞胚胎發(fā)生，優(yōu)選的是將‘R1S1’(再生一次，自交一次)方案用于轉化難操作的栽培品種。R1S1方案需要更廣范圍內的可再生性，和更高的再生頻率，以便對于給定的栽培品種可以獲得許多自交的再生的植株的后代。體細胞胚胎發(fā)生的增加能夠從以前具有抑制性的低再生頻率的栽培品種獲得轉基因植物。
無激素再生的可操作特性也指現在可利用通常不用于再生的棉花植株組織產生體細胞胚胎。葉組織是至今沒有被用于體細胞胚胎再生的棉花組織的一個例子。因此該方法適用于許多種棉花組織的外植體，包括下胚軸，葉，根，柄組織和棉花胚。外植體組織通常是在無菌條件下被切下以避免將細菌或真菌導入到植物培育培養(yǎng)基。
在優(yōu)選的實施例中，從展平的葉或幼苗下胚軸組織獲得用于本發(fā)明的外植體。用作為外植體的其它的優(yōu)選的組織包括任何棉花植株組織，包括分生組織細胞，例如根組織的和葉柄組織的切片。下胚軸，葉和根組織含有維管系統形成層的分生組織細胞。
對于葉和下胚軸組織，已經觀察到愈傷組織的形成顯示主要在維管的形成層位點發(fā)生。也觀察到在沒有激素的培養(yǎng)基上再生愈傷組織趨向于主要在下胚軸組織的一個末端形成，在下胚軸切片的基部末端(朝向根)形成80％-90％的愈傷組織。
對于去除頂端分生組織，過夜，然后切除外植體的試驗，幾乎沒有或完全沒有觀察到再生。另一方面，當將頂端分生組織保留于下胚軸外植體時，外植體具有在切割末端，而不是在胚發(fā)生愈傷組織形成根的趨勢。因此，優(yōu)選的是將用于在沒有激素的培養(yǎng)基上胚發(fā)生愈傷組織形成的下胚軸外植體去掉頂端分生組織區(qū)域。
由于植株的頂端分生組織產生吲哚乙酸(IAA)，也稱作為植物生長激素，并且IAA在植株中向下遷移，對于在沒有激素的培養(yǎng)基上棉花植株的胚胎發(fā)生可能是外源性IAA起作用。植株在黑暗中比在光照下也產生更多的IAA。對于在切割下胚軸外植體之前，將幼苗在黑暗和在光照條件下生長的試驗，從生長于光照條件下植株獲得的那些外植體以更低的頻率再生體細胞胚胎。在優(yōu)選的實施方案中，切下外植體之前在黑暗中培養(yǎng)棉花植株或幼苗并且保持一段時間。
在從棉花植株切下外植體之后，將外植體轉移到固體植物組織培育培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基適用于形成胚發(fā)生愈傷組織。通?？梢允褂糜糜谥参锝M織培養(yǎng)的許多基礎鹽/微量元素溶液用于培養(yǎng)來源于未成熟棉花胚胎的外植體。以前已經證明支持棉花愈傷組織生長的基礎鹽溶液是優(yōu)選的?？色@得的文獻，例如D.Evans，R.Sharp，P.Ammirato，和Y.Yamata，植物細胞培養(yǎng)手冊(六卷系列)Macmillian出版公司第1卷(1983)，第2卷(1984)，第3卷(1984)，第4卷(1986)；McGraw Hill出版公司，第5卷(1990)和第6卷(1990)；和T.Thorpe，植物組織培養(yǎng)方法和在農業(yè)上的應用，Academic出版公司(1981)，公開了適用于棉花愈傷組織體外生長的基礎鹽和微量元素溶液。優(yōu)選的基礎鹽/微量元素溶液包括Murashige和Skoog培養(yǎng)基，Linsmaier和Skoog培養(yǎng)基，Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基，和Beasley和Ting培養(yǎng)基。用作為基礎鹽溶液的特別優(yōu)選的是TRM培養(yǎng)基，即具有雙倍硝酸鉀濃度的Murashige和Skoog培養(yǎng)基。
轉移外植體用的組織培育培養(yǎng)基不含有任何植物生長調節(jié)劑。本發(fā)明實質上不同于用于棉花體細胞胚胎發(fā)生的早期的技術，所述技術在培育培養(yǎng)基中沒有所述的生長調節(jié)劑。以前已經證明的用于獲得棉花體細胞胚胎發(fā)生的技術要求在生長培養(yǎng)基中包含激素，特別是細胞激動素和植物生長激素。用于本發(fā)明的培養(yǎng)基不需要使用激素，不論是天然的或合成的。通過將沒有激素的培養(yǎng)基用作為初級培養(yǎng)基，與將激素例如IAA(IAA)，激動素或2，4D摻入到該培養(yǎng)基中相比，更快速地形成胚發(fā)生愈傷組織。
在現有技術中，通常將細胞激動素例如6-苯基氨基嘌呤(BAP)，2-異戊基腺嘌呤(2-ip)，激動素，2-ip核糖核苷和玉米素用于摻入到該培養(yǎng)基中。通常特異于棉花組織培育培養(yǎng)基的植物生長激素包括合成的和天然的植物生長激素，例如IAA，NAA，2，4D等等。
用于從外植體產生胚發(fā)生愈傷組織的培育培養(yǎng)基含有膠凝劑以使培養(yǎng)基固化。通常用于植物組織培養(yǎng)的膠凝劑可用于本發(fā)明使用的培育培養(yǎng)基。優(yōu)選的膠凝劑包括瓊脂替代物例如PhytagelTM(Sigma)，和GelRite(麥克公司)。
在最優(yōu)選的實施方案中，將GelRite(Scott Laboratories公司)用作為再生培養(yǎng)基中的固化物質，而不是使用瓊脂。在許多現有技術的再生方法中，需在含有激素的培養(yǎng)基上將未分化的愈傷組織生長一段時間，以從外植體成功地生長初級愈傷組織，這部分是由于認為外植體組織的受傷應答產生一定量的抑制胚胎發(fā)生的苯酚類化合物。當使用GelRite時，觀察到在外植體的切口末端的棕色褪去，表明苯酚類化合物降低。
用各種各樣的核酸遺傳構建體轉化本發(fā)明的外植體，所述核酸遺傳構建體用于從遺傳上修飾植物細胞。有用的轉化技術包括例如用根癌農桿菌共培養(yǎng)，微粒轟擊和碳化硅纖維介導的轉化。轉化方式對本發(fā)明不是關鍵的。
用于轉化的DNA序列通常含有融合到調節(jié)序列(啟動子)上的所需核酸序列，所述調節(jié)序列能夠在植物細胞中轉錄或轉錄和轉譯。用于轉錄和轉譯(表達)的序列通常編碼所需的多肽，所需多肽可以是天然狀態(tài)下不存在于棉花細胞的多肽或天然存在于棉花細胞的多肽。當編碼天然存在于棉花中的多肽的序列存在于所需的構建體時，與所述序列相連的啟動子可以是天然情況下不與所需基因連接的啟動子。所需的多肽包括儲存蛋白，介導除草劑抗性的或色素產生的酶，殺蟲劑蛋白，哺乳動物調節(jié)蛋白，植物調節(jié)蛋白和細胞壁蛋白質。通過加入合適的信號序列，也可以將表達的多肽進行修飾以便將其導向到細胞器例如葉綠體和線粒體。所需的序列也可以包括編碼反義RNA的核酸序列，反義RNA的應用包括降低基因的表達和使病原體感染減毒。
所需的啟動子可以是組成型的或誘導型的，啟動子以在整個植物中或以組織特異性的方式表達。
另外，優(yōu)選的是用于轉化的遺傳構建體含有能夠在轉化的靶細胞和其后代中表達的選擇性標記物，選擇性標記物允許含有具有選擇性標記物的構建體的細胞在抑制失去選擇性標記物的細胞生長和復制的條件下生長并發(fā)生分裂。已知有各種各樣的選擇性標記物在植物細胞中起作用，這些標記物可以用于轉化棉花細胞。所需的遺傳標記物包括對G418，卡那霉素，溴苯腈，潮霉素，氨甲喋呤，慶大霉素(慶大霉素甲基轉移酶)，甘草膦(EPSP合成酶)，和chlorsulfuron的抗性。本領域內技術人員應該明白，在某些情況下所需的多肽也能夠作為選擇性標記物的起作用。所需的DNA序列也含有與使用的特定轉化技術相關的載體和/或允許載體或其部分在轉化的細胞內保持穩(wěn)定的核苷酸序列。
通過將根癌農桿菌和陸地棉子葉共培養(yǎng)而轉化棉花的技術已經由Firoozabady等人，植物分子生物學(1987)10105-116和Umbeck等人，Bio/Technology(1987)5263-266描述。由Firoozabady等人，和Umbeck等人描述的轉化技術可以與本發(fā)明的未成熟胚外植體一起使用。
當通過根癌農桿菌共培養(yǎng)導入遺傳構建體時，優(yōu)選的是所需的DNA序列含有T-DNA序列，優(yōu)選的是去除延伸端的T-DNA序列，以促進該載體整合到棉花基因組。特別是，優(yōu)選的是使用至少一個右T-DNA邊界區(qū)和優(yōu)選的是右和左T-DNA邊界區(qū)。
通過用由所需的遺傳構建體包被的微粒轟擊也可以轉化棉花外植體，通?？梢詮奈墨I獲得關于由微粒轟擊轉化植物細胞的詳細描述，例如Klein等人，自然學(1988)32770-73。通過使用基本上相同的用于轉化其它植物細胞的轟擊技術，可以轉化選定用于本發(fā)明再生的棉花外植體細胞。
根據其形狀可以快速地將胚發(fā)生愈傷組織與非胚發(fā)生愈傷組織即初級愈傷組織區(qū)分。胚發(fā)生愈傷組織通常是小的，乳黃色和分化為胚或原胚結構，而初級愈傷組織主要是綠色或白色的和沒有分化的大的液泡化細胞。
可以從初級愈傷組織上切下生長出的胚發(fā)生愈傷組織，隨后通過使用本領域內技術人員通常已知的組織培養(yǎng)技術，在固體組織培養(yǎng)或在懸浮組織培養(yǎng)一段更長的時間進行繁殖。當需要時，可將胚轉化即萌發(fā)，并形成整個植株。
為了再生整個植株，從胚發(fā)生愈傷組織可以切下體細胞胚，并且隨后轉移到組織生長培育培養(yǎng)基，采用本領域內技術人員已知的方法，所述培養(yǎng)基的配制有助于形成根。如果需要，隨后將形成根的幼芽轉移到土壤中生長。
當在再生之前用含有選擇性標記物的轉化構建體轉化外植體時，在存在于遺傳構建體的標記物的選擇性壓力下，或不在選擇性壓力下將外植體于培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在某些情況下所需的序列能夠用作為選擇性標記物。選擇性壓力是指將培養(yǎng)物中的細胞與有助于表達選擇性標記物的細胞生長和/或生存的通常是化學藥劑的環(huán)境因子接觸。選擇性壓力的水平可以隨從外植體產生胚的過程期間的不同階段而變化。例如，可以在轉化之后立即將含有新霉素磷酸轉移酶的載體轉化的外植體置于含有5-75毫克/毫升卡那霉素的低水平選擇培養(yǎng)基，并且隨后在胚發(fā)生愈傷組織芽已經形成之后，轉移到含有75-200毫克/毫升卡那霉素的高水平選擇培養(yǎng)基。
通過改變應用于組織培養(yǎng)的選擇性壓力的時間和水平，能夠控制獲得的愈傷組織中存在的轉化細胞的比例。通常，在組織培養(yǎng)過程越早應用選擇性壓力，應用的選擇性壓力越大，愈傷組織中存在的轉化細胞的百分率越大?？梢栽谥参锷L的一個或多個階段應用選擇性壓力。
當將適用于胚發(fā)生愈傷組織的發(fā)育的外植體在形成胚發(fā)生愈傷組織的條件下生長時，優(yōu)選的是選擇性壓力是連續(xù)的，另一種可選的方法是，一旦細胞已經被轉化，也可以在胚發(fā)生愈傷組織已經形成之前或之后應用選擇性壓力。當將胚發(fā)生愈傷組織轉移到新鮮培養(yǎng)基時可以應用選擇性壓力。類似地，也可以在將胚轉移到胚胎脈沖培養(yǎng)基或萌發(fā)培養(yǎng)基之后應用選擇性壓力。當體細胞胚胎生根時，和在胚胎已經形成整個植株之后也可以應用選擇性壓力。
當進行本發(fā)明共培養(yǎng)時，將外植體置于“飼養(yǎng)平板”也不是必要的。喂養(yǎng)平板是含有具有細胞激動素的起始培養(yǎng)基和一層煙草飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)皿。對于本發(fā)明，簡單地將無菌濾紙Whatman#1置于愈傷組織起始培養(yǎng)基的表面即可，所述濾紙的功能在于保持農桿菌的生長處于最小程度。
已經描述了本發(fā)明，提供下面的實施例是為了進一步闡明本發(fā)明，不是為了限制本發(fā)明。實施例1外植體的制備通過置于50％Clorox(2.5％次氯酸鈉溶液)中20分鐘，在無菌蒸餾水中清洗3次對Coker315種子表面消毒。在表面滅菌之后，將種子在含有25毫升1/2×MS鹽1/2×B5維生素1.5％葡萄糖0.3％GelRite的25×150無菌試管中萌發(fā)。在28℃，將幼苗萌發(fā)7天。從8天齡的幼苗切除下胚軸，切成0.5-0.7厘米的切片，置于含有無激素愈傷組織起始培養(yǎng)基(CIM)的培養(yǎng)皿平板上的無菌濾紙上。表1中提供了CIM的成份。
表1濃度化合物 來源1× Murashige和Skoog鹽 Gibco30克/升 葡萄糖Mallinckrodt100毫克/升肌醇 Sigma1毫克/升 煙酸 Sigma1毫克/升 鹽酸吡哆醇Sigma10毫克/升 鹽酸硫胺素J.T.Baker1.87克/升 氯化鎂Sigma1.90克/升 硝酸鉀Sigma4克/升GelRite Scott Lab.公司含有激素的培養(yǎng)基(‘CIM-3’)與上表提供的相同，只是它含有下列水平的激素0.45μM 2，4D和0.46μM細胞激動素。實驗2在沒有激素的培養(yǎng)基上胚胎發(fā)生如實施例1所述制備外植體組織并且在28+2℃，30uE 16小時8小時光照黑暗時期培養(yǎng)。各種外植體培養(yǎng)于沒有激素的培養(yǎng)基上，或通過在起始階段于CIM-3上培養(yǎng)，隨后轉移到沒有激素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)結合進行。
在5，7和9個星期時，鑒別胚發(fā)生愈傷組織。圖2描述了與在含有激素的培養(yǎng)基(CIM-3)接觸任意長時間的情況比較，在沒有激素的培養(yǎng)基(‘0’)上連續(xù)培養(yǎng)之后，胚胎發(fā)生的百分率得到提高。
除了在9星期時再生(胚發(fā)生愈傷組織)百分率增加外，胚發(fā)生愈傷組織形成的速度也提高直到在5個星期時第一次觀察為止，連續(xù)地在沒有激素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的10％(10/100)的外植體已經形成了胚發(fā)生愈傷組織，而這時與含有激素的培養(yǎng)基接觸任意長時間的外植體沒有形成胚發(fā)生愈傷組織。在9個星期之后，連續(xù)地與含有激素的培養(yǎng)基接觸的外植體僅2.5％(3/116)已經發(fā)育為胚發(fā)生愈傷組織，而連續(xù)地在沒有激素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的外植體有46％(46/100)發(fā)育了胚發(fā)生愈傷組織。實驗3從Stoneville 506回收胚發(fā)生愈傷組織Stoneville 506是難操作的栽培品種，在含有激素的條件下它幾乎不進行體細胞的胚胎發(fā)生。但是，在沒有激素的培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)14個星期之后，從ST506的53個下胚軸外植體回收到2個胚發(fā)生愈傷組織集落(各個外植體來源于不同的幼苗)。從該難操作栽培品種回收胚發(fā)生愈傷組織是基于沒有激素的培養(yǎng)方式，其由下列事實闡明在低至1天，高達14個星期時，在已經與含有激素的培養(yǎng)基接觸的420個外植體中沒有觀察到胚發(fā)生愈傷組織。實驗4再生的栽培品種的擴展對8個棉花栽培品種進行再生性篩選。在24個月時，與連續(xù)地在含有激素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)形成的愈傷組織相比，能夠在含有激素的培養(yǎng)基上進行體細胞胚胎發(fā)生的栽培品種C130，C320和Georgia King在沒有激素的培養(yǎng)基上具有相對的再生性，以形成的E-愈傷組織的百分數表示為71％，81％和58％。在從含有激素的培養(yǎng)基上轉移到沒有激素的培養(yǎng)基上6個星期之后，培養(yǎng)物中出現最低的再生性。在給定的培養(yǎng)方式和栽培品種內，從不同的幼苗獲得各個外植體。
結果顯示于表2。以E-愈傷組織/外植體的數量(％)表示結果。
表2連續(xù)的激素 激素起始， 連續(xù)無激素轉移到沒有激素栽培品種C130 38/90(42％)22/120(18％)36/120(30％)C320 25/90(28％)23/120(19％)27/120(23％)GA King13/91(14％)7/118(5.9％)10/120(8.3％)9358 2/88(2.3％)1/119(0.8％)3/120(2.5％)84-828 0/91 0/115 2/120(1.7％)KC311 0/89 0/119 0/119ST132 0/90 0/120 0/120LA887 0/90 0/120 0/115在4個星期之后，以該方式產生的外植體轉移到相同組分的新鮮培養(yǎng)基上一次，此時從每個平板4個集落減少到每個平板2個集落。
稱之為“激素啟動，轉移到沒有激素”的方式包括在MS鹽，3％葡萄糖，0.45μM 2，4D和0.46μM細胞激動素上培養(yǎng)6個星期，隨后在余下的時間內在經過加入1.9克/升硝酸鉀，3％葡萄糖和沒有激素修飾的MS鹽上培養(yǎng)。集落是從“連續(xù)的激素”方式獲得的愈傷組織的繼代培養(yǎng)物，在起始的6星期之后以每個平板2個的量進行接種。
稱之為“連續(xù)無激素”的方式包括加入1.9克/升硝酸鉀，3％葡萄糖和沒有激素修飾的MS鹽。該方式的外植體以每個平板4個集落的量保留于起始培養(yǎng)基上，從不轉移到新鮮培養(yǎng)基上。
這些結果證明了在沒有激素的培養(yǎng)基上再生難操作棉花品種的能力得以增加。84-828栽培品種僅在連續(xù)的沒有激素的方式時形成胚發(fā)生愈傷組織。實驗5降低的再生時間通過在沒有激素的培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)降低了從起始直到E-愈傷組織形成所經過的時間。表3提供了在12個星期時在含有激素的培養(yǎng)基上獲取的資料的匯總。
表3連續(xù)的激素 激素(6個星期)， 連續(xù)無激素然后沒有激素栽培品種Coker 3201/903/12018/120Coker 1304/907/12033/120Georgia King 0/913/1208/1209358 0/900/1202/12084-828 0/900/1201/120所有在說明書中提到的出版物和專利申請是為了顯示本發(fā)明相關的本領域技術人員的水平。如果單個出版物或專利申請被特定和單個地說明作為參考文獻，那么本文中引入的所有出版物和專利申請以相同的程度作為參考。實驗6胚胎發(fā)生的增加表4總結了來源于兩個獨立的試驗的證據，通過不與外源性激素接觸的方式培養(yǎng)改善了轉化的棉花組織的胚發(fā)生愈傷組織的再生。
表4
在上述表中，方案“有激素”包括在具有0.45μM 2，4D和0.46μM細胞激動素的愈傷組織起始培養(yǎng)基上培養(yǎng)外植體6-10個星期。方案“沒有激素”是指在不含激素的再生培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)外植體。兩個方案均使用了借助于根癌農桿菌共培養(yǎng)進行的轉化和在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上的選擇。
雖然已經借助說明書和為了闡明目的的實施例對前面的發(fā)明進行了詳細的描述，但是對其進行改變和修飾仍在所附的權利要求書的范圍內是顯而易見的。
權利要求
1.用于從外植體組織再生棉花植株的方法，改進之處在于從棉花組織外植體產生胚發(fā)生愈傷組織，所述的外植體不是在補加了外源性植物激素的棉花起始培養(yǎng)基上培養(yǎng)的。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述外植體組織選自下胚軸，葉，根，葉柄組織和棉花胚。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述的外植體組織是從已經在黑暗中生長的幼苗切下的下胚軸組織。
4.根據權利要求1所述的方法，其中在不含激素的培養(yǎng)基上再生之前，將所述的外植體組織與農桿菌共培養(yǎng)。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述農桿菌包含所需的DNA序列。
6.根據權利要求4所述的方法，其中所述DNA序列包括一個選擇性標記物。
7.根據權利要求1所述的方法，其中所述外植體組織是通過用包被了所需的DNA序列的顆粒轟擊所述外植體轉化的。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所需的DNA序列包含一個選擇性標記物。
9.根據權利要求1所述的方法，其中所述外植體包括葉組織。
10.根據權利要求1所述的方法，其中進一步包括培養(yǎng)所述胚發(fā)生愈傷組織以形成體細胞胚。
11.根據權利要求1所述的方法，其中所述外植體包括根組織。
12.用于轉化棉花植株的方法，所述方法包括下列步驟切下棉花組織以形成外植體，將所述棉花外植體組織與含有所需DNA序列的農桿菌一起共培養(yǎng)，和在包括選擇性試劑和沒有外源性植物激素的棉花起始培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述的經過共培養(yǎng)的外植體，在所述的沒有激素的選擇性培養(yǎng)基上誘導轉化的細胞以產生胚發(fā)生愈傷組織。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述外植體組織選自下胚軸，葉，根和葉柄組織和棉花胚。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述的下胚軸組織是從已經在黑暗中生長過夜的幼苗切下的下胚軸組織。
15.根據權利要求12所述的方法，其中所需的DNA序列包含一個選擇性標記物，它允許所述的轉化的胚發(fā)生愈傷組織細胞在所述的沒有激素的選擇性培養(yǎng)基上生長。
16.根據權利要求12所述的方法，進一步包括下列步驟在所述的選擇性試劑存在下培養(yǎng)所述的胚發(fā)生愈傷組織以形成轉化的體細胞胚。
全文摘要
提供了從外植體組織再生棉花植株的方法。使用該改善的方法可以從棉花組織外植體再生胚發(fā)生愈傷組織,其中外植體沒有在含有外源植物激素的棉花起始培養(yǎng)基上培養(yǎng)。通過切割棉花組織以形成外植體,將棉花外植體組織與包括所需DNA序列的農桿菌共培養(yǎng),并且在含有選擇劑但是沒有外源性植物激素的棉花起始培養(yǎng)基上培養(yǎng)該共培養(yǎng)的外植體,可將該方法用于棉花植株的轉化。在該方式中,在沒有激素的選擇性培養(yǎng)基上將轉化的細胞進行誘導以產生胚發(fā)生愈傷組織。
文檔編號A01H4/00GK1198655SQ96197409
公開日1998年11月11日 申請日期1996年10月4日 優(yōu)先權日1995年10月4日
發(fā)明者史蒂文·G·斯特里克蘭 申請人:卡爾金公司