專利名稱：生物頻譜在動物胚胎工程和動物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及生物頻譜在動物胚胎工程中的應(yīng)用。
近年來，有關(guān)動物胚胎工程的基礎(chǔ)研究和技術(shù)開發(fā)取得了驚人的進(jìn)展，胚胎工程研究不僅停留在研究室階段，而以極快的速度向?qū)嵱没?、產(chǎn)業(yè)化方面邁進(jìn)和普及。動物胚胎工程主要包括胚胎體外生產(chǎn)、胚胎冷凍保存和胚胎顯微操作等技術(shù)。
胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展可以充分利用優(yōu)良動物的遺傳資源，加快遺傳改良；克服某些珍稀動物的不孕癥，保存稀有動物或?yàn)l危動物資源；為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物及進(jìn)行動物性別鑒定提供動物胚胎資源。然而，目前胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)的效率很低，另外，體外生產(chǎn)的胚胎質(zhì)量比體內(nèi)的差，胚胎移植妊娠率也較低。
動物胚胎冷凍保存技術(shù)是動物胚胎移植技術(shù)能否應(yīng)用于生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)，該技術(shù)的應(yīng)用可以建立胚胎種質(zhì)庫，便于國際間動物品種資源的運(yùn)輸和交流。目前國際上通用的方法有常規(guī)汽凍(慢速控制降溫)和玻璃化冷凍(快速降溫)兩種方法。但是，體外生產(chǎn)的胚胎經(jīng)冷凍后解凍，存活率降低，約65％，移植后妊娠率比正常鮮胚胎移植降低至少20％。
動物胚胎顯微操作技術(shù)包括性別鑒定，以獲得期望性別的動物后代；動物胚胎克隆，包括胚胎切割及核移植技術(shù)，以生產(chǎn)來自同一優(yōu)秀動物的大量相同的后代(克隆動物)，大大提高繁殖率，加速動物遺傳改良；轉(zhuǎn)基因技術(shù)，主要指顯微注射技術(shù)及精子載體技術(shù)，目的在于促進(jìn)動物生長，增強(qiáng)動物抗病性，提高動物產(chǎn)品質(zhì)量，或?yàn)槿祟愄峁┐罅康恼滟F藥品(依轉(zhuǎn)移的基因不同而異)。由于動物胚胎顯微操作技術(shù)必然會損傷動物胚胎，因此，其成功率都很低。
本發(fā)明基于如下認(rèn)識由于種種原因，人們很少研究應(yīng)用物理方法調(diào)節(jié)影響動物的繁殖生長功能，也很少應(yīng)用物理方法到胚胎工程中解決技術(shù)難題。發(fā)明人認(rèn)為一切生命物質(zhì)都同時具有化學(xué)特性和物理特性。生命物質(zhì)本身就具有特征的物理特性(如細(xì)胞的電荷，機(jī)體的生物場，……)。當(dāng)外界的電磁場與生命物質(zhì)中的某些主要物理特性相似時，生命物質(zhì)中的帶電荷物質(zhì)就會與外界電磁場相互作用，將可能使細(xì)胞內(nèi)分子、原子、電子同時受到影響而產(chǎn)生明顯的生物效應(yīng)。以離體組織和細(xì)胞為例，組織和細(xì)胞在體內(nèi)受到化學(xué)環(huán)境和物理環(huán)境的支持，生長發(fā)育正常。當(dāng)組織或細(xì)胞離體后，盡管竭力采用各種化學(xué)性質(zhì)的保護(hù)劑和營養(yǎng)成份來改善培養(yǎng)環(huán)境，但是，離體組織或細(xì)胞的生長發(fā)育仍然明顯比體內(nèi)生長發(fā)育時差。發(fā)明人進(jìn)一步認(rèn)為在離體組織、細(xì)胞培養(yǎng)中，施加一個模擬生物頻譜的弱電磁場將改善離體組織、細(xì)胞的生長狀況。因此，模擬生物頻譜方法應(yīng)用到胚胎工程中具有意義。同理，模擬生物頻譜也將對動物的繁殖、發(fā)育生長和防治疾病具有明顯的促進(jìn)作用。
本發(fā)明目的是利用模擬的生物頻譜作用于動物胚胎工程技術(shù)和動物中，引起動物胚胎和動物機(jī)體的輻射生物效應(yīng)，具體包括在胚胎體外生產(chǎn)中利用模擬的生物頻譜照射，提高卵母細(xì)胞成熟率，體外受精率和胚胎成熟率，提高胚胎質(zhì)量；
在胚胎冷凍保存過程中利用模擬的生物頻譜照射，提高胚胎存活率和妊娠發(fā)育率；在胚胎顯微操作技術(shù)中利用模擬的生物頻譜照射，修復(fù)損傷胚胎，提高其成功率。
在動物繁殖發(fā)育和防治疾病中采用模擬生物頻譜照射，以提高受精卵的存活率；促進(jìn)動物子宮發(fā)育；提高排卵率、卵的受精率和受精卵的發(fā)育率。對雄性動物能改善精子的品質(zhì)等。
這里所述的模擬生物頻譜指中國專利申請91109014·2所公開的寬頻帶綜合物理場，其波長從微米(0.2μm)到厘米(10cm)；其中在50μm-10cm之間，輻射信號很弱。用該物理場中的某一部份場也可以獲得一定的效果。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是生物頻譜在動物胚胎體外生產(chǎn)中應(yīng)用的方法(1)卵母細(xì)胞收集。(2)卵母細(xì)胞體外成熟，將收集的卵母細(xì)胞放置于普通培養(yǎng)液或特定培養(yǎng)液中，用頻譜發(fā)生器照射3至20分鐘，照射過程中，培養(yǎng)液的溫度不得高于40℃。(3)精子獲能，將采集的精液用普通培養(yǎng)液或特定培養(yǎng)液稀釋后用頻譜發(fā)生器照射3至20分鐘，照射過程中，培養(yǎng)液的溫度不得高于40℃。(4)卵母細(xì)胞體外受精，將成熟的卵母細(xì)胞和獲能精子放置于裝有普通培養(yǎng)液或特定培養(yǎng)液的試管中，用頻譜發(fā)生器照射1到3次，每次照射3到25分鐘，每次照射過程中，培養(yǎng)液溫度不得高于40℃。(5)胚胎體外培養(yǎng)，將受精卵母移入普通培養(yǎng)液或特定培養(yǎng)液中，用頻譜發(fā)生器照射3至30分鐘，照射過程中，培養(yǎng)液溫度不得高于40℃。
生物頻譜在動物胚胎冷凍保存中應(yīng)用的方法解凍前或后將動物胚胎置于培養(yǎng)液中，用頻譜發(fā)生器照射3至30分鐘，為了增強(qiáng)作用，也可以在解凍前和解凍后將動物胚胎置于培養(yǎng)液中，先用頻譜發(fā)生器照射3至20分鐘，照射過程中，培養(yǎng)液溫度不得高于40℃。
生物頻譜在動物胚胎顯微操作中應(yīng)用的方法顯微操作前或后將動物胚胎置于培養(yǎng)液中，用頻譜發(fā)生器照射3至35分鐘，為了增強(qiáng)作用，也可以在顯微操作前和后將動物胚胎置于培養(yǎng)液中先用頻譜發(fā)生器照射3至35分鐘，照射過程中，培養(yǎng)液溫度不得高于40℃。
生物頻譜在動物繁殖發(fā)育生長中應(yīng)用的方法用頻譜發(fā)生器照射動物，每天1-2次，每次3-60分鐘，照射過程中，動物表面溫度不高于45℃。使用本方法時，輔以常規(guī)的繁殖發(fā)育生長技術(shù)(如注射各種促性腺激素等)效果更佳。
生物頻譜在動物疾病防治中的應(yīng)用方法用頻譜發(fā)生器照射動物的局部或全身，每天1-3次，每次6-60分鐘，照射過程中，動物被照射處表面溫度不得高于45℃。
在胚胎體外生產(chǎn)中利用模擬的生物頻譜照射，可以使體外受精率至少提高百分之十八，體外受精卵的發(fā)育率至少提高百分之十九。
在胚胎冷凍保存過程中利用模擬的生物頻譜照射，可以使胚胎存活率至少提高百分之十六，對胚胎的妊娠發(fā)育率也有明顯的提高。
在胚胎顯微操作技術(shù)中利用模擬的生物頻譜照射，可以顯著地提高半分桑椹體外發(fā)育率和半分囊胚發(fā)育率，提高胚胎染色體標(biāo)本制作效率。
在動物繁殖發(fā)育生長中利用模擬的生物頻譜照射，可以促進(jìn)雌性動物子宮發(fā)育，提高排卵率、卵的受精率、受精卵的存活率和發(fā)育率。改善雄性動物的精子品質(zhì)等。
在動物防治疾病中利用模擬的生物頻譜照射，可以緩解和控制疾病，達(dá)到治療保健作用。
實(shí)施例1用常規(guī)方法從供體母牛中收集卵母細(xì)胞，將所采集的卵母細(xì)胞放置于裝有普通培養(yǎng)液或特定培養(yǎng)液的容器中進(jìn)行卵母細(xì)胞體外成熟，用周林頻譜總公司生產(chǎn)的WS-101D頻譜治療儀照射15分鐘，治療儀的劑量開關(guān)選擇為弱檔，照射過程中，培養(yǎng)液溫度控制在38℃至40℃之間，通過調(diào)節(jié)照射距離來控制溫度。特定培養(yǎng)液按照Brackett等的方法配制。用NaCl6.55克/升，KCl0.30克/升，CaCl2·2H2O0.33克/升、NaH2PO4H2O0.11克/升、MgCl2·6H2O0.11克/升、NaHCO3·3.10克/升、葡萄糖2.50克/升、無水丙酮酸鈉0.14克/升(或丙酮酸0.11克/升)、牛血清白蛋白3.00克/升、青霉素鈉鹽0.031(50單位/毫升)加入四蒸水1000毫升，待其充分溶解后過濾滅菌。在含59％CO2空氣的38℃培養(yǎng)箱中平衡，滲透壓約為300毫滲量/公斤。在100毫克上述配制的溶液中加入84毫克NaHCO3即配制為特定培養(yǎng)液，在10毫升上述配制的溶液中加入34毫克NaCl即配制為m-HIS液。
精子獲能。將采集的新鮮精液先用Bracktt等的方法處理，即于精液中加入上述特定培養(yǎng)液，350克離心5分鐘，去上清，于沉淀的精子中加入m-HIS液，在38℃水浴培養(yǎng)15分鐘，隨后離心，去上清，置入裝有特定培養(yǎng)液的試管中用周林頻譜總公司生產(chǎn)的WS-101D頻譜治療儀照射10分鐘，治療儀的劑量開關(guān)選擇為弱檔，照射過程中，培養(yǎng)液溫度控制在38℃至40℃之間，通過調(diào)節(jié)照射距離來控制溫度。
卵母細(xì)胞體外受精。將體外成熟的卵母細(xì)胞和體外獲能精子放置于裝有特定培養(yǎng)液的試管中，用周林頻譜總公司生產(chǎn)的WS-101D頻譜治療儀照射20分鐘，然后將試管置于38℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，一個小時后將試管取出，再用頻譜治療儀照射18分鐘后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5個小時。照射過程中，頻譜治療儀的劑量開關(guān)選擇為弱檔，培養(yǎng)液溫度控制在38℃至40℃之間，通過調(diào)節(jié)照射距離來控制溫度。
胚胎體外培養(yǎng)。將受精卵母細(xì)胞移入特定培養(yǎng)液中，用WS-101D頻譜治療儀照射25分鐘，治療儀的劑量開關(guān)選擇為弱檔，培養(yǎng)液溫度控制在38℃至40℃之間，通過調(diào)節(jié)照射距離來控制溫度。
實(shí)施例2將牛胚胎置于特定培養(yǎng)液中用WS-101D頻譜治療儀照射15分鐘，治療儀劑量開關(guān)選擇為弱檔，培養(yǎng)液溫度控制在38℃至40℃之間，通過調(diào)節(jié)照射距離控制溫度。采用井上忠恕等方法添加冷凍保護(hù)劑。即預(yù)先準(zhǔn)備含20％CS的PBS，用甘油配制成0.18、0.33、0.75、0.88以及1.0M溶液，并分別裝入小培養(yǎng)皿中待用。將冷凍用牛胚胎以5分鐘間隔過檔，并在1.0M溶液中放置30分鐘后裝入0.5毫升細(xì)管中，再轉(zhuǎn)入冷凍儀中開始降溫冷凍。以1℃/分速度降溫到-7℃，在此溫度誘發(fā)結(jié)晶，進(jìn)行強(qiáng)制植冰后，再以0.3℃/分速度下降到-35℃，-35℃至-36℃以0.1℃/分速度降溫后，直接投入液氮(-196℃)。
胚胎解凍。從液氮中取出裝有胚胎的細(xì)管，立即投入21℃溫水中，輕輕搖蕩，解凍速度約360℃/分。胚胎解凍后及時以階段性稀釋法緩慢地除去冷凍保護(hù)劑，即在室溫條件下，按照添加冷凍保護(hù)劑的相反的順序進(jìn)行稀釋。然后，將解凍后的胚胎置于特定培養(yǎng)液中，用WS--101D頻譜治療儀照射20分鐘，治療儀的劑量開關(guān)選擇為弱檔，培養(yǎng)液溫度控制在38℃至40℃之間，通過調(diào)節(jié)照射距離控制溫度。
實(shí)施例3采用Kasai等的玻璃化法冷凍。即在室溫下往0.25ml細(xì)管內(nèi)依次吸入S-PBS液(～100μl)、空氣(～20μl)、EFS液(～6μl)、空氣(～6μl)以及EFS液(～40μl)待用。將牛胚胎置于特定培養(yǎng)液中，用WS-101D頻譜治療儀照射15分鐘，劑量開關(guān)選擇為弱檔，培養(yǎng)液溫度控制在38℃至40℃之間，通過調(diào)節(jié)照射距離控制溫度。將胚胎用EFS液在室溫下平衡3分鐘后，迅速吸入上述細(xì)管的最長EFS液(～40μl)段中，然后依次吸入空氣(～6μl)、EFS液(～6μl)、空氣(～15μl)和S-PBS液(～20μl)，最后用預(yù)熱的鑷子封口。
解凍。從液氮中取出裝有胚胎的細(xì)管，立即投入20℃水中，輕輕搖蕩。迅速用0.5mlS-PBS液沖出細(xì)管內(nèi)胚胎，然后移入S-PBS液內(nèi)，經(jīng)過5分鐘移到m-PBS液，洗滌三次后置于特定培養(yǎng)液中用WS-101D頻譜治療儀照射10分鐘，劑量開關(guān)選擇弱檔，培養(yǎng)溫度控制在38℃至40℃之間，通過調(diào)節(jié)照射距離控制溫度。
用NaCl8克/升、KCl0.2克/升、Na2HPO41.15克/升、KH2PO40.2克/升、CaCl20.1克/升、MgCl2·6H2O0.1克/升、丙酮酸鈉0.036克/升、葡萄糖1克/升、青霉素100IU/mL、鏈霉素0.05克/升為m-PBS液，用m-PBS液配制0.5M蔗糖溶液即為S-PBS液。
EFS液配制方法先配制含30％聚蔗糖溶液的0.5M蔗糖溶液(EF液)然后以40％乙二醇和60％EF液相混合即成EFS液。
實(shí)施例4胚胎分割。胚胎分割采用松本和也等使用過的金屬刀切割法。先將剃須刀的刀尖用鑷子掰開，并固定在毛細(xì)玻璃管上，然后把毛細(xì)玻璃管安裝在顯微操作儀器手上。操作時，將0.05mlPBS＋20％CS培養(yǎng)液滴于塑料培養(yǎng)皿(直經(jīng)8cm、高1cm)中央。將待切割胚胎置于培養(yǎng)液中，用WS-101D頻譜治療儀照射15分鐘，取出胚胎放入培養(yǎng)皿中央，在裝有顯微操作儀的倒置顯微鏡下切割胚胎。
切割和處理完畢后將半胚置于培養(yǎng)液中，用WS-101D頻譜治療儀照射30分鐘，治療儀的劑量開關(guān)選擇弱檔，培養(yǎng)液溫度控制在38℃至40℃之間，通過調(diào)節(jié)照射距離控制溫度。
實(shí)施例5性別鑒定。從胚胎中采取少量細(xì)胞可以準(zhǔn)確地進(jìn)行性別鑒定。但是容易對胚胎造成損傷，影響其活力。在采取細(xì)胞之后用WS-101D頻譜治療儀照射胚胎20分鐘，可以提高胚胎的活力。
實(shí)施例6動物的繁殖發(fā)育生長功能。以小鼠作為實(shí)驗(yàn)動物，將雌鼠隨機(jī)分成兩組，每組20只，A組為生物頻譜照射組，B組為對照組，對照組不作照射處理，A、B兩組其它實(shí)驗(yàn)條件相同。將每組動物分成2批，每批10只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用周林頻譜總公司制造的WS-101頻譜治療儀，每天定時照射A組1次，照射時間為20分鐘，儀器劑量開關(guān)選擇為強(qiáng)擋。鼠背溫度不高于38℃，共照射10天/10次。其中在照射第4天，A、B兩組每只雌鼠注射孕馬血促性腺激素(PMSG10IU)，照射第6天，A、B兩組每只雌鼠各注射人絨毛膜促性腺激素(HCG10IU)，注射后，每只雌鼠籠內(nèi)放1只公鼠交配。第7天，A、B兩組各10只雌鼠輸卵管沖卵，兩組比較的結(jié)果顯示用頻譜治療儀照射對受精卵的存活有明顯的保護(hù)作用。在第10天對A、B兩組剩余各10只雌鼠輸卵管沖卵，收集囊胚數(shù)，A、B兩組比較結(jié)果顯示用頻譜治療儀照射有促進(jìn)排卵和卵的受精作用，并對囊胚的發(fā)育作用明顯。A、B兩組比較還顯示頻譜治療儀照射，明顯使雌鼠子宮充血發(fā)育。本實(shí)施例說明用頻譜治療儀照射動物，可促進(jìn)動物的繁殖發(fā)育生長功能。
實(shí)施例7用周林頻譜總公司制造的WS-101頻譜治療儀照射治療羔羊腹瀉，每天一次，每次20分鐘，儀器開關(guān)選擇強(qiáng)擋，羔羊腹部被照射時的表面溫度不得超過45℃，共照射2-4天，可控制腹瀉，獲得明顯的治療效果。
發(fā)明人認(rèn)為除了使用上述實(shí)施例外，根據(jù)本發(fā)明的主要構(gòu)思，生物頻譜將適用于多種生物工程對象。除能使胚胎工程乃至生物工程中的不少難題得到解決，還能使胚胎工程和生物工程中的復(fù)雜、高難度工藝變?yōu)楹唵我仔小Ｒ虼?，在生物工程領(lǐng)域還可以有其它不同的實(shí)施方案，而這些方案都應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種生物頻譜在動物胚胎工程中應(yīng)用的方法，包括(1)卵母細(xì)胞收集，(2)卵母細(xì)胞體外成熟，(3)精子獲能，(4)卵母細(xì)胞體外受精，(5)胚胎體外培養(yǎng)，其特征在于卵母細(xì)胞體外成熟過程中將卵母細(xì)胞放置于普通培養(yǎng)液或特定培養(yǎng)液中，用頻譜發(fā)生器照射3至20分鐘，照射過程中，培養(yǎng)液溫度不得高于40℃。精子獲能過程中將精液用普通培養(yǎng)液或特定培養(yǎng)液稀釋后用頻譜發(fā)生器照射3至20分鐘，照射過程中，培養(yǎng)液溫度不得高于40℃。卵母細(xì)胞體外受精過程中將卵母細(xì)胞和體外獲能精子放置于裝有普通培養(yǎng)液或特定培養(yǎng)液的試管中，用頻譜發(fā)生器照射1至3次，每次照射3至25分鐘，照射過程中，培養(yǎng)液溫度不得高于40℃。胚胎體外培養(yǎng)過程將受精卵母細(xì)胞移入普通培養(yǎng)液或特定培養(yǎng)液中，用頻譜發(fā)生器照射3到30分鐘，照射過程中，培養(yǎng)液溫度不得高于40℃。
2.如權(quán)利要求1所述生物頻譜在動物胚胎工程中應(yīng)用的方法，其特征在于所述特定培養(yǎng)液的成分為在NaCl6.55克/升、KCl0.30克/升、CaCl2·2H2O0.33克/升、NaH2PO4·H2O0.11克/升、MgCl2·6H2O0.11克/升、NaHCO33.10克/升、葡萄糖2.50克/升、無水丙酮酸鈉0.14克/升(或丙酮酸0.11克/升)、牛血清白蛋白3.00克/升、青霉素鈉鹽0.031(50單位/毫升)中加入四蒸水到1000毫升，然后在100毫升以上溶液中加入84毫克NaHCO3。
3.一種生物頻譜在動物胚胎冷凍中應(yīng)用的方法，其特征在于冷凍前或后將動物胚胎置于培養(yǎng)液中，用頻譜發(fā)生器照射3至35分鐘，也可以在解凍前和解凍后將動物胚胎置于培養(yǎng)液中，用頻譜發(fā)生器照射3至35分鐘，照射過程中，培養(yǎng)液溫度不得高于40℃。
4.一種生物頻譜在動物胚胎顯微操作中應(yīng)用的方法，其特征在于顯微操作前或后將動物胚胎置于培養(yǎng)液中，用頻譜發(fā)生器照射3至35分鐘，也可以是在顯微操作前和顯微操作后將動物胚胎置于培養(yǎng)液中，用頻譜發(fā)生器照射3至35分鐘，照射過程中，培養(yǎng)液溫度不得高于40℃。
5.一種生物頻譜在動物繁殖發(fā)育生長中應(yīng)用的方法，其特征在于用頻譜發(fā)生器照射動物，每天1-2次，每次3-60分鐘，照射過程中，動物表面溫度不高于45℃。
6.一種生物頻譜在動物防治疾病中應(yīng)用的方法，其特征在于用頻譜發(fā)生器照射動物的局部或者全身，每天1-3次，每次6-60分鐘，照射過程中，動物表面溫度不高于45℃。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物頻譜在動物胚胎工程和動物中的應(yīng)用方法。在胚胎體外生產(chǎn)中利用模擬的生物頻譜照射，提高卵母細(xì)胞成熟率，體外受精率和胚胎成熟率，提高胚胎質(zhì)量。在胚胎冷凍保存和胚胎顯微操作中利用模擬的生物頻譜照射，提高胚胎存活率和妊娠發(fā)育率。
文檔編號A61D19/04GK1123131SQ9411830
公開日1996年5月29日 申請日期1994年11月24日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月24日
發(fā)明者周林 申請人:周林