專利名稱：表達(dá)原核生物銨依賴性天冬酰胺合成酶的轉(zhuǎn)基因植物的制作方法
天冬酰胺作為氮的運(yùn)輸形式起著重要作用，在包括氮固定體在內(nèi)的許多植物中，其為參予將氮由根部轉(zhuǎn)移到蒸騰流中的重要化合物。在植物中，天冬酰胺是在天冬酰胺合成酶ASN(E.C.6.3.5.4)催化下由谷氨酰胺、天冬氨酸和ATP形成的，從而作為付產(chǎn)物生成了谷氨酸、AMP和焦磷酸。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，可將原核銨依賴性天冬酰胺合成酶ASN-A(E.C.6.3.1.1)引入植物細(xì)胞中，得到有許多優(yōu)點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因植物植物顯示出更有效的凈光合CO2固定作用、增加了生長速度、加速植物發(fā)育、較早開花并增加了綠色質(zhì)量和植物干重。因此可使作物生長面積擴(kuò)展到氣候較差的地區(qū)，并有可能在溫帶地區(qū)以三季耕作代替兩季耕作。此外，轉(zhuǎn)基因植物可以耐受谷氨酰胺合成酶(GS)抑制劑如Phosphinothricine(PPT)或methionine sulfoximine(MSX)，甚至可在施用這些抑制劑后刺激光合作用和生長。
與高等植物的ASN編碼基因(asn基因)相反，大腸桿菌的asnA基因編碼不同類型的ASN，后者利用銨，而不是利用谷氨酰胺產(chǎn)生天冬酰胺(Cedar and Schwartz(1969)，J.Biol.Chem.，244，4112-4121)。Nakamura等人已分離了該酶的基因并已鑒定了它的特征(Nucleic Acids Research 9，4669-4676(1981))。發(fā)現(xiàn)這種原核生物酶在植物中是有活性的，并且在這些轉(zhuǎn)基因植物中打開了一條新的銨同化途徑。其可導(dǎo)致植物氮代謝的總體改變。對植物生長和綠色質(zhì)量產(chǎn)生具有刺激作用。
正常條件下，轉(zhuǎn)化體中GS和ASN-A均利用氨。當(dāng)黑暗期間經(jīng)降低ATP，能量供應(yīng)和鎂離子的可利用性而限制了葉綠體GS活性時(shí)，這種細(xì)菌途徑的優(yōu)點(diǎn)更為明顯(O′Neal and Joy'(1974)，plant phys.，54，773-779;Joy，(1988)，Can.J.Bot.，66，2103-2109)。另外，當(dāng)用特異性抑制劑如PPT阻滯植物GS時(shí)，植物中細(xì)菌asn-A基因的表達(dá)可得以同化氨。在未轉(zhuǎn)化的植物中，抑制GS活性可淆亂氨利用和銨積聚的主要途徑，其為被處理植物之致死現(xiàn)象的關(guān)鍵因素(Tachibana et al.，(1968)，J.Pesticide Sci.，11，33-37)。因此，存在細(xì)菌酶可減少PPT處理的轉(zhuǎn)基因植物中的氨積聚量，這樣不僅能使轉(zhuǎn)基因植物幸免于對野生型植物是致死性的除草劑的劑量，而且對如此處理的轉(zhuǎn)基因植物有生長刺激作用。
本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員將會理解到，這些積極效果不僅限于大腸桿菌的asnA基因，因?yàn)槠渌?xì)菌也含有同一基因或具有同樣使天冬氨酸和其鹽酰胺化以產(chǎn)生天冬酰胺之能力的基因。
因此本發(fā)明涉及在植物細(xì)胞中使用原核asnA基因、包含編碼原核asnA之基因的基因構(gòu)建物(所說的基因被有效地連接到可影響所說基因在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的調(diào)節(jié)序列上)、含有上述基因構(gòu)建物的載體、用上述基因構(gòu)建物或載體轉(zhuǎn)化的、并在植物(特別是農(nóng)作物)內(nèi)表達(dá)原核氨特異性天冬酰胺合成酶的植物細(xì)胞、以及含有上文限定之被轉(zhuǎn)化細(xì)胞的上述植物的種子或增殖材料。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案包括使用編碼上述酶的大腸桿菌asnA基因及編碼上述酶的合成基因，特別是包含優(yōu)先被植物利用之密碼子的基因。本發(fā)明還包括編碼有不同于天然酶之氨基酸組成的酶的基因，通過刪除或加入密碼子，或置換天然基因中的密碼子，導(dǎo)致本發(fā)明的基因編碼不同的氨基酸序列，但所得酶產(chǎn)物與天然酶有基本相同的催化活性。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以做到的所有這些改動均包括于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
實(shí)施例1有RUBISCO小亞單位啟動子的大腸桿菌asnA基因在煙草中的表達(dá)1.轉(zhuǎn)基因煙草植物的產(chǎn)生基于大腸桿菌asnA基因的完整核苷酸序列(Nakamura et al.，(1981)Nucleic Acids Research 18，4673，F(xiàn)ig.3)，本發(fā)明人將質(zhì)粒PMY114的pstⅠ-HgaⅠ片段再克隆到PUC9中。然后將asnA基因(1.1Kb)連接到豌豆核酮糖1，5-二磷酸羧化酶(“RUBISCO”，Herrera-Estrella et al.，(1984)Nature 310，115-120)小亞單位基因的啟動子上，并將整個(gè)片段導(dǎo)入土壤桿菌(Agrobacterium)載體ppCV001(Koncz and Schell，(1986)Mol.Gen.Genet.，204，383-396)中。對SRI煙草植物進(jìn)行葉園盤轉(zhuǎn)化之后，基于其卡那霉素抗性鑒定轉(zhuǎn)基因植物。從幾個(gè)轉(zhuǎn)化體中選擇出兩株顯示對1kg/ha PPT處理有耐受力的植物(ASP4，ASP5)。作為這種PPT處理的結(jié)果，SRI對照植物完全被殺死，而且從未發(fā)現(xiàn)長出有開花和結(jié)種能力的植株。ASP4和ASP5轉(zhuǎn)化體只在低級和老化的葉子上出現(xiàn)這些綜合征象，而分生組織區(qū)域能夠克服這種抑制作用。當(dāng)繼續(xù)生長之后，這些植物開了花并結(jié)了種子。
自花繁殖ASP4和ASP5轉(zhuǎn)基因煙草植物已產(chǎn)生了有抗性和敏感性后代的分離籽苗群體。在使用的體外條件下，當(dāng)培養(yǎng)基中存在10μM L-PPT時(shí)可以明確地區(qū)分這兩種表型。
還借助Southern DNA雜交法來顯示轉(zhuǎn)化體基因組中asnA序列的存在。用EcoRI消化植物DNA后，在被轉(zhuǎn)化的植物中可顯示出一雜交片段。在Northern雜交分析中，由從體外生長的ASP5轉(zhuǎn)化體中分離的總RNA中檢測出了少量與asnA基因同源的mRNA。
2.降低了轉(zhuǎn)基因煙草植物中氨積聚量經(jīng)PPT處理以抑制GS活性后，可使對照組煙草植物葉中的氨濃度迅速增加。用微量擴(kuò)散法測定氨積聚的速度，然后基于所施用殺草劑的濃度進(jìn)行奈斯勒比色(Shelp et al.，(1985)Can.J.Bot.63，1135-1140)。
當(dāng)劑量為0.5Kg/ha時(shí)，轉(zhuǎn)基因植物能夠抵抗PPT處理的影響(表1)。
表1.噴灑0.5Kg/ha PPT后對照組煙草植物(SR1)和含asnA基因之轉(zhuǎn)基因植物中氨的積聚量氨濃度(mM)小時(shí) SR1 ASP4 ASP54 0.58 0.42 0.406 1.20 0.82 0.7824 1.70 0.70 0.7548 1.95 0.60 0.50當(dāng)噴灑1Kg/ha PPT后，將這些植物與SR1煙草植物相比較，也可看出氨積聚量的降低(表2)。所測得的低水平氨可對被轉(zhuǎn)化之植物造成不太顯著的損傷。
表2.1Kg/ha PPT對煙草(SR1)和轉(zhuǎn)基因植物(ASP4、ASP5)中氨濃度的影響氨濃度(mM)小時(shí) SR1 ASP4 ASP56 0.8 0.78 0.888 2.2 0.87 0.9524 4.9 2.0 1.4048 8.6 4.1 3.6
3.植物生長和發(fā)育刺激作用詳細(xì)比較對照和ASP植物之間的生長行為，可見存在著顯著的差異轉(zhuǎn)基因植物具有提高的生長速度，但用低劑量PPT處理ASP植物時(shí)可出現(xiàn)更為顯著的刺激作用。
可用各種形式的生長曲線證明基礎(chǔ)及PPT誘導(dǎo)的生長加速作用。


圖1顯示盡管噴灑0.025Kg/ha PPT已抑制了SR1植物的生長，但在兩株轉(zhuǎn)化體內(nèi)卻可測出明顯的刺激作用。噴灑0.05kg/ha PPT對所有植物都產(chǎn)生消極影響。各點(diǎn)代表這三株植物的平均高度。
如果在溫室條件下用Baule Mitscherlich曲線確定植物生長的特性時(shí)，也可測出對照和被處理?xiàng)l件下各植物品系之間的差異(圖2)。可根據(jù)圖2所示有特征性α角的曲線斜率查出對生長的抑制和刺激作用。
4.增加了轉(zhuǎn)基因植物的干重除植物高度的不同之外，還可根據(jù)植物干重來檢測這種刺激作用。表3所示數(shù)據(jù)證明asnA轉(zhuǎn)化體有較高的生產(chǎn)量。
表3.對照(SR1)和轉(zhuǎn)化株植物(ASP4、ASP5)的最后干重(gr)處理品系 對照 0.025kg/ha PPTSR1 3.19 100% 2.76 100%ASP4 3.85 120% 4.79 173%ASP5 3.74 117% 5.05 183%
實(shí)施例Ⅱ轉(zhuǎn)基因植物中CaMV35S啟動子啟動asnA的作用作為一種可選用的研究手段，本發(fā)明人用直接DNA攝入法(R.X.Fang et al.，(1989)The Plant Cell，1，141-150)將攜帶含CaMV35S啟動子之大腸桿菌asnA基因的質(zhì)粒分子(PUc)導(dǎo)入SR1葉原生質(zhì)體中?；赑PT抗性直接選擇轉(zhuǎn)化體。在10μm L-PPT存在下，由微小愈傷組織再生成植株。對得自PPT抗性再生株的DNA進(jìn)行Southern雜交分析，進(jìn)一步證明asnA基因的存在。
2.降低了轉(zhuǎn)基因植物中的氨積聚量并改善了對PPT的耐受力自花繁殖再生的轉(zhuǎn)化株后，產(chǎn)生了有不同PPT抗性水平的分離后代(培養(yǎng)基內(nèi)添加高達(dá)30μM的L-PPT)。
與抗性表型相符，當(dāng)噴灑1kg/ha PPT時(shí)，被轉(zhuǎn)化的植物比SR1植物積聚較少的氨(表4)。
表4.植物噴灑1kg/ha PPT后的氨積聚量氨濃度(mM)小時(shí) SR1 ASP70 ASP956 6.85 2.92 1.9524 9.50 5.60 5.1048 22.3 13.60 17.40120 58.60 28.30 35.6144 113.00 39.40 50.00
3.光合作用的效率根據(jù)光合作用的各種參數(shù)，如CO2固定速率(Szajko et al.，1971，Acta Agr.Acad.Hung.，20，247-260)和熒光誘導(dǎo)作用(Hideg et al.，1986，Photobiochem.Photobiophys.，12，221-230)來鑒定對照組SR1和轉(zhuǎn)基因煙草植物的特性。在溫室條件下，用不同劑量的PPT處理植物并測定氨含量。如表5所示，與對照組植物相比，含ASN-A基因的轉(zhuǎn)基因植物顯著地提高了凈CO2固定作用的效率。應(yīng)用低劑量PPT處理，可進(jìn)一步刺激CO2固定，同時(shí)用或不同PPT處理(50g/ha)的SR1植物間的差異并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性。表5所示數(shù)據(jù)還提供了這樣的證據(jù)，即對于煙草植物來說，抑制性PPT濃度可引起銨積聚，并通過抑制電子傳遞和使CO2固定作用降低50%而對光合作用造成嚴(yán)重?fù)p害。但在同一條件下，轉(zhuǎn)基因植物則可以耐受這種處理對光合功能的影響。
4.asnA轉(zhuǎn)化株植物的生長行為對植物生長速率(mm/天)的重復(fù)分析顯示在植物早期發(fā)育階段加速了轉(zhuǎn)化株的生長。表6中所示數(shù)據(jù)為溫室中的植物生長速率。
在田間條件下對這些植物所作分析與上述溫室條件下觀察到的差異相似(表7)。在生長的Ⅰ-Ⅲ階段，Asp植物生長速率明顯高于SR1植物。這一實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了PPT對轉(zhuǎn)基因植物的生長刺激作用，特別是在最后的生長階段。Baule-Mitscherlich曲線(圖3)清楚地表明，在田間生長期間，Asp植物表現(xiàn)得比對照組SR1植物生長更快。
5.asnA轉(zhuǎn)化株的生產(chǎn)能力如表8所示，與SR1植物相比Asp植物的總綠色質(zhì)量及干重得以增加。還可看出，PPT處理后明顯地刺激了轉(zhuǎn)基因植物。同時(shí)噴灑PPT則抑制了對照組SR1植物。
權(quán)利要求
1.制備轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的方法，其包括將原核生物的銨特異性天冬酰胺合成酶(ASN-A)引入所說的細(xì)胞中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其包括將含有編碼原核ASN-A之基因的基因構(gòu)建物引入所說的細(xì)胞中，該基因被有效地連接到可影響所說基因在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的調(diào)節(jié)序列上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所說的ASN-A是大腸桿菌ASN-A。
4.根據(jù)上述權(quán)利要求之一的方法，其中編碼ASN-A的基因是由植物特異性密碼子構(gòu)成的。
5.生產(chǎn)植物、種子或繁殖材料的方法，其包括繁殖按前述任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述方法得到的細(xì)胞。
全文摘要
可將編碼原核生物之銨特異性天冬酰胺合成酶(ASN-A)的基因asnA引入植物細(xì)胞中。如此轉(zhuǎn)化的細(xì)胞及由其發(fā)育而成的植物不僅可耐受谷氨酰胺合成酶抑制劑，而且可受到這些除草劑的有效刺激。
文檔編號A01H5/00GK1053641SQ91100460
公開日1991年8月7日 申請日期1991年1月25日 優(yōu)先權(quán)日1990年1月26日
發(fā)明者丹尼斯·多笛咨, 凱·泊羅微斯, 凱·喀曼, 加·吉奧吉, 費(fèi)·那吉, 拉·貝克, 加·赫瓦斯, 皮·艾克斯, 根·東恩 申請人:赫徹斯特股份公司