專利名稱:一種甘蔗種的組培方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種甘蔗種的組培方法，選取常規(guī)良種甘蔗的優(yōu)質(zhì)細胞與竹筍細胞、甜葉菊細胞進行細胞融合后再培養(yǎng)，產(chǎn)生了優(yōu)良的新一代甘蔗種。
背景技術：
常規(guī)的甘蔗的蔗種是直接留蔗內(nèi)尾部做種或整條做種，如果經(jīng)多年留種，各種病菌病毒侵入體內(nèi)常常造成品種退化，產(chǎn)量越來越低。常規(guī)的甘蔗選育良種是選異變株做良種繁殖，產(chǎn)量沒有多大增加?，F(xiàn)有的雜交甘蔗是用不同的良種蔗之間雜交，雜交出來的甘蔗品種往往難以體現(xiàn)出優(yōu)良的品質(zhì)。
根據(jù)細胞學說理論指出高等植物的器官和組織，可以不斷分割，直至單個細胞， 這種單個是具有潛在全能性的功能單位，即植物細胞具有全能性。目前，植物細胞具有全能性被解釋為每一個細胞帶有該植物的全部遺傳信息，在適當條件下可表達出該細胞的所有遺傳信息，分化出植物有機體所有不同類型的細胞，形成不同類型的器官甚至胚狀體，直至形成完整再生植株?，F(xiàn)代植物細胞雜交技術是用兩種或兩種以上的植物細胞，經(jīng)酶解法或機械分離法除去細胞壁，游離出原生質(zhì)體，在一定的條件下經(jīng)誘導融合形成雜種細胞；是植物雜交育種的進步。本發(fā)明用良種甘蔗和竹或其它植物遠緣雜交，也是植物雜交育種實踐開辟的一條新路。在這方面，名稱是熱帶季風氣候地區(qū)甘蔗截莖雜交制種方法，公開號是 CN101401M3的發(fā)明專利，公開了一種適用于中國熱帶季風氣候地區(qū)甘蔗雜交制種的方法， 包括甘蔗親本種植、穗莖促根處理、穗莖砍取與保育、隔離雜交與人工輔助授粉和種子成熟過程管理步驟。但這種方法顯然與甘蔗通過組培而實現(xiàn)雜交有著較大的差距。再進一步的檢索，也未發(fā)現(xiàn)有甘蔗雜交的技術披露，所以通過甘蔗組培進行雜交，對農(nóng)業(yè)發(fā)展是很有意義的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種甘蔗種的組培方法，解決甘蔗連年舊地重栽產(chǎn)生的各種病菌病毒，導致出現(xiàn)嚴重的品種退化，造成甘蔗生長越來越小，產(chǎn)量越來越低，質(zhì)量越來越差的問題。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了下述技術措施，一種甘蔗種的組培方法，由常規(guī)良種甘蔗、食用竹筍、甜葉菊三種植物細胞進行組培融合雜交，具體方法步驟是
(1)在無菌條件下用常規(guī)良種甘蔗的葉鞘或葉片、食用竹筍的莖尖或葉片芽尖和甜葉菊的葉片芽尖，分別接種于常規(guī)通用的MS培養(yǎng)基中，經(jīng)過常規(guī)恒溫培養(yǎng)25-40天脫毒， 分別獲得第一代純化試管苗原種；
(2)分別將脫毒后的純化試管苗原種組織轉(zhuǎn)接于常規(guī)誘導愈傷組織MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)25 30天，誘導產(chǎn)生愈傷組織，期間用通過變壓裝置得到的電壓達到10000-12000伏的高壓電，經(jīng)過電觸棒以每次0. 1-0. 3秒的速度瞬間剌激培養(yǎng)基，每隔160-240分鐘剌激一次，培養(yǎng)期間剌激120-180次，調(diào)整培養(yǎng)基的酸堿度至PH 5. 5-6. 5，使純化試管苗原種組織遠緣變性為變性愈傷組織；
(3)分別將變性愈傷組織轉(zhuǎn)接于常規(guī)細胞脫分化含超氧化物歧化酶(SOD) 100-200 萬單位/毫升的液體MS培養(yǎng)基中，在25 30°C的溫度下振蕩培養(yǎng)7 10天，得到培養(yǎng)成熟細胞組織；
(4)將已培養(yǎng)好的三種細胞組織在無菌條件下分別用濾網(wǎng)或離心收集細胞， 用無菌水洗滌凈，分別接種于新的MS培養(yǎng)基中，加入占培養(yǎng)基體積 3%的活性是 200000-300000單位/毫升的體積比是1 1 1的纖維酶、半纖維酶、果膠酶，在溫度是 25-30°C的條件下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)15-25小時，磨破細胞壁游離出細胞原生質(zhì)體；
(5)離心除去酶液，收集細胞原生質(zhì)體并用無菌水洗滌3-5次至凈化，進行細胞融合雜交把收集洗滌凈化的甘蔗、竹筍、甜葉菊無細胞壁的原生質(zhì)按體積比是 1 0.3-1 0.3-1的比例加入由含量是4.0-6. 0%的NaN03、8-15% (ff/V)的蔗糖溶液及 100-200萬單位/升的超氧化物歧化酶混合而成的溶液中，于32-37°C恒溫保持4_8分鐘， 離心3-8分鐘，得到原生質(zhì)體沉積物，再在恒溫水浴20-40分鐘，經(jīng)過上處理獲得大量細胞原生質(zhì)體融合多核雜交細胞集合體，以加有0. 1% NaNO3的MS培養(yǎng)基洗滌集合體二次，然后接種于有淺層液體的固體MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)25-35天；
(6)再取上述經(jīng)過培養(yǎng)的雜交細胞生長發(fā)育旺盛的集合體，用30w紫外線燈在 1-1. 5米范圍內(nèi)以每5分鐘為一梯度遞進間歇照射，即第一次5分鐘，待生長一天后，再照射10分，待生長一天后，再照射15分鐘，如此遞進間歇照射直至30分鐘，淘汰生長弱勢植株得到生長強壯雜交植株。
(7)在進行細胞融合雜交時，還可以把收集洗滌凈化的甘蔗、竹筍、甜葉菊細胞原生質(zhì)按體積比是1 0.3-1 0.3-1的比例混合接種于有淺層液體的固體MS培養(yǎng)基中輕微振蕩培養(yǎng)，在開始的M小時內(nèi)每隔30-50分鐘用由變壓裝置輸出的10000-12000伏高壓電，經(jīng)過電觸棒以每次0. 1-0. 3秒的速度瞬間剌激培養(yǎng)基，然后靜止培養(yǎng)，經(jīng)過25-35天的培養(yǎng)得到融合多核雜交細胞集合體，即可按上述(6)的步驟培養(yǎng)。
采取上述措施的本發(fā)明，因為采用了竹筍、甜葉菊和甘蔗的細胞組織進行了細胞融合雜交，使得本發(fā)明雜交的甘蔗種具有生長旺盛、抗旱耐澇、抗倒伏，抗不良環(huán)境，抗病蟲害，免疫能力強的特點。像竹筍似的生長速度快，同時還具有甜菊甜味超越甘蔗的特性，使得本發(fā)明雜交甘蔗獨具雜交優(yōu)良品質(zhì)的特色。效果表現(xiàn)在于1.含糖量高于常規(guī)目前現(xiàn)有的良種甘蔗；2.汁多、外形好看；3.生長旺盛、抗倒狀、抗病力強；4.耐干旱、耐澇、耐鹽堿酸能力強；5.蔗節(jié)長度達到20厘米左右，蔗徑可達5-7厘米，蔗肉可達5米；6.產(chǎn)量可達 10-20噸/畝，本發(fā)明技術要求嚴謹，實施可操作性容易。以本發(fā)明甘蔗種苗移入大田種植， 在3畝地中種植試驗，以常規(guī)種植模式種植，并與常規(guī)良種臺糖27號進行比較，本發(fā)明的種植結(jié)果是平均畝產(chǎn)12噸，平均甘蔗節(jié)長度16厘米，甘蔗直徑最粗處6厘米，糖度17%。所有數(shù)據(jù)均比常規(guī)良種甘蔗臺糖27號的種植結(jié)果更為優(yōu)良。
具體實施方式
實施例1
(1)在無菌條件下用臺糖27號良種甘蔗的葉鞘、甜竹筍的莖尖和甜葉菊的葉片芽尖，分別接種于常規(guī)通用的MS培養(yǎng)基中，經(jīng)過常規(guī)恒溫培養(yǎng)30天脫毒，分別獲得第一代純化試管苗原種；
(2)分別將脫毒后的純化試管苗原種組織轉(zhuǎn)接于常規(guī)誘導愈傷組織MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)25天，誘導產(chǎn)生愈傷組織，期間用通過變壓裝置得到的電壓達到10000伏的高壓電，經(jīng)過電觸棒以每次0. 1秒的速度瞬間剌激培養(yǎng)基，每隔180分鐘剌激一次，培養(yǎng)期間剌激160 次，調(diào)整培養(yǎng)基的酸堿度至PH 6.0，使純化試管苗原種組織遠緣變性為變性愈傷組織；
(3)分別將變性愈傷組織轉(zhuǎn)接于常規(guī)細胞脫分化含超氧化物歧化酶(SOD) 100萬單位/升的液體MS培養(yǎng)基中，在30°C的溫度下振蕩培養(yǎng)10天，得到培養(yǎng)成熟細胞組織；
(4)將已培養(yǎng)好的三種細胞組織在無菌條件下分別離心收集細胞，用無菌水洗滌凈，分別接種于新的MS培養(yǎng)基中，加入占培養(yǎng)基體積1 %的活性均是10000單位/毫升的體積比是1 1 1的纖維酶、半纖維酶、果膠酶，在30°C的條件下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)20小時，磨破細胞壁游離出細胞原生質(zhì)體；
(5)離心除去酶液，收集細胞原生質(zhì)體并用無菌水洗滌3次至凈化，進行細胞融合雜交把收集洗滌凈化的甘蔗、竹筍、甜葉菊無細胞壁的原生質(zhì)按體積比是1 1 1的比例加入由含量是6. 0%的NaN03、10% (ff/V)的蔗糖溶液及100萬單位/升的超氧化物歧化酶混合而成的溶液中，于32°C恒溫保持5分鐘，離心5分鐘，得到原生質(zhì)體沉積物，再在 32°C恒溫水浴30分鐘，經(jīng)過上述處理獲得大量細胞原生質(zhì)體融合多核雜交細胞集合體，以加有0. 1 % NaNO3的MS液體培養(yǎng)基洗滌集合體二次，然后接種于有淺層液體的固體MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天；
(6)再取上述經(jīng)過培養(yǎng)的雜交細胞生長發(fā)育旺盛的集合體，用30w紫外線燈在 1-1. 5米范圍內(nèi)以每5分鐘為一梯度遞進間歇照射，即第一次5分鐘，待生長一天后，再照射10分，待生長一天后，再照射15分鐘，如此遞進間歇照射直至30分鐘，淘汰生長弱勢植株得到生長強壯雜交植株。
實施例2
(1)在無菌條件下用臺糖27號良種甘蔗的嫩葉片、甜竹筍的莖尖和甜葉菊的葉片芽尖，分別接種于常規(guī)通用的MS培養(yǎng)基中，經(jīng)過常規(guī)恒溫培養(yǎng)35天脫毒，分別獲得第一代純化試管苗原種；
(2)分別將脫毒后的純化試管苗原種組織轉(zhuǎn)接于常規(guī)誘導愈傷組織MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天，誘導產(chǎn)生愈傷組織，期間用通過變壓裝置得到的電壓達到12000伏的高壓電，經(jīng)過電觸棒以每次0. 3秒的速度瞬間剌激培養(yǎng)基，每隔240分鐘剌激一次，培養(yǎng)期間剌激150 次，調(diào)整培養(yǎng)基的酸堿度至PH 6. 5，使純化試管苗原種組織遠緣變性為變性愈傷組織；
(3)分別將變性愈傷組織轉(zhuǎn)接于常規(guī)細胞脫分化含超氧化物歧化酶(SOD) 200萬單位/升的液體MS培養(yǎng)基中，在25 30°C的溫度下振蕩培養(yǎng)10天，得到培養(yǎng)成熟細胞組織；
(4)將已培養(yǎng)好的三種細胞組織在無菌條件下分別用濾網(wǎng)收集細胞，用無菌水洗滌凈，分別接種于新的MS培養(yǎng)基中，加入占培養(yǎng)基體積3%的活性是30000單位/毫升的體積比是1 1 1的纖維酶、半纖維酶、果膠酶，在溫度是30°C的條件下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)25 小時，磨破細胞壁游離出細胞原生質(zhì)體；
(5)離心除去酶液，收集細胞原生質(zhì)體并用無菌水洗滌5次至凈化，進行細胞融合雜交把收集洗滌凈化的甘蔗、竹筍、甜葉菊細胞原生質(zhì)按體積比是1 0.3 1的比例混合接種于有淺層液體的固體MS培養(yǎng)基中輕微振蕩培養(yǎng)，在開始的M小時內(nèi)每隔30分鐘用由變壓裝置輸出的10000伏高壓電，經(jīng)過電觸棒以每次0. 1秒的速度瞬間剌激培養(yǎng)基，然后靜止培養(yǎng)，經(jīng)過35天的培養(yǎng)得到融合多核雜交細胞集合體，
(6)再取上述經(jīng)過培養(yǎng)的雜交細胞生長發(fā)育旺盛的集合體，用30w紫外線燈在 1-1. 5米范圍內(nèi)以每5分鐘為一梯度遞進間歇照射，即第一次5分鐘，待生長一天后，再照射10分，待生長一天后，再照射15分鐘，如此遞進間歇照射直至30分鐘，淘汰生長弱勢植株得到生長強壯雜交植株。
權利要求
1.一種甘蔗種的組培方法，其特征是所述的組培方法由常規(guī)良種甘蔗、食用竹筍、甜葉菊三種植物細胞進行組培融合雜交，具體方法步驟是(1)在無菌條件下用常規(guī)良種甘蔗的葉鞘或葉片、食用竹筍的莖尖或葉片芽尖和甜葉菊的葉片芽尖，分別接種于常規(guī)通用的MS培養(yǎng)基中，經(jīng)過常規(guī)恒溫培養(yǎng)25-40天脫毒，分別獲得第一代純化試管苗原種；(2)分別將脫毒后的純化試管苗原種組織轉(zhuǎn)接于常規(guī)誘導愈傷組織MS培養(yǎng)基中培養(yǎng) 25 30天，誘導產(chǎn)生愈傷組織，期間用通過變壓裝置得到的電壓達到10000-12000伏的高壓電，經(jīng)過電觸棒以每次0. 1-0. 3秒的速度瞬間剌激培養(yǎng)基，每隔160-240分鐘剌激一次， 培養(yǎng)期間剌激120-180次，調(diào)整培養(yǎng)基的酸堿度至PH 5. 5-6. 5，使純化試管苗原種組織遠緣變性為變性愈傷組織；(3)分別將變性愈傷組織轉(zhuǎn)接于常規(guī)細胞脫分化含超氧化物歧化酶(SOD)100-200萬單位/毫升的液體MS培養(yǎng)基中，在25 30°C的溫度下振蕩培養(yǎng)7 10天，得到培養(yǎng)成熟細胞組織；(4)將已培養(yǎng)好的三種細胞組織在無菌條件下分別用濾網(wǎng)或離心收集細胞，用無菌水洗滌凈，分別接種于新的MS培養(yǎng)基中，加入占培養(yǎng)基體積 3%的活性是 200000-300000單位/毫升的體積比是1 1 1的纖維酶、半纖維酶、果膠酶，在溫度是 25-30°C的條件下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)15-25小時，磨破細胞壁游離出細胞原生質(zhì)體；(5)離心除去酶液，收集細胞原生質(zhì)體并用無菌水洗滌3-5次至凈化，進行細胞融合雜交把收集洗滌凈化的甘蔗、竹筍、甜葉菊無細胞壁的原生質(zhì)按體積比是 1 0.3-1 0.3-1的比例加入由含量是4.0-6. 0%的NaN03、8-15% (ff/V)的蔗糖溶液及 100-200萬單位/升的超氧化物歧化酶混合而成的溶液中，于32-37°C恒溫保持4_8分鐘， 離心3-8分鐘，得到原生質(zhì)體沉積物，再在恒溫水浴20-40分鐘，經(jīng)過上處理獲得大量細胞原生質(zhì)體融合多核雜交細胞集合體，以加有0. 1% NaNO3的MS培養(yǎng)基洗滌集合體二次，然后接種于有淺層液體的固體MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)25-35天；(6)再取上述經(jīng)過培養(yǎng)的雜交細胞生長發(fā)育旺盛的集合體，用30w紫外線燈在1-1.5米范圍內(nèi)以每5分鐘為一梯度遞進間歇照射，即第一次5分鐘，待生長一天后，再照射10分， 待生長一天后，再照射15分鐘，如此遞進間歇照射直至30分鐘，淘汰生長弱勢植株得到生長強壯雜交植株。
2.根據(jù)權利要求
1所述的甘蔗種的組培方法，其特征在于所述的細胞融合雜交是把收集洗滌凈化的甘蔗、竹筍、甜葉菊細胞原生質(zhì)按體積比是1 0.3-1 0.3-1的比例混合接種于有淺層液體的固體MS培養(yǎng)基中輕微振蕩培養(yǎng)，在開始的M小時內(nèi)每隔30-50分鐘用由變壓裝置輸出的10000-12000伏高壓電，經(jīng)過電觸棒以每次0. 1-0. 3秒的速度瞬間剌激培養(yǎng)基，然后靜止培養(yǎng)，經(jīng)過25-35天的培養(yǎng)得到融合多核雜交細胞集合體。
專利摘要
本發(fā)明公開的是一種甘蔗種的組培方法。常規(guī)的甘蔗的蔗種是直接留蔗內(nèi)尾部做種或整條做種，如果經(jīng)多年留種，各種病菌病毒侵入體內(nèi)常常造成品種退化，產(chǎn)量越來越低。常規(guī)的甘蔗選育良種是選異變株做良種繁殖，產(chǎn)量沒有多大增加?，F(xiàn)有的雜交甘蔗是用不同的良種蔗之間雜交，雜交出來的甘蔗品種往往難以體現(xiàn)出優(yōu)良的品質(zhì)。本發(fā)明采用了竹筍、甜葉菊和甘蔗的細胞組織進行了細胞融合雜交，使得本發(fā)明雜交的甘蔗種具有生長旺盛、抗旱耐澇、抗倒伏，抗不良環(huán)境，抗病蟲害，免疫能力強的特點。像竹筍似的生長速度快，同時還具有甜菊甜味超越甘蔗的特性，使得本發(fā)明雜交甘蔗種獨具雜交優(yōu)良品質(zhì)的特色。
文檔編號A01H4/00GKCN102273409SQ201110179181
公開日2011年12月14日 申請日期2011年6月28日
發(fā)明者蔡明 申請人:蔡明 導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan