本發(fā)明屬于水生生物與環(huán)境關(guān)聯(lián)性研究，具體涉及一種評(píng)估obs環(huán)境暴露對(duì)斑馬魚(yú)仔魚(yú)影響的方法。

背景技術(shù)：

1、全氟辛烷磺酸(pfos)是最常見(jiàn)和使用最廣泛的pfass之一，具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性、表面活性和熱穩(wěn)定性，從而廣泛地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和人類(lèi)消費(fèi)品中。然而，大量的生產(chǎn)和使用使得pfos在各類(lèi)環(huán)境介質(zhì)包括空氣、水體與沉積物和土壤中廣泛檢出，甚至可在野生動(dòng)物和人類(lèi)樣品中以高濃度形式存在，表明pfos具有環(huán)境持久性和很強(qiáng)的生物累積性，成為典型的持久性有機(jī)污染物(pops)。全氟壬烯氧基苯磺酸鈉(obs)是pfos替代品，主要用于生產(chǎn)滅火劑、金屬蝕刻劑、洗滌劑和鍍鎳光亮劑等產(chǎn)品應(yīng)用于消防、石油開(kāi)采和電鍍等行業(yè)。

2、近年來(lái)，大量研究顯示obs在不同環(huán)境介質(zhì)中不斷檢出。常規(guī)手段很難完全去除obs，需要通過(guò)高級(jí)氧化技術(shù)才能將其部分轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)，這使得污水系統(tǒng)中的obs大量進(jìn)入各類(lèi)環(huán)境介質(zhì)中。obs也表現(xiàn)出一定的生物富集性，在實(shí)驗(yàn)室研究中發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)胚胎短期暴露可顯著富集obs，而野外調(diào)查同樣發(fā)現(xiàn)obs可在野生鯽魚(yú)血液、肝臟、性腺和肌肉中以較高濃度存在。富集到體內(nèi)的obs可能對(duì)生物體產(chǎn)生潛在危害，高濃度obs污染條件下對(duì)生物體具有潛在的毒性，因此有必要對(duì)obs環(huán)境污染情況下暴露所表現(xiàn)出的生物體毒性效應(yīng)及分子機(jī)制和特點(diǎn)開(kāi)展詳細(xì)研究。

3、目前大部分毒性研究中obs暴露濃度均較高，與環(huán)境中實(shí)際的obs為低濃度的情況不相符，且選擇的模式生物通常為斑馬魚(yú)成魚(yú)和小鼠等，無(wú)法更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)obs環(huán)境暴露對(duì)生物體敏感階段(如初孵時(shí)期)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、(一)要解決的技術(shù)問(wèn)題

2、鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺點(diǎn)、不足，本發(fā)明提供一種評(píng)估obs環(huán)境暴露對(duì)斑馬魚(yú)仔魚(yú)影響的方法，其以孵化后的斑馬魚(yú)仔魚(yú)為試驗(yàn)對(duì)象，研究較低濃度obs的短期暴露對(duì)斑馬魚(yú)早期階段的重要功能系統(tǒng)包括抗氧化、免疫和內(nèi)分泌系統(tǒng)等的影響，以更好地評(píng)價(jià)obs對(duì)水生生物和水生態(tài)系統(tǒng)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

3、(二)技術(shù)方案

4、一種評(píng)估obs環(huán)境暴露對(duì)斑馬魚(yú)仔魚(yú)影響的方法，其包括：

5、(1)將發(fā)育正常的卵裂期斑馬魚(yú)胚胎放入裝有斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，然后置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光暗周期14h:10h，溫度27±1℃；每天更換培養(yǎng)液并挑除孵化后的卵膜，培養(yǎng)3天后，挑選孵化和發(fā)育正常的斑馬魚(yú)初孵仔魚(yú)用于暴露試驗(yàn)；

6、(2)采用高濃度急性暴露試驗(yàn)計(jì)算obs對(duì)斑馬魚(yú)仔魚(yú)的安全濃度，斑馬魚(yú)仔魚(yú)的安全濃度sc＝0.1×96h-lc50；

7、(3)基于安全濃度設(shè)置多個(gè)亞致死濃度以作為暴露實(shí)驗(yàn)中的obs濃度，亞致死濃度不超過(guò)安全濃度；將斑馬魚(yú)初孵仔魚(yú)隨機(jī)分組至多個(gè)平行培養(yǎng)皿中，以暴露在亞致死濃度的obs工作液的組為處理組，以暴露在0.01wt％dmso的組為對(duì)照組；暴露期間，每天更換暴露液，暴露時(shí)間為4天；暴露結(jié)束后，利用斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)液清洗各組的斑馬魚(yú)仔魚(yú)，將斑馬魚(yú)仔魚(yú)收集至離心管中，液氮速凍后保存于-80℃?zhèn)溆茫?/p>

8、(4)取其中一部分離心管的樣品進(jìn)行氧化應(yīng)激和免疫相關(guān)參數(shù)檢測(cè)：加入8-12倍體積的冰冷生理鹽水后進(jìn)行勻漿，然后在4℃，10000×g離心5-15min，吸取上清液至新離心管中；測(cè)定上清液樣品中氧化應(yīng)激參數(shù)和免疫相關(guān)參數(shù)；所述氧化應(yīng)激參數(shù)包括ros、t-aoc、cat、t-sod、gsh和mda，免疫相關(guān)參數(shù)包括tnos、inos和no，每個(gè)樣品中的蛋白質(zhì)濃度根據(jù)bca方法測(cè)定；取另一部分離心管的樣品進(jìn)行rna提取，并檢測(cè)斑馬魚(yú)仔魚(yú)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、nf-κb和tlr信號(hào)通路以及內(nèi)分泌相關(guān)基因的表達(dá)水平；

9、(5)根據(jù)步驟(4)的檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，評(píng)價(jià)obs暴露對(duì)斑馬魚(yú)仔魚(yú)的影響。

10、根據(jù)本發(fā)明的較佳實(shí)施例，步驟(1)中，將成年雌雄斑馬魚(yú)養(yǎng)殖于斑馬魚(yú)循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，光暗周期14h:10h，水溫27±1℃，ph值7.5±0.5，電導(dǎo)率500±50μs，每日喂食2次豐年蟲(chóng)；雌雄斑馬魚(yú)進(jìn)行交配獲得斑馬魚(yú)胚胎，將發(fā)育正常的卵裂期胚胎均勻分配至裝有斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，然后置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光暗周期14h:10h，溫度27±1℃；每天更換培養(yǎng)液并挑除孵化后的卵膜，培養(yǎng)3天后，挑選孵化和發(fā)育正常的斑馬魚(yú)初孵仔魚(yú)用于后續(xù)暴露試驗(yàn)。

11、根據(jù)本發(fā)明的較佳實(shí)施例，步驟(2)中，

12、高濃度急性暴露試驗(yàn)中，依次制備80mg/l、60mg/l、40mg/l、20mg/l、10mg/l、8mg/l、6mg/l、4mg/l和2mg/l的obs工作液，進(jìn)行高濃度obs的急性暴露試驗(yàn)；

13、試驗(yàn)步驟如下：將斑馬魚(yú)初孵仔魚(yú)隨機(jī)分配到多孔培養(yǎng)板中，每孔10條仔魚(yú)并加入2.5ml的上述不同濃度的obs工作液，并設(shè)置0.8wt％dmso的溶劑對(duì)照組，每組3個(gè)平行孔；然后將培養(yǎng)皿置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光暗周期14h:10h，溫度為27±1℃，暴露期間每天更換暴露液，記錄斑馬魚(yú)仔魚(yú)的死亡數(shù)并及時(shí)清除死亡仔魚(yú)，暴露時(shí)間為4天，統(tǒng)計(jì)暴露4天后各處理組中斑馬魚(yú)仔魚(yú)的死亡數(shù)，然后利用probit分析方法、trimmed?spearman-karber(tsk)法和非線性擬合方法計(jì)算96h-lc50值，并據(jù)此計(jì)算obs對(duì)斑馬魚(yú)仔魚(yú)的安全濃度sc＝0.1×96h-lc50。

14、經(jīng)試驗(yàn)測(cè)試，確定了obs引起半數(shù)斑馬魚(yú)仔魚(yú)死亡的濃度大約為10mg/l，其安全濃度為1mg/l；則后續(xù)配制obs工作液時(shí)各工作液中的obs濃度不應(yīng)當(dāng)超過(guò)該安全濃度。

15、根據(jù)本發(fā)明的較佳實(shí)施例，步驟(3)為：利用斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)液配制得到濃度分別為0.1μg/l、10μg/l和1000μg/l的obs工作液；將斑馬魚(yú)初孵仔魚(yú)隨機(jī)分配到培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿分配100條仔魚(yú)，每組5個(gè)平行培養(yǎng)皿；暴露期間每天更換暴露液，暴露時(shí)間為4天；暴露結(jié)束后，利用斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)液清洗各處理組斑馬魚(yú)仔魚(yú)，將各處理組中所有斑馬魚(yú)仔魚(yú)收集至離心管中，每個(gè)離心管中30條仔魚(yú)，將斑馬魚(yú)仔魚(yú)液氮速凍后保存于-80℃作為檢測(cè)樣品備用。

16、根據(jù)本發(fā)明的較佳實(shí)施例，步驟(5)包括：結(jié)合所有檢測(cè)參數(shù)進(jìn)行綜合生物標(biāo)志物反應(yīng)分析并繪制星圖，以綜合反映obs對(duì)斑馬魚(yú)仔魚(yú)抗氧化和免疫系統(tǒng)的影響。

17、根據(jù)本發(fā)明的較佳實(shí)施例，步驟(5)還包括：所有數(shù)據(jù)在柱狀圖中均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，在熱圖中以基因表達(dá)的變化倍數(shù)表示；采用kolmogorov-smirnov和levene方法進(jìn)行數(shù)據(jù)正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用graphpad?prism?8.3.0軟件中的單因素方差分析(anova)或雙尾student’s-t檢驗(yàn)方法，*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001表示obs暴露組與對(duì)照組之間具有顯著性差異。

18、(三)有益效果

19、斑馬魚(yú)的基因組與人類(lèi)高度相似并共用多條信號(hào)通路，可作為評(píng)估pfass毒性的模式生物。斑馬魚(yú)的多個(gè)生命階段(胚胎、仔魚(yú)、幼魚(yú)和成魚(yú))對(duì)污染物暴露的敏感程度不同，其中斑馬魚(yú)初孵仔魚(yú)對(duì)obs的敏感度比斑馬魚(yú)胚胎和成魚(yú)更強(qiáng)，因此能更好地用于研究obs對(duì)生物體的毒性效應(yīng)及分子機(jī)制，有利于更加準(zhǔn)確地評(píng)估obs環(huán)境暴露對(duì)生物體敏感階段(如初孵時(shí)期)的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

20、斑馬魚(yú)仔魚(yú)經(jīng)obs暴露后，體內(nèi)ros含量的升高，ros的過(guò)量產(chǎn)生一般與炎癥性疾病同時(shí)發(fā)生，因此本發(fā)明進(jìn)一步檢測(cè)了與免疫相關(guān)酶活指標(biāo)和炎癥相關(guān)基因水平的變化，根據(jù)免疫相關(guān)酶活指標(biāo)和炎癥相關(guān)基因水平的變化，分析研究obs引起的毒性效應(yīng)和分子機(jī)制，表明obs對(duì)斑馬魚(yú)仔魚(yú)的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了顯著影響。

21、研究結(jié)論表明，obs短期暴露顯著誘導(dǎo)了斑馬魚(yú)仔魚(yú)中雌激素受體基因er的表達(dá)，表明obs的類(lèi)雌激素效應(yīng)；cyp19酶可以催化雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)化，obs暴露組中cyp19a1基因的誘導(dǎo)表達(dá)可能導(dǎo)致長(zhǎng)期接觸obs后斑馬魚(yú)的性別分化情況，影響種群結(jié)構(gòu)。此外，在obs暴露后，斑馬魚(yú)仔魚(yú)體內(nèi)卵黃蛋白原vtg的基因表達(dá)水平也顯著升高，作為雌激素內(nèi)分泌干擾的關(guān)鍵生物標(biāo)志物，這表明obs短期暴露即能顯著干擾斑馬魚(yú)仔魚(yú)的雌激素效應(yīng)并影響內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常功能。