本發(fā)明涉及林木栽培技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及紅豆杉的種植方法。
背景技術(shù)：
紅豆杉屬(taxusl.)植物為紅豆杉科常綠喬木或灌木，全世界共11種，分布于北半球的溫帶及亞熱帶地區(qū)。高山林等在1996年搜集了國(guó)內(nèi)外7種紫杉醇含量較高的紅豆杉種，如短葉紅豆杉(t.brevifolia，加拿大溫哥華)、曼地亞紅豆杉(t.media，加拿大維多利亞大學(xué)校園)、歐洲紅豆杉(t.baccata，朝鮮)、東北紅豆杉(t.cuspida，中國(guó)東北)、朝鮮紅豆杉(t.kereoensis，朝鮮)、云南紅豆杉(t.wallichiana，中國(guó)云南省)、西藏紅豆杉杉(taxuswallichi-ann，中國(guó)西藏地區(qū))，發(fā)現(xiàn)加拿大短葉紅豆杉樹皮中紫杉醇含量最高(短葉紅豆杉是美國(guó)癌癥研究所最早發(fā)現(xiàn)含紫杉醇的一個(gè)種)，也是迄今國(guó)內(nèi)外報(bào)道的紫杉醇含量最高的一個(gè)種；曼地亞紅豆杉樹皮中紫杉醇含量較高，僅次于短葉紅豆杉。談鋒等研究引種9個(gè)月后的2個(gè)北美紅豆杉(4a生)和南方紅豆杉(t.chinesensiavar.mairei)(20a生)的葉片，測(cè)定結(jié)果表明：4a生北美紅豆杉葉片中紫杉醇含量為0.051％，高于云南紅豆杉樹皮中紫杉醇的含量(0.015-0.03％)；北美紅豆杉葉片中紫杉醇含量為0.017％；而20a生南方紅豆杉葉片中未測(cè)出紫杉醇。
我國(guó)紅豆杉資源中，以東北紅豆杉和云南紅豆杉中的紫杉醇含量較高，其中東北紅豆杉葉中10-脫乙酰巴卡丁ⅲ的含量也較高，可加以提取作為半合成紫杉醇和多烯紫杉醇的前體。云南紅豆杉樹皮中含有較高的三尖杉寧堿。蘇應(yīng)娟等研究發(fā)現(xiàn)：南方紅豆杉除枝條中紫杉醇含量稍低于東北紅豆杉(t.cuspida)外，皮和葉中紫杉醇含量都稍高于東北紅豆杉；其紫杉醇含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于云南紅豆杉。王達(dá)明認(rèn)為，云南紅豆杉中紫杉醇含量低于東北紅豆杉。但鄭德勇認(rèn)為，云南紅豆杉樣品中紫杉醇含量最高，樹木各部位的紫杉醇平均含量達(dá)1.49x10-4，其次是南方紅豆杉和東北紅豆杉。
國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，部分紅豆杉樣品中紫杉醇及其衍生物含量極低，甚至檢測(cè)不到；而部分樣品中紫杉醇含量高達(dá)0.05％，三尖杉寧堿含量達(dá)0.22％，巴卡丁含量達(dá)0.21％。同時(shí)，研究者發(fā)現(xiàn)紫杉醇含量最高的樣品為一些罕見的品種，如佛羅里達(dá)紅豆杉和墨西哥紅豆杉(t.floridana).10-脫乙酰巴卡?、：扛叩臉悠窞榉鹆_里達(dá)紅豆杉、墨西哥紅豆杉、云南紅豆杉、加拿大紅豆杉(t.canadensis)，以及幾個(gè)歐洲紅豆杉的栽培種。veronikaetal檢測(cè)了匈牙利各種紅豆杉枝葉中紫杉醇的含量，結(jié)果表明歐洲紅豆杉的枝葉中紫杉醇含量最高。歐洲紅豆杉是歐洲最常見的紅豆杉品種，其枝葉中10-脫?；涂ǘ『枯^髙。
程廣有等研究了我國(guó)東北紅豆杉天然群體紫杉醇含量的變化規(guī)律，結(jié)果表明：東北紅豆杉群體之間紫杉醇含量存在顯著差異；群體內(nèi)單株間紫杉醇含量的變化幅度與群體間的相當(dāng)，在同一群體內(nèi)單株紫杉醇最高含量是最低含量的4.3倍。項(xiàng)偉等研究了不同產(chǎn)地云南紅豆杉紫杉醇的含量，結(jié)果表明：云南紅豆杉的樹皮中紫杉醇含量個(gè)體間差異為9.4倍。從上述結(jié)果我們不難發(fā)現(xiàn)，紅豆杉紫杉醇含量波動(dòng)很大，因此難以進(jìn)行大面積規(guī)范化種植。程廣有等認(rèn)為群體選擇或單株選擇紅豆杉可望獲得較大遺傳增益。
針對(duì)如何提高紅豆杉中紫杉醇的含量的種植研究，很有必要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供紅豆杉的種植方法，通過在種植的過程中持續(xù)施加營(yíng)養(yǎng)液，以達(dá)到提高紅豆杉中紫杉醇含量的目的。
本發(fā)明所述技術(shù)方案，是通過如下技術(shù)步驟來實(shí)現(xiàn)的：
紅豆杉的種植方法，包括如下步驟：
1)栽培環(huán)境：選擇廣西桂林海拔600-1000m，地形平緩、坡度小于35°、土層疏松、深厚、排水便利、濕潤(rùn)、富含有機(jī)質(zhì)和酸性土壤的土地或者山地；
2)定植、造林：在6月至12月，以帶狀的方式對(duì)林地進(jìn)行清理整地，深翻細(xì)耕，整成菜畦狀，同時(shí)施充足的基肥，隨深翻混均勻，種植紅豆杉種苗，苗木不能傾斜，根系順向水平展開，覆蓋上土，避免窩根，然后在穴面上覆蓋一些松土，讓其微高于地面，防止雨季積水；
3)撫育管理：定植1周后若發(fā)現(xiàn)死株及時(shí)補(bǔ)上，定植成活后第1年每周施1次營(yíng)養(yǎng)液，以把樹根澆透為準(zhǔn)，定時(shí)施肥，及時(shí)的松土和除草，注重排水，防止幼樹被積水浸泡，導(dǎo)致幼樹被高溫傷害或死亡；
4)林業(yè)有害生物防治；
步驟3)所述的營(yíng)養(yǎng)液，通過如下制備方法得到：
①原料處理：將紅豆杉鮮全株或鮮枝葉清洗干凈，晾干，用粉碎機(jī)粉碎，用10mm網(wǎng)孔粉碎機(jī)粉碎，粉碎粒度為2-10mm，然后放入高壓罐中，加入0.3倍重量份的純凈水，加壓至4kgf/cm2，使其壓力均勻，并保持15min，瞬間恢復(fù)常壓；
②提取：將步驟①得到的粉碎原料加入2倍重量的甲醇加熱提取，45℃提取2次，每次2h，過濾，合并濃縮液，濃縮，溫度控制≤50℃，真空控制在-0.08±0.01mpa，濃縮至0.95-1.05g/ml，得到濃縮提取液，檢測(cè)紫杉醇含量；
③雙水相萃取：對(duì)步驟②得到浸膏進(jìn)行雙水相萃取，浸膏和雙水相萃取液按照1:1.25的體積比，獲得萃取上相和萃取下相，雙水相萃取所使用的雙水相體系由聚乙二醇、氯化鈉和水構(gòu)成，聚乙二醇在所述雙水相體系中的質(zhì)量百分比為15％，氯化鈉在所述雙水相體系中的質(zhì)量百分比為15％，余量為水，所述聚乙二醇的重均分子量為8000；
④將步驟③獲得的萃取水相，采用截留分子量為1000-100000的超濾膜脫鹽，得到。
本發(fā)明步驟2)所述的紅豆杉種苗，優(yōu)選人工培育的2.5年生云南紅豆杉扦插苗，地徑在0.3cm以上，苗高在50cm以上的一級(jí)苗，或者是人工培育的南方紅豆杉1.5年生苗，平均苗高為25cm、平均地徑為0.08cm的營(yíng)養(yǎng)袋苗。
步驟2)所述的整成菜畦狀，優(yōu)選規(guī)格為40cmx40cmx30cm；所述的種植，優(yōu)選株行距離為0.4mx1.5m，密度1.65萬株/hm2。
步驟3)所述的定時(shí)施肥，優(yōu)選定植成活后第1年每周施1次清糞水，施清糞水以把樹根澆透為準(zhǔn)，第2年每?jī)芍苁?次清糞水，施清糞水以把樹根澆透為準(zhǔn)，每月施1次復(fù)合肥，每株施200g，環(huán)施。
步驟3)所述的營(yíng)養(yǎng)液，優(yōu)選稀釋80-100倍使用。
步驟3)所述的撫育管理，是指剛種植的幼苗小，苗木不高，生長(zhǎng)緩慢，必須要加強(qiáng)培育管理，促使其茁長(zhǎng)成長(zhǎng)，一是要注意及時(shí)的松土和除草，在8月至10月，為最佳的松土、除草時(shí)間，注意不要傷害幼樹，二是要注重排水，防止幼樹被積水浸泡，導(dǎo)致幼樹被高溫傷害或死亡。
步驟4)所述的林業(yè)有害生物防治，是指紅豆杉在雨季時(shí)容易發(fā)生根莖腐病以及爛根，按時(shí)的噴灑70％敵克松500-800倍液進(jìn)行防御和治療；而在旱季容易發(fā)生葉桔病、赤桔病等，用1％的波爾多液進(jìn)行噴灑預(yù)防；針對(duì)蝗蟲食葉的現(xiàn)象，及時(shí)的噴灑敵百蟲500-800倍液防御；針對(duì)蝸牛的危害，用蝸克星誘集觸殺和喂殺，禁止使用滴滴涕等具有高殘留、致癌、劇毒、慢性毒藥的農(nóng)藥來進(jìn)行病蟲害防治。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
1、我國(guó)紅豆杉資源中，以東北紅豆杉和云南紅豆杉中的紫杉醇含量較高，南方紅豆杉中的紫杉醇含量較低，大約為0.01-0.07％，平均0.015％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。不同紅豆杉中紫杉醇的含量和樹齡、溫度、濕度、光照、種植地海拔等都有關(guān)系。本發(fā)明通過給紅豆杉施加特別的營(yíng)養(yǎng)液，可以增加紅豆杉中的紫杉醇含量。
2、現(xiàn)有技術(shù)中，工業(yè)上粗提紫杉醇多采用粉碎的紅豆杉枝葉經(jīng)甲醇反復(fù)提取后，濃縮成浸膏，以二氯甲烷、三氯甲烷、醋酸乙酯、石油醚、乙酸乙酯等萃取，經(jīng)過這樣的萃取，得到的有機(jī)相送去分離紫杉醇，而得到的另外一相含有甲醇，無法作為營(yíng)養(yǎng)液用于紅豆杉栽培。本發(fā)明的營(yíng)養(yǎng)液來源于申請(qǐng)人提取紫杉醇后的工藝廢棄物，申請(qǐng)人提取紫杉醇，采用雙水相萃取后，得到的有機(jī)相，進(jìn)入柱層析分離紫杉醇的步驟，而雙水相萃取后，得到的水相，原來是處理后排放掉，后面申請(qǐng)人嘗試著用于紫杉醇的種植，結(jié)果效果很好，不僅可以提高紅豆杉中紫杉醇的含量，還可以減少污水排放，一舉兩得。
具體實(shí)施方式
下面以實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例：
紅豆杉的種植方法，包括如下步驟：
1)栽培環(huán)境：選擇廣西桂林海拔600-1000m，地形平緩、坡度小于35°、土層疏松、深厚、排水便利、濕潤(rùn)、富含有機(jī)質(zhì)和酸性土壤的土地或者山地；
2)定植、造林：在6月至12月，以帶狀的方式對(duì)林地進(jìn)行清理整地，深翻細(xì)耕，整成菜畦狀，規(guī)格為40cmx40cmx30cm，株行距離為0.4mx1.5m，密度1.65萬株/hm2；同時(shí)施充足的基肥，隨深翻混均勻，種植紅豆杉種苗，人工培育的2.5年生云南紅豆杉扦插苗，地徑在0.3cm以上，苗高在50cm以上的一級(jí)苗，或者是人工培育的南方紅豆杉1.5年生苗，平均苗高為25cm、平均地徑為0.08cm的營(yíng)養(yǎng)袋苗，苗木不能傾斜，根系順向水平展開，覆蓋上土，避免窩根，然后在穴面上覆蓋一些松土，讓其微高于地面，防止雨季積水；
3)撫育管理：定植1周后若發(fā)現(xiàn)死株及時(shí)補(bǔ)上，定植成活后第1年每周施1次營(yíng)養(yǎng)液，以把樹根澆透為準(zhǔn)，定時(shí)施肥，定植成活后第1年每周施1次清糞水，施清糞水以把樹根澆透為準(zhǔn)，第2年每?jī)芍苁?次清糞水，施清糞水以把樹根澆透為準(zhǔn)，每月施1次復(fù)合肥，每株施200g，環(huán)施，及時(shí)的松土和除草，注重排水，防止幼樹被積水浸泡，導(dǎo)致幼樹被高溫傷害或死亡；
4)林業(yè)有害生物防治：紅豆杉在雨季時(shí)容易發(fā)生根莖腐病以及爛根，按時(shí)的噴灑70％敵克松500-800倍液進(jìn)行防御和治療；而在旱季容易發(fā)生葉桔病、赤桔病等，用1％的波爾多液進(jìn)行噴灑預(yù)防；針對(duì)蝗蟲食葉的現(xiàn)象，及時(shí)的噴灑敵百蟲500-800倍液防御；針對(duì)蝸牛的危害，用蝸克星誘集觸殺和喂殺，禁止使用滴滴涕等具有高殘留、致癌、劇毒、慢性毒藥的農(nóng)藥來進(jìn)行病蟲害防治；
步驟3)所述的營(yíng)養(yǎng)液，通過如下制備方法得到：
①原料處理：將紅豆杉鮮全株或鮮枝葉清洗干凈，晾干，用粉碎機(jī)粉碎，用10mm網(wǎng)孔粉碎機(jī)粉碎，粉碎粒度為2-10mm，然后放入高壓罐中，加入0.3倍重量份的純凈水，加壓至4kgf/cm2，使其壓力均勻，并保持15min，瞬間恢復(fù)常壓；
②提取：將步驟①得到的粉碎原料加入2倍重量的甲醇加熱提取，45℃提取2次，每次2h，過濾，合并濃縮液，濃縮，溫度控制≤50℃，真空控制在-0.08±0.01mpa，濃縮至0.95-1.05g/ml，得到濃縮提取液，檢測(cè)紫杉醇含量；
③雙水相萃取：對(duì)步驟②得到浸膏進(jìn)行雙水相萃取，浸膏和雙水相萃取液按照1:1.25的體積比，獲得萃取上相和萃取下相，雙水相萃取所使用的雙水相體系由聚乙二醇、氯化鈉和水構(gòu)成，聚乙二醇在所述雙水相體系中的質(zhì)量百分比為15％，氯化鈉在所述雙水相體系中的質(zhì)量百分比為15％，余量為水，所述聚乙二醇的重均分子量為8000；
④將步驟③獲得的萃取水相，采用截留分子量為1000-100000的超濾膜脫鹽，得到，稀釋80-100倍使用。
對(duì)比例：
種植方法同實(shí)施例，沒有使用營(yíng)養(yǎng)液。
實(shí)驗(yàn)例：
紫杉醇的檢測(cè)：將紅豆杉鮮枝葉清洗干凈，晾干，用粉碎機(jī)粉碎，用10mm網(wǎng)孔粉碎機(jī)粉碎，粉碎粒度為2-10mm，檢測(cè)紫杉醇含量。取適量樣品，精密稱定，用甲醇(色譜純)溶解于10ml或25ml容量瓶中，于超聲波超聲3-5min完全溶解，定容至刻度。取一定量溶解后的樣品，于高速離心機(jī)10000rpm離心5min。取離心后的上清液適量，用注射器通過0.45μm濾膜濾過，注入樣品瓶中，待檢測(cè)。利用高效液相色譜儀對(duì)待檢測(cè)樣品進(jìn)行測(cè)定。檢測(cè)條件：進(jìn)樣量為5μl，c18柱(250x4.6mm)，柱溫25℃，乙腈－水(34：69)等度洗脫10min，再以每分鐘1.75％的速度提高乙腈比例至乙腈－水(45：55)，洗脫至目標(biāo)物質(zhì)完全出峰，得峰面積。利用外標(biāo)法進(jìn)行定量，按干燥品計(jì)，紫杉醇含量不得小于0.3％。
地點(diǎn)：桂林興安山區(qū)，海拔800-1000m
當(dāng)年的6-7月定植，第二年的11-12月取鮮枝葉檢測(cè)。