本發(fā)明屬于蘭花繁殖技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用二葉兜被蘭的花苞片快速繁殖二葉兜被蘭的方法。

背景技術(shù)：

蘭花以其形態(tài)優(yōu)美別致、花色艷麗、色澤豐富、花期長(zhǎng)，被稱為花中之王。二葉兜被蘭更是野生蘭花之精品。二葉兜被蘭為蘭科兜被蘭屬植物，植株高4-24厘米。塊莖圓球形或卵形。莖直立或近直立，其上生有2枚近似對(duì)生的葉。葉近平展或直立伸展，葉片卵形、卵狀披針形或橢圓形，葉上面有時(shí)具少數(shù)或多而密的紫紅色斑點(diǎn)。二葉兜被蘭具有很高的園藝和草藥價(jià)值。繁殖方式為分株繁殖，而且需要每隔三年才可分株一次，分株后每叢至少要保存5個(gè)連結(jié)在一起的假球莖，這種方法的困難是時(shí)間周期長(zhǎng)，符合要求的假球莖少、難度大、成功率低。常規(guī)的繁殖方法難以滿足市場(chǎng)需求，而組織培養(yǎng)是快速繁殖二葉兜被蘭的最有效途徑。1960年，morel提出了離體無(wú)性繁殖蘭花的方法。隨著蘭花的推廣，對(duì)蘭花快繁體系的研究也逐漸深入。各種無(wú)性繁殖技術(shù)成為研究的熱點(diǎn)。但是，由于生物的種間差異，廣義上可適用于蘭花無(wú)性繁殖的技術(shù)，具體到二葉兜被蘭上并不一定可行，因此，二葉兜被蘭的快速繁殖研究仍然是亟待解決的問(wèn)題，其對(duì)保護(hù)兜被蘭屬植物野生資源和促進(jìn)在園林中應(yīng)用均具有現(xiàn)實(shí)意義。

中國(guó)發(fā)明cn104920222a公開(kāi)了蘭花的快速繁殖方法，包括如下步驟:選取蘭花植株的球莖上的芽作為外植體，用洗潔精刷洗干凈并用水沖，40-50min后，然后表面消毒，最后用無(wú)菌水沖洗后，放ms+5.omg/l的6卡氨基腺嘌呤，加50g/l的蔗糖，加7g/l的瓊脂、ph為5.5的培養(yǎng)基中培養(yǎng)誘導(dǎo)成苗，培養(yǎng)條件為:18-22℃、光照強(qiáng)度1200-1400lux，光周期為13h/d，待小苗長(zhǎng)到2～3片葉、葉長(zhǎng)6～7cm時(shí)，用剪刀將葉片剪為0.9～1.1cm長(zhǎng)的葉片。

但上述發(fā)明還不能在保證存活率和蘭花的品質(zhì)前提下，快速的進(jìn)行繁殖且能減少成本和減少污染。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供的二葉兜被蘭花苞片為外植體的組培快速繁殖方法，采用本發(fā)明的方法能夠在短期內(nèi)獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)的試管苗，解決野生二葉兜被蘭品種不能規(guī)模化生產(chǎn)和大面積應(yīng)用存在問(wèn)題。

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供的利用二葉兜被蘭的花苞片快速繁殖二葉兜被蘭的方法，包括如下步驟：

(1)外植體制備步驟：

選取二葉兜被蘭植株的花苞片作為外植體，用洗潔精刷洗干凈并用純蒸水沖洗30min后，在無(wú)菌條件下，用1.5％的次氯酸鈉表面消毒15min，然后用75％酒精表面消毒30s，最后用無(wú)菌水沖洗后備用；

(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得不定芽步驟：

以ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，再添加濃度為0.5-1.0mg/l的6-ba、濃度0.3-0.5mg/l的2，4-d、濃度為0.5-2.0mg/l的kt、濃度為30g/l的蔗糖、濃度為6g/l的硅藻粉和抑菌劑，制成ph為5.8的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將步驟(1)中準(zhǔn)備的花苞片消毒后，置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度在17-23℃，暗光培養(yǎng)60-65天，直至獲得不定芽；

(3)增殖培養(yǎng)不定芽步驟：

以ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加濃度為0.5-1.0mg/l的6-ba、濃度為1.0-3.0mg/l的kt、濃度為0.2-0.4mg/l的2，4-d、濃度為30g/l的蔗糖和濃度為6g/l的硅藻粉和抑菌劑，制成ph為5.8的增殖培養(yǎng)基，將步驟(2)中培養(yǎng)的不定芽置于增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同步驟(2)，直至獲得大量不定芽；

(4)分化培養(yǎng)步驟：

以ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加濃度8.0-10.0mg/l的6-ba、和濃度0.1-0.3mg/l的naa、濃度30g/l的蔗糖、濃度為6g/l的硅藻粉和抑菌劑，制成ph為5.8的分化培養(yǎng)基，將步驟(3)培養(yǎng)的愈傷組織置于分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是：17-23℃、光照強(qiáng)度為1000—1500lux、光周期為15h/d，直至不定芽分化成葉長(zhǎng)為3-4cm的芽苗；

(5)生根培養(yǎng)步驟：

以1/2ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，30g/l蔗糖和5g/l硅藻粉、2g活性炭，制備成ph為5.8的生根培養(yǎng)基，將步驟(4)中培養(yǎng)的芽苗取單苗置于生根培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同步驟(4)，直至芽苗生根獲得二葉兜被蘭生根苗；

(6)煉苗步驟：

待步驟(5)培養(yǎng)的苗根長(zhǎng)到1-3cm時(shí)，將培養(yǎng)瓶的封口膜打開(kāi)，煉苗6-8天；

(7)試管苗移栽步驟：

試管苗移栽基質(zhì)為醋糟和蛭石，基質(zhì)移栽前進(jìn)行高溫消毒，取出步驟(6)培養(yǎng)的小苗用水洗凈根部的培養(yǎng)基，稍晾干表面的水分，即移栽入消毒后的基質(zhì)中，然后搭建拱棚，將拱棚濕度保持在85％-95％、溫度20-25℃，移栽10天后逐漸降低溫度至17-20℃，40天后進(jìn)入后期種植管理。

優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟(2)中再添加濃度為0.75mg/l或0.8mg/l的6-ba、濃度為0.4mg/l的2，4-d、濃度為2.0mg/l的kt、濃度為30g/l的蔗糖、濃度為6g/l的硅藻粉和抑菌劑，制成誘導(dǎo)培養(yǎng)基的ph為5.8。

優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟(3)中添加6-ba的濃度為0.8mg/l、kt的濃度為2.0mg/l、2，4-d的濃度為0.3mg/l、蔗糖的濃度為30g/l和硅藻粉的重量百分比6g/l和抑菌劑，其中增殖培養(yǎng)基的ph為5.8。

優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟(4)中添加6-ba的濃度9.0mg/l、naa的濃度0.2mg/l的、蔗糖的30g/l、硅藻粉的濃度6g/l和抑菌劑，制成分化培養(yǎng)基的ph為5.8，培養(yǎng)條件為：22℃。

優(yōu)選的技術(shù)方案，所述步驟(7)中的試管苗移栽基質(zhì)中的醋糟和蛭石含量至少為80％，其中醋糟和蛭石的重量比為1:1或1.5:1。

優(yōu)選的技術(shù)方案，所述試管苗移栽基質(zhì)還包括10％以上的泥巖和珍珠巖，其中的泥巖：珍珠巖的重量比為3～5：1.5。

優(yōu)選的技術(shù)方案，所述蛭石進(jìn)行碫燒處理，所述碫燒處理的溫度范圍為850°～880°，進(jìn)行碫燒15～20分鐘后，用常溫水或加入食醋的水作為介質(zhì)，進(jìn)行快速冷卻至常溫。

優(yōu)選的技術(shù)方案，所述蛭石的顆粒度為15mm～25mm，所述食醋與水的質(zhì)量百分比為5％。

優(yōu)選的技術(shù)方案，所述后期種植管理包括對(duì)二葉兜被蘭幼苗進(jìn)行干濕間隔補(bǔ)水管理步驟，所述干濕間隔補(bǔ)水管理步驟，包括在10天～15天的范圍內(nèi)絕水管理，進(jìn)行絕水管理后的次日，再進(jìn)行供水灌澆，供水灌澆的次數(shù)間隔保持2小時(shí)1次，共計(jì)澆灌3～4次。

優(yōu)選的技術(shù)方案，所述絕水管理期為14天。

本發(fā)明提供的利用野生二葉兜被蘭的花苞片快速繁殖二葉兜被蘭的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果：

(1)二葉兜被蘭首次采用采用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行無(wú)性繁殖，繁殖率比分株繁殖提高80％。

(2)在蘭科植物組織培養(yǎng)中獨(dú)創(chuàng)性的采用花苞片作為外植體誘導(dǎo)不定芽試管苗，比采用其它外植體生成原球莖在誘導(dǎo)芽和生根時(shí)間縮短三分之一。

(3)采用硅藻粉結(jié)合抑菌劑代替瓊脂粉培養(yǎng)成本節(jié)省三分之二，可使污染率降低90％。

(4)試管苗移栽基質(zhì)使用醋糟+蛭石比分株繁殖的成活率提高90％。

具體實(shí)施方式

下文對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1

本發(fā)明提供的利用二葉兜被蘭的花苞片快速繁殖二葉兜被蘭的方法，包括如下步驟：

(1)外植體制備步驟：

選取二葉兜被蘭植株的花苞片作為外植體，用洗潔精刷洗干凈并用純蒸水沖洗30min后，在無(wú)菌條件下，用1.5％的次氯酸鈉表面消毒15min，然后用75％酒精表面消毒30s，最后用無(wú)菌水沖洗后備用；該步驟的作用是能制備出符合要求的無(wú)菌外植體。

(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得不定芽步驟：

以ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，再添加濃度為0.5-1.0mg/l的6-ba、濃度0.3-0.5mg/l的2，4-d、濃度為0.5-2.0mg/l的kt、濃度為30g/l的蔗糖、濃度為6g/l的硅藻粉和抑菌劑，制成ph為5.8的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將步驟(1)中準(zhǔn)備的花苞片消毒后，置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度在17-23℃，暗光培養(yǎng)60-65天，直至獲得不定芽；本實(shí)施例中，優(yōu)選的，所述步驟(2)中再添加6-ba的濃度為0.75mg/l或0.8mg/l、濃度為0.4mg/l的2，4-d、濃度為2.0mg/l的kt、濃度為30g/l的蔗糖、濃度為6g/l的硅藻粉和抑菌劑0.07g，制成誘導(dǎo)培養(yǎng)基的ph為5.8，該步驟起到的作用是誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，使不定芽的誘導(dǎo)率能達(dá)到92％；

(3)增殖培養(yǎng)不定芽步驟：

以ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加濃度為0.5-1.0mg/l的6-ba、濃度為1.0-3.0mg/l的kt、濃度為0.2-0.4mg/l的2，4-d、濃度為30g/l的蔗糖和濃度為6g/l的硅藻粉和抑菌劑，制成ph為5.8的增殖培養(yǎng)基，將步驟(2)中培養(yǎng)的不定芽置于增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同步驟(2)，直至獲得大量不定芽；該步驟(3)中優(yōu)選的數(shù)值為添加6-ba的濃度為0.8mg/l、kt的濃度為2.0mg/l、2，4-d的濃度為0.3mg/l、蔗糖的濃度為30g/l和硅藻粉的重量百分比6g/l和抑菌劑0.1g，其中增殖培養(yǎng)基的ph為5.8，該步驟的作用是能進(jìn)行不定芽增殖培養(yǎng)。

(4)分化培養(yǎng)步驟：

以ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加濃度為8.0-10.0mg/l的6-ba、和濃度0.1-0.3mg/l的naa、濃度30g/l的蔗糖、濃度為6g/l的硅藻粉和抑菌劑，制成ph為5.8的分化培養(yǎng)基，將步驟(3)培養(yǎng)的愈傷組織置于分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是：17-23℃、光照強(qiáng)度為1000—1500lux、光周期為15h/d，直至不定芽分化成葉長(zhǎng)為3-4cm的芽苗；其中，該步驟(4)中具體的濃度取值為：添加6-ba的濃度9.0mg/l、naa的濃度0.2mg/l的、蔗糖的30g/l、硅藻粉的濃度6g/l和抑菌劑0.1g，制成分化培養(yǎng)基的ph為5.8，培養(yǎng)條件為：22℃。

(5)生根培養(yǎng)步驟：

以1/2ms培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，30g/l蔗糖和5g/l硅藻粉、2g活性炭，制備成ph為5.8的生根培養(yǎng)基，將步驟(4)中培養(yǎng)的芽苗取單苗置于生根培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同步驟(4)，直至芽苗生根獲得二葉兜被蘭生根苗；

(6)煉苗步驟：

待步驟(5)培養(yǎng)的苗根長(zhǎng)到1-3cm時(shí)，將培養(yǎng)瓶的封口膜打開(kāi)，煉苗6-8天，使試管苗能夠盡快適應(yīng)外界環(huán)境。

(7)試管苗移栽步驟：

試管苗移栽基質(zhì)為醋糟和蛭石，基質(zhì)移栽前進(jìn)行高溫消毒，取出步驟(6)培養(yǎng)的小苗用水洗凈根部的培養(yǎng)基，稍晾干表面的水分，即移栽入消毒后的基質(zhì)中，然后搭建拱棚，將拱棚濕度保持在85％-95％、溫度20-25℃，移栽10天后逐漸降低溫度至17-20℃，40天后進(jìn)入后期種植管理。試管苗在上述溫濕度條件下能夠長(zhǎng)出新葉，通過(guò)光合作用完成獨(dú)立生長(zhǎng)過(guò)程。

實(shí)施例2

本實(shí)施例在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上進(jìn)行了進(jìn)一步改進(jìn)，區(qū)別在于：本發(fā)明提供的利用二葉兜被蘭的花苞片快速繁殖二葉兜被蘭的方法，步驟(7)中的試管苗移栽基質(zhì)中的醋糟和蛭石含量為80％以上，其中醋糟和蛭石的重量比為1:1或1.5:1。本實(shí)施例中還可以增加的技術(shù)方案，所述試管苗移栽基質(zhì)還包括10％以上的泥巖和珍珠巖，其中優(yōu)選的泥巖：珍珠巖的重量比為3～5：1.5，經(jīng)過(guò)多種組份和配合，用來(lái)提高不同營(yíng)養(yǎng)成分的供給，保證其有不同的縫隙，利用空氣中氧氣的吸收。

本實(shí)施例中，所述蛭石進(jìn)行碫燒處理，所述碫燒處理的溫度范圍為850°～880°，進(jìn)行碫燒15～20分鐘后，用常溫水或加入食醋的水作為介質(zhì)，進(jìn)行快速冷卻至常溫，當(dāng)常溫水作為介質(zhì)進(jìn)行快速冷卻時(shí)，碫燒處理后的蛭石不僅能夠膨脹，還能得到消毒的效果。所述食醋與水的質(zhì)量百分比為5％，當(dāng)使用加入食醋的水作為介質(zhì)時(shí)，還會(huì)取得對(duì)蛭石表面酸化，使蛭石的無(wú)機(jī)鹽析出的多，使二葉兜被蘭得到充足的養(yǎng)分。本實(shí)施例中，其中所述蛭石的顆粒度范圍為15mm～25mm，優(yōu)選為15mm的蛭石，這個(gè)規(guī)格的蛭石，更利于二葉兜被蘭進(jìn)行有氧呼吸，進(jìn)行光合作用。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供的利用野生二葉兜被蘭的花苞片快速繁殖二葉兜被蘭的方法，所述后期種植管理包括對(duì)二葉兜被蘭幼苗進(jìn)行干濕間隔補(bǔ)水管理步驟，所述干濕間隔補(bǔ)水管理步驟，包括在10天～15天的范圍內(nèi)絕水管理，進(jìn)行絕水管理后的次日，再進(jìn)行供水灌澆，供水灌澆的次數(shù)間隔保持2小時(shí)1次，共計(jì)3～4次。本實(shí)施例，所述絕水管理選擇為14天，利用絕水期的管理，使幼苗的根系提高適用能力，在水多時(shí)，根系進(jìn)行快速吸收水分，在缺水時(shí)，根系進(jìn)行防護(hù)，能使幼苗的根系生長(zhǎng)更發(fā)達(dá)。

上面對(duì)本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方式和實(shí)施例作了詳細(xì)說(shuō)明，但是本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式和實(shí)施例，在本領(lǐng)域技術(shù)人員所具備的知識(shí)范圍內(nèi)，還可以在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下做出各種變化。