本發(fā)明涉及紅火蟻的防治技術(shù)，具體涉及一種利用RNA干擾防治紅火蟻的方法及降低紅火蟻抗藥性的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的基因調(diào)控方法(Matzke,2001)。即利用外源或內(nèi)源的雙鏈RNA(dsRNA)特異性地引起基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象。它利用RNA序列匹配，專一地識(shí)別靶基因，在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平或翻譯水平抑制靶基因表達(dá)，已被廣泛用于基因功能研究、疾病治療和農(nóng)業(yè)應(yīng)(Waterhouse,2003；Matthew,2004)，目前，RNAi技術(shù)已被應(yīng)用于鱗翅目、直翅目、膜翅目(意大利蜜蜂)、同翅目、雙翅目瞪昆蟲。昆蟲RNAi的方法主要有注射、浸泡、喂食、轉(zhuǎn)基因和病毒介導(dǎo)等方法。比較常用的是注射和飼喂兩種方法。注射dsRNA到昆蟲中以抑制基因表達(dá)，這種方法的主要優(yōu)點(diǎn)是效率高，但也有一些缺點(diǎn)。通過喂食dsRNA操作簡單方便，容易實(shí)現(xiàn)。通過飼喂dsRNA已在半翅目、鞘翅目和鱗翅目昆蟲取得成功(Baum et al.,2007；Mao et al.,2007)。

紅火蟻(S.invicta)是最具有入侵性的社會(huì)性昆蟲，已經(jīng)被國際上列為最具入侵性和破壞性的百種外來有害生物之一。紅火蟻食性復(fù)雜、習(xí)性兇猛、繁殖迅速、競爭力強(qiáng)，能造成重大經(jīng)濟(jì)損失、社會(huì)危害和環(huán)境影響，紅火蟻的雜食性和攻擊性使其不僅是一種經(jīng)濟(jì)害蟲，還威脅到公眾健康?；瘜W(xué)防治措施仍然是防治紅火蟻有效措施，但仍然不能根除紅火蟻。而且長期用化學(xué)藥劑對(duì)紅火蟻進(jìn)行控制，會(huì)導(dǎo)致意想不到的反彈。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明利用飼喂dsRNA方法分別干擾紅火蟻工蟻CYP6A1-like和CYP4C1-like兩個(gè)P450基因，并檢測紅火蟻工蟻對(duì)外源化合物的的敏感度和酶活性的變化，進(jìn)一步明確CYP6A1和CYP4C1的解毒代謝功能。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種利用RNA干擾防治紅火蟻的方法，向紅火蟻飼喂制得的dsRNA。

本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)包括：

向飼喂過dsRNA的紅火蟻施用氟蟲腈和/或毒死蜱。

所述的dsRNA是dsCYP6A1-like和/或dsCYP4C1-like。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備上述dsRNA的方法，通過dsCYP6A1-like和dsCYP4C1-like的CDs區(qū)域來設(shè)計(jì)合成dsRNA。

本發(fā)明還提供了dsCYP6A1-like在降低紅火蟻對(duì)氟蟲腈抗藥性中的應(yīng)用。

附圖說明

圖1是以dsGFP(288bp)，dsCYP6A1-like(376bp)和dsCYP4C1-like(419bp)為靶基因的dsRNA合圖。

圖2a是RNAi介導(dǎo)的dsCYP6A1-like對(duì)CYP6A1-like和CYP4C1-like mRNA的沉默效果檢測。

圖2b是RNAi介導(dǎo)的dsCYP4C1-like對(duì)CYP6A1-like和CYP4C1-like mRNA的沉默效果檢測。

圖3a是RNAi介導(dǎo)的dsCYP6A1-like對(duì)其它P450mRNA的影響檢測。

圖3b是RNAi介導(dǎo)的dsCYP4C1-like對(duì)其它P450mRNA的影響檢測。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源和飼養(yǎng)

供試紅火蟻采自廣東廣州五山。參照Kuriachan等方法，用大塑料桶從田間采回紅火蟻蟻群，放置1-2d，待蟻群在桶內(nèi)建立了新的群落后，將自來水緩慢滴入桶內(nèi)，令紅火蟻從群落中自動(dòng)上移、浮出。用40目的撈網(wǎng)將蟻群轉(zhuǎn)入盆口涂以爽身粉的塑料盆(7.0L)中，在室內(nèi)(室溫25℃,RH 65％-80％)用人工飼料飼養(yǎng)一周后供試驗(yàn)用。工蟻、兵蟻、有翅雄蟻、有翅雌蟻和蟻后和幼蟻的判斷標(biāo)準(zhǔn)參考曾玲等(2005)方法。

1.2 主要試劑

TRIzol Reagent，Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG Kit。

La Taq聚合酶，PrimeScript 1st strand cDNA synthesize kit，DNase I(Takara)。

QIAquick PCR產(chǎn)物回收試劑盒。

RNAi試劑盒。

1.3 主要儀器

5417R冷凍離心機(jī)，Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(jì)，Mastercycler Personal PCR儀，mini-sub cell GT型電泳槽，power/PAC 3000型電泳儀，Kodak電泳凝膠成像儀，熒光定量PCR儀ABI 7500System，微量操作系統(tǒng)Nanoliter 2000/B203XVB。

1.4 含T7啟動(dòng)子的模板DNA制備

1.4.1 T7啟動(dòng)子引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI報(bào)道EST設(shè)計(jì)特異性引物(Table4-1)，采用5’-RACE和3’-RACE技術(shù)，克隆獲得4條紅火蟻P450全長cDNA序列，克隆的紅火蟻核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列已經(jīng)提交GenBank分別命名為CYP6A1(Accession No:KF547037)，CYP6A14(Accession No:KF547038)，CYP4C1(Accession No:KM006494)(附表1-1)，和CYP4G15(Accession No:KM006495)(附表1-2)。CYP6A1的全長cDNA序列2064bp，包含一個(gè)1497bp的開放閱讀框(ORF)，一個(gè)238bp的5’非編碼區(qū)(5’UTR)和一個(gè)293bp的帶有加尾信號(hào)的3’非編碼區(qū)(3’UTR)。開放閱讀框從239個(gè)核苷酸開始，終止于第1771個(gè)核苷酸，由其推導(dǎo)的氨基酸序列以甲硫氨酸為起始氨基酸，長為499個(gè)氨基酸。該基因的氨基酸殘基中均含有昆蟲P450蛋白的5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(Feyereisen,2005)，wxxxR(螺旋C,127-131)，AGxE/DT(螺旋I,302-307)，ExxR(螺旋K,360-383)，PxxFxPxRF(PERF,411-419)，PFxxGxRxCxG(血紅素結(jié)合區(qū),434-445)，而且這些保守結(jié)構(gòu)域，特別是與分子氧結(jié)合的功能活性位點(diǎn)螺旋I和P450蛋白特有的血紅素結(jié)合區(qū)。

CYP6A14的全長cDNA序列有1950bp，包含一個(gè)1500bp的開放閱讀框(ORF)，一個(gè)211bp的5’非編碼區(qū)(5’UTR)和一個(gè)176bp的帶有加尾信號(hào)的3’非編碼區(qū)(3’UTR)。開放閱讀框從212個(gè)核苷酸開始，終止于第1774個(gè)核苷酸，由其推導(dǎo)的氨基酸序列以甲硫氨酸為起始氨基酸，長為500個(gè)氨基酸。該基因的氨基酸殘基中均含有昆蟲P450蛋白的5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(Feyereisen,2005)，wxxxR(螺旋C,128-132)，AGxE/DT(螺旋I,303-308)，ExxR(螺旋K,361-384)，PxxFxPxRF(PERF,412-420)，PFxxGxRxCxG(血紅素結(jié)合區(qū),435-446)，而且這些保守結(jié)構(gòu)域，特別是與分子氧結(jié)合的功能活性位點(diǎn)螺旋I和P450蛋白特有的血紅素結(jié)合區(qū)。該基因還在N端具有由脯氨酸，甘氨酸富集而成的高度疏水性質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域(P/I)PGPx(P/G)xP，而這是微粒體P450基因的代表性特征(Bassett et a1.,1997)，預(yù)測認(rèn)為CYP6A1和CYP6A14是一類穩(wěn)定蛋白家族一員，這些為CYP6A1和CYP6A14蛋白的表達(dá)和純化和植物介導(dǎo)的RNAi研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

附表1.紅火蟻CYP4C1與CYP4G15堿基和推測氨基酸序列圖

1.1 紅火蟻CYP4C1堿基和推測氨基酸序列

附表1-11

附表1-11.紅火蟻CYP6A1(Accession No:KF547037)核酸和推導(dǎo)的氨基酸序列。方格部分表示昆蟲P450蛋白的5個(gè)保守域，依次為螺旋C，螺旋I，螺旋K，PDVF和血紅素結(jié)合域。起始密碼子用下劃線標(biāo)出和“*”表示終止密碼子。下劃線表示跨膜區(qū)位置。

1.2 紅火蟻CYP4G15堿基和推測氨基酸序列

附表1-22

附表1-22.紅火蟻CYP6A14(Accession No:KF547038)核酸和推導(dǎo)的氨基酸序列。方格部分表示昆蟲P450蛋白的5個(gè)保守域，依次為螺旋C，螺旋I，螺旋K，PDVF和血紅素結(jié)合域。起始密碼子用下劃線標(biāo)出和“*”表示終止密碼子。下劃線表示跨膜區(qū)位置。

得到的兩個(gè)P450基因CYP6A1-like和CYP4C1-like，利用在線primer3設(shè)計(jì)引物，引物名稱分別為T7CYP6A1-like和T7CYP4C1-like。引物5’端添加T7啟動(dòng)子序列，引物序列盡量避開P450同源基因保守區(qū)。

dsRNA的DNA模板擴(kuò)增引物

合成dsRNA模板的制備

在0.25ml PCR管中建立總體積為50μl的RT-PCR反應(yīng)體系(USP擴(kuò)增用)：

在0.25ml PCR管中建立總體積為50μl的RT-PCR反應(yīng)體系(EcR擴(kuò)增用)：

PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3min后，5個(gè)循環(huán)：94℃變性30sec，58℃退火40sec，72℃延伸40sec；之后再35個(gè)循環(huán)：94℃變性30sec，68℃退火40sec，72℃延伸40sec。最后72℃延伸10min。電泳檢測確認(rèn)所擴(kuò)增條帶是否為設(shè)計(jì)的目的條帶，有無特異性擴(kuò)增。

1.4.4 PCR產(chǎn)物純化

確認(rèn)目的條帶大小正確，無特異性擴(kuò)增。采用QIAquick PCR產(chǎn)物回收試劑盒按照說明書純化PCR產(chǎn)物。獲得的DNA作為dsRNA合成的模板。

1.5 dsRNA的制備

1.5.1 洗脫液準(zhǔn)備

在2×Wash Solution中加12ml 100％乙醇(化學(xué)分析純)，充分混勻，室溫貯存。

1.5.2 體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

冰上溶解含有T7的酶混合溶液，待用；室溫溶解10×T7反應(yīng)緩沖液和4種核苷酸溶液(ATP，CTP，GTP，和UTP)，前者置于室溫待用，后者則置于冰上待用。

建立20μl的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下：

輕彈使其充分混勻，而后輕微離心。37℃恒溫水浴過夜。

1.5.3 核酸酶消化去除模板DNA和ssRNA

冰上操作，建立以下反應(yīng)體系：

37℃恒溫水浴1h。

1.5.4 dsRNA的純化

按以下體系準(zhǔn)備dsRNA結(jié)合混合液：

將上述500μl dsRNA混合液吸入一個(gè)事先放置在收集管中的Filter Cartridge過濾柱中，以最大速度離心2min。

棄去廢液，將Filter Cartridge過濾柱重新置于原來的收集管中。

向Filter Cartridge過濾柱中加入500μl事先配制好的2×Washing Solution，最大速度離心2min。重復(fù)4次)。棄去廢液，再以最大速度離心10-30sec，干燥柱子。

將Filter Cartridge過濾柱置于一新的收集管中，加入100μl事先煮沸(>95℃)的Nuclease-free Water，最大速度離心2min。重復(fù)7次)。

1.5.5 dsRNA質(zhì)量和濃度檢測

Nanodrop 2000檢測dsRNA濃度，并取稀釋100倍后的dsRNA于1.0％的瓊脂糖凝膠電泳檢測dsRNA的質(zhì)量；-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.6.1 紅火蟻工蟻飼喂方法

選取大小一致的工蟻飼喂(1.26mg/頭)。試蟲放置于正常條件下飼養(yǎng)，放置12h后開始飼喂dsRNA，每隔24h重新飼喂。飼喂后，每隔24h取樣，通過qTRT-PCR技術(shù)檢測試蟲mRNA表達(dá)，檢測沉默效率。

表3.RNAi處理設(shè)置

注：dsRNA溶液用含0.1％蜂蜜水配制?！?-“代表1ml各自dsRNA溶液。

1.6.2 dsRNA處理后試蟲對(duì)氟蟲腈和毒死蜱的敏感度測定

選擇大小一致的紅火蟻飼喂dsRNA24h后開始毒力測定試驗(yàn)，試蟲按表3設(shè)置進(jìn)行敏感度測定。敏感度測定同樣采用藥膜法，藥劑濃度為LC₅₀，氟蟲腈LC₅₀為0.05μg/ml(小工蟻)。對(duì)照組飼喂dsGFP蜂蜜水溶液，處理組飼喂相應(yīng)的dsRNA的蜂蜜水溶液，對(duì)照組和處理組均用氟蟲腈和毒死蜱分別處理。每個(gè)處理15頭試蟲，共三次重復(fù)。之后均喂食含0.1％蜂蜜水溶液。試蟲每隔24h調(diào)查死亡率。運(yùn)用GraphPad InStat軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(one-wayANOVAand Tukey’s test,P<0.05)。

表4.dsRNA處理后試蟲的敏感度測定

注：處理后用含0.1％蜂蜜水溶液喂食?！?-“代表15頭各自dsRNA處理試蟲。

1.7 檢測干擾效率

飼喂后每隔24h取樣，檢測RNAi的沉默效率。樣品總RNA提取和cDNA第一鏈合成方法如下：

總RNA提取和純化

RNA提取所用的勻漿器、槍頭、鑷子、離心管、PCR管用1‰DEPC水37℃浸泡處理過夜，高壓滅菌干燥后備用；所有試劑以DEPC處理過的ddH₂O配制；實(shí)驗(yàn)過程中需勤換手套。條件具備的情況下，最好直接購買RNase-Free耗材。。

總RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司，據(jù)Reagent說明書改進(jìn)成棉鈴蟲總RNA提取方法，具體步驟如下：

1)稱取組織50-100mg于洗凈烘干勻漿器中，加入1ml TRIzol，充分勻漿，室溫靜置5min，4℃，12,000rpm，離心5min，棄沉淀；

2)加入200μl氯仿/1ml TRIzol，混勻20sec，室溫靜置5min；4℃，12，000rpm，離心15min；

3)吸取上清液400μl于一新的RNases-Free離心管，加入800μl異丙醇，室溫靜置片刻(視沉淀量大小而定)；4℃，12,000rpm，離心15-20min，棄上清；

4)向沉淀中加入用RNases-Free H₂O配制的75％乙醇500μl，顛倒洗滌沉淀，4℃，7,500rpm，離心10min；

5)棄上清，沉淀室溫干燥5-10min；

6)加入30-50μl RNase-free H₂O；亦可55-60℃水浴，助溶10min；

7)紫外分光光度計(jì)檢測RNA的濃度和純度，記錄OD 260/280值和RNA濃度值；

8)0.7％瓊脂糖，凝膠電泳檢測RNA完整性；

RNA樣品保存于-80℃?zhèn)溆?用于熒光定量PCR的RNA還需進(jìn)行DNA的消化)。

cDNA第一鏈的合成

按TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit)說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成RT-PCR cDNA模板，具體步驟如下：

1)按表4-2，建立總體積為12μl的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。

表4-2.反轉(zhuǎn)錄體系(1)

Table 4-2.Reverse transcription system(1)

70℃水浴10min，冰上急冷2min以上，低速離心數(shù)秒，使反應(yīng)混合液聚集管底；

2)按表4-3，向上述反應(yīng)液中加入以下預(yù)混物，建立20μl反應(yīng)體系。

表4-3.反轉(zhuǎn)錄體系(2)

Table 4-3.Reverse transcription system(2)

3)混勻，PCR儀中按下列條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：

42℃60min；70℃15min；4℃10min。

反應(yīng)完成后，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA置于-20℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

以18S rRNA為內(nèi)參基因，熒光定量條件和數(shù)據(jù)分析同第五章。

2結(jié)果與分析

2.1 dsRNA的合成

取稀釋后的dsRNA合成產(chǎn)物3μl在1.0％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測，在預(yù)期位置處均出現(xiàn)了一條清晰鮮亮的條帶，說明dsRNA與我們設(shè)計(jì)的大小一致，且質(zhì)量較好，并沒有出現(xiàn)其它非特異性擴(kuò)增條帶(圖1)。圖1.以dsGFP(288bp)，dsCYP6A1-like(376bp)和dsCYP4C1-like(419bp)為靶基因的dsRNA合圖。其中：M:DL2000；1:dsGFP(288bp)；2:dsCYP6A1-like(376bp)；3:dsCYP4C1-like(419bp)

2.2 紅火蟻RNAi介導(dǎo)的CYP6A1和CYP4C1mRNA的沉默效果

根據(jù)CYP6A1-like和CYP4C1-like的CDs區(qū)分別針對(duì)CYP6A1-like和CYP4C1-like設(shè)計(jì)的特異性dsRNA引物，避免同源基因的保守區(qū)。按表1設(shè)置的濃度，飼喂紅火蟻工蟻，每隔24h取樣檢測mRNA表達(dá)量。圖2中A和B分別顯示飼喂dsRNA后不同時(shí)間CYP6A1-like和CYP4C1-like的相對(duì)表達(dá)量。飼喂dsCYP6A1-like和dsCYP4C1-like 24h后，CYP6A1-like和CYP4C1-like mRNA表達(dá)量均顯著下降；飼喂dsCYP6A1-like和dsCYP4C1-like 48h后，CYP6A1-like和CYP4C1-like mRNA表達(dá)量下降達(dá)到最低值，與對(duì)照組相比，沉默效率分別達(dá)到64.6％和77.1％，隨著時(shí)間的推移，CYP6A1-like和CYP4C1-like mRNA表達(dá)量仍然保持下調(diào)水平(圖2A，B)。從總體上看，CYP6A1-like和CYP4C1-like的均取得理想的干擾效果而且CYP6A1-like下調(diào)水平更為平穩(wěn)。

圖2.RNAi介導(dǎo)的dsCYP6A1-like和dsCYP4C1-like分別對(duì)CYP6A1-like和CYP4C1-likemRNA的沉默效果檢測。圖下方的*表示同一時(shí)間段內(nèi)對(duì)照組與處理組差異顯著(P<0.05)。注：A:dsCYP6A1-like，B:dsCYP4C1-like.

2.3 RNAi介導(dǎo)的dsCYP6A1-like和dsCYP4C1-like對(duì)其它同源P450基因的影響

RNAi介導(dǎo)的dsCYP6A1-like和dsCYP4C1-like分別對(duì)CYP6A1-like和CYP4C1-like mRNA的沉默效果較為理想。因此，本文也驗(yàn)證RNAi介導(dǎo)的dsCYP6A1-like和dsCYP4C1-like對(duì)其它同源P450基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，飼喂紅火蟻dsCYP6A1-like 36h后，RNAi介導(dǎo)的dsCYP6A1-like處理組對(duì)CYP4C1-like、CYP4AB1、CYP4AB2和CYP4G15-like mRNA均沒有顯著的干擾，分別為對(duì)照組(dsGFP)的0.97、1.23、1.24和0.98倍；其中,只有CYP6A14-like有顯著性升高，為對(duì)照組(dsGFP)的1.27倍(圖3.A)。飼喂紅火蟻dsCYP4C1-like 36h后，RNAi介導(dǎo)的dsCYP4C1-like處理組對(duì)CYP6A1-like、CYP4AB2和CYP4G15-like mRNA均沒有顯著的干擾，分別為對(duì)照組(dsGFP)的1.1、1.1、1.2倍；其中,CYP6A14-like和CYP4AB1和有顯著性升高，為對(duì)照組(dsGFP)的1.3倍和1.9倍(圖3.B)。

圖3.RNAi介導(dǎo)的dsCYP6A1-like和dsCYP4C1-like分別對(duì)其它P450mRNA的影響檢測。

注：不同字母表示同一基因?qū)φ战M與處理組差異顯著(P<0.05)。A:dsCYP6A1-like，B:dsCYP4C1-like。

2.4 飼喂dsCYP6A1-like和dsCYP4C1-like后紅火蟻工蟻對(duì)氟蟲腈敏感度的變化

飼喂紅火蟻工蟻dsCYP6A1-like和dsCYP4C1-like后，分別用氟蟲腈LC₅₀(0.05μg/ml)處理，檢測其對(duì)藥劑的敏感度。如表5所示，分別飼喂紅火蟻工蟻兩種dsRNA 12h后，處理組(dsCYP6A1-like)死亡率在12、24、36、48和60h顯著高于對(duì)照組，分別為對(duì)照組(dsGFP)的3.2、3.89、1.65、1.23和1.16倍，其中飼喂24h時(shí)，處理組(dsCYP6A1-like)與對(duì)照組(dsGFP)死亡率比值達(dá)到最高(3.89倍)，之后顯著降低；而處理組(dsCYP4C1-like)死亡率在12、24、36、48和60h均稍微低于對(duì)照組。分別是對(duì)照組(dsGFP)的0.6、0.78、0.63、0.83和0.95倍。其中飼喂60h時(shí)，處理組與對(duì)照組死亡率比值達(dá)到最高。

表5.飼喂dsRNACYP6A1和dsCYP4C1后紅火蟻工蟻對(duì)氟蟲腈的毒力測定

注:數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，不同小寫字母表示同一時(shí)間內(nèi)不同處理差異顯著(ANOVA,P<0.05)。括號(hào)內(nèi)為處理組與對(duì)照的比值。

2.5 RNAi對(duì)紅火蟻P450酶活性的影響

采用飼喂dsRNA方式處理紅火蟻后，測定細(xì)胞色素P450酶活性結(jié)果見表6。結(jié)果顯示，處理組(dsCYP6A1-like)P450活性在12、24、48和72h均低于對(duì)照組(dsGFP)，分別為對(duì)照組(dsGFP)的0.85、0.56、0.33和0.45倍，48-72h達(dá)到最低值，之后稍微回升。而處理組(dsCYP4C1)P450酶活性在12、24、48和72h P450酶活性均高于對(duì)照組(dsGFP)，分別為對(duì)照組的1.22、1.50、1.48和1.32倍，48-72h達(dá)到最大值，之后稍微降低。

表6 dsRNA處理后的紅火蟻工蟻P450O-脫甲基活性

注：表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，不同小寫字母表示同一時(shí)間點(diǎn)不同處理差異顯著(ANOVA,P<0.05)，P450脫甲基活性(μmol p-nitrophenol/mg/30min protein)，括號(hào)內(nèi)數(shù)值為同一時(shí)間點(diǎn)處理組與對(duì)照組的比值。

RNA干擾(RNA interference)是近年來迅速發(fā)展的一項(xiàng)新興基因阻斷技術(shù)。RNA干擾的干擾方法很多，但最常用的是飼喂和注射兩種方法。通過喂食的方法實(shí)現(xiàn)RNA干擾，是指昆蟲腸道細(xì)胞吸收體外dsRNA后，對(duì)周圍的腸道細(xì)胞起到干擾沉默的效果即非系統(tǒng)性RNA干擾(environmental RNAi)。飼喂dsRNA與注射的方法相比，喂食的方法不會(huì)損害生物體，通過轉(zhuǎn)基因到植物體，使害蟲取食轉(zhuǎn)基因植物后抗藥性相關(guān)基因沉默而死亡。通過喂食的方法在鱗翅目的研究中取到了很大的進(jìn)展。

本發(fā)明通過dsCYP6A1-like和dsCYP4C1-like的CDs區(qū)域來設(shè)計(jì)合成dsRNA，通過飼喂方法測定靶標(biāo)基因和其它同源P450基因沉默效果，和對(duì)外源化合物的敏感度測定，明確紅火蟻P450對(duì)外源化合物的解毒代謝作用。本發(fā)明通過qRT-PCR技術(shù)檢測沉默效果，結(jié)果表明，飼喂dsRNA 24h后，RNAi介導(dǎo)的dsCYP6A-like 1和dsCYP4C1-like分別對(duì)CYP6A1-like和CYP4C1-like mRNA的沉默效果顯著，與對(duì)照組相比，達(dá)到沉默效率分別達(dá)到64.6和77.1％。RNAi介導(dǎo)的dsCYP6A1和dsCYP4C1對(duì)其它同源P450基因表達(dá)的影響顯示，飼喂紅火蟻dsCYP6A1-like 36h后，RNAi介導(dǎo)的dsCYP6A1-like處理組對(duì)CYP4C1-like、CYP4AB1、CYP4AB2和CYP4G15-like mRNA均沒有顯著的干擾，分別為對(duì)照組(dsGFP)的0.97、1.23、1.24和0.98倍；其中,只有CYP6A14-like有顯著性升高，為對(duì)照組(dsGFP)的1.27倍。飼喂紅火蟻dsCYP4C1-like 36h后，RNAi介導(dǎo)的dsCYP4C1-like處理組對(duì)CYP6A1-like、CYP4AB2和CYP4G15-like mRNA均沒有顯著的干擾，分別為對(duì)照組(dsGFP)的1.1、1.1和1.2倍；其中,只有CYP6A14-like有顯著性升高，為對(duì)照組(dsGFP)的1.3和1.9倍。從敏感度測定結(jié)果看，分別飼喂兩種dsRNA 12h后，分別用氟蟲腈LC₁₀(0.05μg/ml)處理，檢測其對(duì)藥劑的敏感度。

分別飼喂紅火蟻工蟻兩種dsRNA 12h后，處理組(dsCYP6A1-like)死亡率在12、24、36、48和60h顯著高于對(duì)照組，分別為對(duì)照組(dsGFP)的3.2、3.89、1.65、1.23和1.16倍，其中飼喂24h時(shí)，處理組(dsCYP6A1-like)與對(duì)照組(dsGFP)死亡率比值達(dá)到最高(3.89倍)，之后顯著降低；而處理組(dsCYP4C1-like)死亡率在12-、24、36、48和60h均稍微低于對(duì)照組。分別是對(duì)照組(dsGFP)的0.6、0.78、0.63、0.83和0.95倍。其中飼喂60h時(shí)，處理組與對(duì)照組死亡率比值達(dá)到最高。從P450酶活性分析，處理組(dsCYP6A1-like)P450活性在12、24、48和72h均低于對(duì)照組(dsGFP)，分別為對(duì)照組(dsGFP)的0.85、0.56、0.33和0.45倍，48-72h達(dá)到最低值，之后稍微回升。而處理組(dsCYP4C1-like)P450酶活性在12、24、48和72h P450酶活性均高于對(duì)照組(dsGFP)，分別為對(duì)照組的1.22、1.50、1.48和1.32倍，48-72h達(dá)到最大值，之后稍微降低。這充分表明CYP6A1-like對(duì)氟蟲腈有較強(qiáng)解毒代謝作用，而非CYP4C1-like，反而間接表明CYP6A14-like和CYP4AB2有可能參與氟蟲腈解毒，致使處理組(dsCYP4C1-like)死亡率低于對(duì)照組(dsGFP)，以和P450酶活性升高。Bautista(2009)研究表明小菜蛾CYP6BG1的敲除，降低了幼蟲對(duì)芐氯菊酯(permethrin)的抗藥性。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。