本發(fā)明屬于遠(yuǎn)緣雜交育種技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種玉米與高粱雜交的方法。

背景技術(shù)：

在作物改良中,常利用植物屬間的遠(yuǎn)緣雜交,將異種植物的有用性狀向栽培種轉(zhuǎn)移。植物遠(yuǎn)緣雜交的難易程度一般由兩親本親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近所決定。目前玉米已經(jīng)與野生二倍體大芻草、薏米、摩擦禾、水稻等作物通過常規(guī)手段已經(jīng)進(jìn)行了雜交并得到了相關(guān)的材料。吉林省農(nóng)科院利用花粉管通道法的方法把高粱基因組導(dǎo)入到玉米植株中得到一批新的種質(zhì)資源，并未使用簡單的傳統(tǒng)授粉方法。

1985年Bernard等進(jìn)行玉米與高粱雜交沒有成功。現(xiàn)有技術(shù)只是進(jìn)行了花粉管通道法的轉(zhuǎn)基因方法的雜交，沒有進(jìn)行傳統(tǒng)的遠(yuǎn)緣雜交授粉。到目前為止，未見報(bào)道玉米與高粱通過常規(guī)授粉雜交成功的案例?，F(xiàn)有技術(shù)沒有做成功主要可能和所用的親本材料的基因型、授粉方式、授粉前處理、授粉時(shí)間等因素有直接的關(guān)系。現(xiàn)有技術(shù)只是使用任意玉米材料和高粱材料雜交，沒有選擇到合適的基因型，同時(shí)現(xiàn)有技術(shù)只是直接授粉，沒有經(jīng)過預(yù)處理和授粉時(shí)間的選擇。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種玉米與高粱雜交的方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)只是使用任意玉米材料和高粱材料雜交，沒有選擇到合適的基因型，同時(shí)現(xiàn)有技術(shù)只是直接授粉，沒有經(jīng)過預(yù)處理和授粉時(shí)間的選擇的問題。本發(fā)明擬通過該技術(shù)手段解決玉米與高粱授粉的結(jié)實(shí)問題，提高玉米結(jié)實(shí)率。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種玉米與高粱雜交的方法，所述玉米與高粱雜交的方法通過對(duì)玉米母本授粉前處理和授粉兩道程序獲得雜交種質(zhì)；通過表型和分子鑒定技術(shù)對(duì)雜交后代進(jìn)行鑒定，確定為真雜種；

具體包括：授粉前取玉米花粉，放入研缽中，加入去離子水，去離子水加入量是花粉的3倍，搖研磨10分鐘～30分鐘，然后倒入試管中，用干凈毛刷把研磨液體刷到花絲上；

授粉：花絲涂抹2小時(shí)～12小時(shí)后，取父本高粱花粉，把高粱花粉授予處理過花絲的玉米雌穗上。

進(jìn)一步，所述玉米母本為wysc7親本材料；父本高粱花粉為s332。

進(jìn)一步，對(duì)授粉后的處理過花絲的玉米雌穗和未處理的雌穗分別掛牌標(biāo)記。

本發(fā)明另一目的在于提供一種上述玉米與高粱雜交的方法獲得的真雜種及其后代。

本發(fā)明解決了玉米與高粱雜交結(jié)實(shí)性不好的問題，使結(jié)實(shí)穗數(shù)提高了4倍，結(jié)實(shí)粒數(shù)提高了321倍(表1)，達(dá)到了高粱抗逆基因?qū)胗衩字械哪康?如附圖2、3)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)至今尚未有玉米與高粱雜交成功的報(bào)道，通過授粉前處理可以獲得大量后代；(2)通過表型分析和分子鑒定技術(shù)對(duì)雜交后代進(jìn)行了鑒定，利用1個(gè)標(biāo)記(5號(hào))對(duì)23個(gè)F1單株進(jìn)行鑒定，有14個(gè)單株有高粱基因組片段，14個(gè)單株被確定為真雜種，比例達(dá)到60.87％。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的玉米與高粱雜交的方法流程圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的利用26對(duì)SSR標(biāo)記篩選母本和父本，得到只在父本(高粱)基因組上能擴(kuò)增出的標(biāo)記12對(duì)圖。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的用5號(hào)標(biāo)記擴(kuò)增23個(gè)F1植株，14個(gè)單株可以擴(kuò)增出產(chǎn)物，其它單株沒有擴(kuò)增出結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)描述。

如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例提供的玉米與高粱雜交的方法，包括：

S101：授粉前處理：在授粉前取玉米(wysc7)花粉，放入研缽中，加入去離子水，去離子水加入量是花粉的3倍，搖研磨10-30分鐘，然后倒入試管中，用干凈毛刷把研磨液體刷到花絲上(保證不能竄粉)。

S102：授粉：花絲涂抹2-12小時(shí)后，取高粱花粉，把高粱(S332)花粉授予處理過花絲的玉米雌穗上，分別授粉100穗，分別掛牌標(biāo)記。

下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。

本發(fā)明基因型選擇：由于本發(fā)明使用的材料直接預(yù)處理，沒有進(jìn)行選擇。由于育種材料的更新，現(xiàn)有的材料更加適合遠(yuǎn)源雜交，前人沒有做成功可能是由于基因型不合適。

本發(fā)明授粉前預(yù)處理：授粉成功的第一步是要形成花粉管，遠(yuǎn)緣雜交成功率低主要是沒有形成花粉管，所以玉米花粉中有一種酶或者什么物質(zhì)促進(jìn)花粉管的形成，為了使花粉失去活力，本發(fā)明使用水使花粉失去活力不能受精成功，通過研磨促進(jìn)花粉中的酶或的其它促進(jìn)花粉管的物質(zhì)外滲，然后涂抹花絲，形成花粉管(沒有觀察花粉管形成)。

本發(fā)明的授粉時(shí)間，由于涂抹花絲后花絲帶水，如果這時(shí)授粉可能使高粱花粉破裂失活，所以本發(fā)明選擇2-12小時(shí)，在該時(shí)段授粉結(jié)實(shí)較高，超過12小時(shí)顯著降低。

本發(fā)明所用的親本材料母本是玉米wysc7，父本高粱s332，均來自***農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心。

經(jīng)過玉米和高粱授粉后，不同處理間的玉米結(jié)實(shí)情況差異顯著。授粉前未處理的結(jié)實(shí)穗數(shù)為25個(gè)(25％)，結(jié)實(shí)總粒數(shù)是38粒種子，處理后結(jié)實(shí)穗數(shù)是100個(gè)(100％)，結(jié)實(shí)總粒數(shù)是12216粒種子(表1)。對(duì)結(jié)實(shí)的F1代種子于2016年5月種植于**********實(shí)驗(yàn)基地，通過與父母本表型比較，F(xiàn)2代群體表現(xiàn)出顯著的表型分離，可以發(fā)現(xiàn)雜交成功。

表1不同處理下100穗玉米與高粱雜交授粉結(jié)實(shí)情況統(tǒng)計(jì)

實(shí)施例2.

玉米與高粱基因組重組驗(yàn)證

選取26對(duì)高粱特異SSR分子標(biāo)記(表2)，篩選wys7和S332的基因組DNA，選取只是在S233中能擴(kuò)增出的標(biāo)記作為F1中鑒定標(biāo)記。DNA提取采用CTAB法。PCR反應(yīng)體系見表3。

表2所用高粱SSR分子標(biāo)記引物序列

表3.PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系濃度及物品用量表

利用26對(duì)SSR標(biāo)記篩選母本和父本，得到只在父本(高粱)基因組上能擴(kuò)增出的標(biāo)記12對(duì)(圖2)。用5號(hào)標(biāo)記擴(kuò)增23個(gè)F1植株，14個(gè)單株都可以擴(kuò)增出產(chǎn)物，其它單株沒有擴(kuò)增出結(jié)果(圖3)，表明高粱的DNA片段成功導(dǎo)入玉米基因組中

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

<110> 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心 ；江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120> 一種玉米與高粱雜交的方法

<160> 26

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標(biāo)記引物序列

GACTATAGACAGATCCGGGC CTCAATAAAGTCGGCTCCAC

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標(biāo)記引物序列

TCGCTATCCTCACCTATCAA ATGGTTCTTGCTACTCCCAG

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標(biāo)記引物序列

CACACAGTCGAGAGCAAAAC TGATCACTTTCGTGATCGAG

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標(biāo)記引物序列

GCTAGCAATCAGGTCTTGGT AGAGATGTTTGGTTGGTGGT

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標(biāo)記引物序列

TCTAGGCATTTATAAGCCCG CACGTGAGGTCCACATTTTA

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標(biāo)記引物序列

CTACACCAGTATGCAAAGGC ATGCTAGGTCTAGCTGCCTG

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標(biāo)記引物序列

ACCGATATCCTGAAATGTCC TGCTGACCAATCACTTCTGT

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標(biāo)記引物序列

TCTCTAGCTAGCGCACACAC CATCCATAAGGGAGAGTTCG

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標(biāo)記引物序列

AACACATGTGCTCAATGCTC CACATTTCTTCCCAGTAGCC

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標(biāo)記引物序列

CCTGAGCAAAGGCAGTATTT ATATGTATGGTCCCGTCCAC

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標(biāo)記引物序列

GTCGATGTGTGTGACCGTAT CTTTCCTCCTTGTTGTTCGT

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標(biāo)記引物序列

AGTACCGTATGGTGATGCG GGCGATCGTGGAGTAGTAGT

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標(biāo)記引物序列

CCGATGTTGATGGAAGAGAT TAGTCAAACACAATGTCCGC

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標(biāo)記引物序列

GATCGCTCTCTCTCGTTTTT TGTGTGTGTGTGTGTGTGTG

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標(biāo)記引物序列

GTGTGTGTGTCTGTCTCGCT GAGGGAGAGAGAGAGGGCT

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標(biāo)記引物序列

TAAGAGAATCACACCTGGCA GCTGTTCACTTTTCCTCGTT

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標(biāo)記引物序列

GAGAACAATAACGCGTGGA GAAATGGGCATATGAGATGG

<210> 18

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標(biāo)記引物序列

CTGCTGCTGCTTTCTCAATA TGCATCATATCCTGATGGAG

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標(biāo)記引物序列

GACACACAGAGACCCAGACA GTCTCTCTCTCTCTCCCGCT

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標(biāo)記引物序列

GTGATCCGAACCTAGCAGAT GGATAGATTTTGGTTGGACG

<210> 21

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標(biāo)記引物序列

AGCTTATCGATACCGTCCTG CTGTGAGACAAGACTGTCGG

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標(biāo)記引物序列

GGTCTGGTAGAGGTTCATGG ATCCGGTAAGGTAGACCCTC

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標(biāo)記引物序列

TATTTCACAGGGGAATCAGG TCCATTGTACTTTTAGCCCC

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標(biāo)記引物序列

CTACGACGTACAGGCAGTTG TACCGCCTGATCTCTTCACT

<210> 25

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標(biāo)記引物序列

CCTCACTATAGGGCGAATTG CAGGGTTCTTATCGCATACC

<210> 26

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子標(biāo)記引物序列

TTGGCACATGCATATACTCC ACGGCATGTCGATAAGTGTA。