本發(fā)明涉及一種花粉長期保存方法，具體是一種金銀忍冬花粉超低溫保存方法。

背景技術(shù)：

金銀忍冬又名金銀木、雞骨頭樹等，為忍冬科忍冬屬落葉小喬木，常叢生成灌木狀，其花果并美，具有較高的觀賞價值，漿果從六七月份逐漸由黃變紅，由紅變成紫紅，園林中常將金銀木叢植于草坪、山坡、林緣、路邊或點綴于建筑周圍，是良好的觀賞灌木。金銀忍冬是稀有的藥用觀賞灌木，具有解熱、增強免疫力及抑菌作用，全株可入藥,能祛風(fēng)解毒、消腫止痛，主治頭暈、跌打損傷。其莖皮可制人造棉，種子油可制肥皂，葉浸汁可殺棉蚜蟲，花可作金銀花用。由此可見，金銀忍冬是一種集藥用和觀賞應(yīng)用于一體的植物，具有較高的推廣價值。在自然條件下，許多花粉的壽命非常短,這給種質(zhì)資源研究和雜交育種工作帶來極大的不便，同時也不利于相關(guān)的植物遺傳研究。進行花粉的超低溫保存研究對于加速育種進程以及完善種質(zhì)資源保存方法等研究工作都具有重要意義。成熟的花粉含有植物的全部遺傳物質(zhì)信息，花粉超低溫保存操作簡單，是進行種質(zhì)資源保存的一條新途徑。

超低溫保存是指在液氮(－196℃)及液氮蒸汽相(－150～－180℃)的超低溫條件下保存生物材料。超低溫保存技術(shù)可使植物材料的代謝和生長活動在一定的低溫條件下幾乎完全停止，進而有效的保持材料的遺傳穩(wěn)定性，同時又不會喪失其形態(tài)發(fā)生的潛能，達到長期保存的目的；并具有遺傳穩(wěn)定性高，操作簡單方便，節(jié)省空間、省時省力的優(yōu)點。

將超低溫保存技術(shù)應(yīng)用于花粉保存，其優(yōu)點：操作簡單易行、占用空間小、安全穩(wěn)定保存成本低可以大大延長花粉的保存時間，使花粉的貯運和交換成為可能，同時還能很好服務(wù)于育種工作，提高育種效率經(jīng)過低溫保存的花粉能保持其遺傳完整性和穩(wěn)定性低溫條件下還可以避免病蟲害的引入，為地區(qū)間、國際間的種質(zhì)交換提供方便。

金銀忍冬花粉超低溫保存目前還未見報道。因此，研發(fā)一種適合于金銀忍冬花粉的可行的超低溫保存方法是非常必要的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

將不同采集時期和采集時間金銀忍冬新鮮花粉放入1.8ml的凍存管中，花粉的體積不超過凍存管容量的2/3，然后將冷凍管放入盛有硅膠干燥劑的干燥皿內(nèi)干燥不同的時間后獲得不同含水量的花粉，干燥皿規(guī)格為V＝410mm×410mm×310mm、Φ＝300mm；將裝有花粉的凍存管投入﹣196℃液氮罐中保存；取出凍存管進行不同化凍處理；化凍后將花粉在培養(yǎng)液中測定萌發(fā)率。

所述不同采集時期，為開花前1天，開花當(dāng)天，開花后1天采集的花粉進行萌發(fā)率的測定

所述不同采集時間，1d中不同時間所采集的花粉萌發(fā)率不同，我們分別采集了7:30、9:30、11:30、13:30、15:30、17:30、19:30的金銀忍冬花粉。

所述干燥不同的時間分別為干燥0min、10min、20min、30min、40min、50min。

所述不同含水量，為金銀忍冬花粉干燥的時間不同得到的含水量。

所述不同化凍方式，分別為三種：(1)室溫化凍30min；(2)40℃水浴化凍2min；(3)自來水沖洗5min。

通過對以上技術(shù)方案進行試驗找出最佳一種金銀忍冬花粉超低溫保存方法，用于權(quán)利要求。

具體實施方式：

以下對本發(fā)明結(jié)合具體的實例作進一步的詳細說明，并介紹本發(fā)明的相關(guān)研究結(jié)果。

1.以東北林業(yè)大學(xué)校內(nèi)的金銀忍冬花粉為例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。

1)不同采集時期對金銀忍冬花粉萌發(fā)率的影響

在金銀忍冬開花前一天，開花當(dāng)天，開花后一天采集花粉，觀察不同采收時期的花粉萌發(fā)率的變化情況。

表1不同采集時期對金銀忍冬花粉萌發(fā)率的影響

2)不同采集時間對金銀忍冬花粉萌發(fā)率的影響

從金銀忍冬開花的一天中選定不同的時段，即7:30、9:30、11:30、13:30、15:30、17:30、19:30每隔兩小時采集花粉，觀察其萌發(fā)率。

表2不同采集時間對金銀忍冬花粉萌發(fā)率的影響

3)經(jīng)不同干燥時間得不同含水量花粉超低溫保存前后萌發(fā)率

首先采用烘干法測得金銀忍冬花粉的最大含水量后，利用硅膠干燥法進行花粉不同含水量梯度的配制，然后測定花粉的萌發(fā)率；后將其投入液氮罐中保存一段時間后取出，經(jīng)化凍后測定金銀忍冬花粉經(jīng)超低溫保存后的萌發(fā)率。

表3經(jīng)不同干燥時間得不同含水量花粉超低溫保存前萌發(fā)率

表4經(jīng)不同干燥時間得不同含水量花粉超低溫保存后萌發(fā)率

4)不同化凍方式對花粉萌發(fā)率的影響

采用了3種化凍方式(1)室溫化凍30min；(2)40℃水浴化凍2min；(3)自來水沖洗5min對金銀忍冬花粉超低溫保存24h后的進行化凍試驗，比較3種化凍方式對花粉萌發(fā)力的影響。

表5不同化凍方式對花粉萌發(fā)率的影響

2.試驗結(jié)果

1)花粉的萌發(fā)率是花粉超低溫保存效果的重要評價因子，花粉的離體萌發(fā)技術(shù)由于其操作簡便易行而作為檢驗花粉萌發(fā)率的重要手段之一。一般情況下，成熟的金銀忍冬花粉可以采用蔗糖400g/L+硼酸127.23mg/L+2,4D75mg/L的培養(yǎng)液在25℃左右的培養(yǎng)箱內(nèi)進行萌發(fā)率的測定。但是花粉的萌發(fā)情況受到多種因素的同時影響，金銀忍冬花粉自身的發(fā)育程度及其周圍的環(huán)境條件都會直接影響著它的萌發(fā)。不同采收時期的金銀忍冬花粉成熟度不同，則具有不同的萌發(fā)率。開花當(dāng)天萌發(fā)率最高，開花前1天及開花后1天，花粉萌發(fā)率較低，因此，采集開花當(dāng)天的金銀忍冬花粉進行超低溫保存效果較好。

2)一天當(dāng)中不同的采集時間花粉的萌發(fā)率也不同，在一天中從早上7:30至13:30花粉活力不斷增強，從13:30至19:30花粉萌發(fā)率不斷下降，在13:30時花粉活力最高。綜合考慮，金銀忍冬花粉最適宜采集時間為13:30左右，萌發(fā)率在90％以上。

3)金銀忍冬花粉在超低溫保存后采用自來水化凍，可以獲得較好的冷凍效果，化凍后的金銀忍冬花粉萌發(fā)率較高，而采用水浴化凍和在室溫中自然化凍的方式都不適合金銀忍冬花粉的萌發(fā)，得到的萌發(fā)率都相對較低。

4)花粉含水量的多少是決定花粉超低溫保存成功與否的關(guān)鍵因素。許多花粉新采集的花粉含水量較高，在超低溫保存時，細胞內(nèi)水分容易結(jié)冰，細胞膜容易受損，從而引起花粉萌發(fā)率低。但是當(dāng)含水量過低，細胞會由于過度脫水而死亡，萌發(fā)率也不高。不同植物花粉進行超低溫保存時的適宜含水量不同。

由試驗結(jié)果可知，當(dāng)金銀忍冬花粉含水量在13％～14％時，即未干燥的花粉的萌發(fā)率較高，說明未干燥的金銀忍冬花粉適宜直接進行超低溫保存，此時含水量可作為花粉超低溫冷凍保存的安全含水量的參考依據(jù)。但隨著干燥時間的延長和含水量的降低，花粉本身的生活力衰退嚴重，已經(jīng)不適合進行超低溫保存。