本發(fā)明涉及人工催熟領(lǐng)域，具體是一種頭足類(lèi)的人工促熟方法。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，海洋頭足類(lèi)繁育和增養(yǎng)殖在國(guó)內(nèi)已開(kāi)始起步，發(fā)展勢(shì)頭良好，但至今海洋頭足類(lèi)的人工繁育仍依靠其自然繁殖和產(chǎn)卵，而人工催產(chǎn)和促熟方法還未形成，不利于頭足類(lèi)規(guī)模化繁育和養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展?，F(xiàn)有技術(shù)如Wells M J， Wells J. Optic gland implants and their effects on the gonads of Octopus.[J]. Journal of Experimental Biology， 1975， 62(3):579-88.表明：二趾頭足類(lèi)動(dòng)物的視腺能分泌激素來(lái)控制性腺及其管道的狀態(tài)，可通過(guò)切除大腦中對(duì)視腺的抑制神經(jīng)，迫使動(dòng)物早熟。只有在視腺存在條件下，卵巢片段才能進(jìn)行卵母細(xì)胞的分裂。并且視神經(jīng)腺的提取物能在體外控制軟黃蛋白的合成。因此，可通過(guò)切除和植入視腺來(lái)控制動(dòng)物的生長(zhǎng)狀態(tài)。

GnRH，也稱(chēng)作LHRH，是負(fù)責(zé)卵泡刺激激素(FSH) 和促黃體激素(LH) 分泌的十肽激素。關(guān)于GnRH緩釋劑的制備已有研究，如歐洲專(zhuān)利號(hào)1001743 公開(kāi)了含活性成分和完全包圍住核心的鞘。具有完全包圍核心的鞘降低了性能，具體在于：由于鞘阻斷了釋放，施用后短時(shí)間內(nèi)活性成分釋放的水平低。這種植入劑還有第二個(gè)缺點(diǎn)：其生產(chǎn)工藝相對(duì)復(fù)雜。美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，851，547 公開(kāi)了一種控釋藥物制劑，其包含溶脹的內(nèi)層和控制著內(nèi)層溶脹的不能透水的外層。藥物僅通過(guò)內(nèi)層的至少一個(gè)開(kāi)口端釋放，且內(nèi)層是不崩解的，其在藥物釋放的時(shí)間段里保持著原始形狀。該制劑的問(wèn)題是藥物的釋放僅受一個(gè)參數(shù)控制：可通過(guò)開(kāi)口端釋放的藥量。這是內(nèi)層是不崩解的后果，并且它限制了釋放期。中國(guó)專(zhuān)利號(hào)CN102413835B，公開(kāi)了一種包含GnRH 類(lèi)似物的緩釋制劑，包含生物可降解聚合物或共聚物的活性物質(zhì)的控釋和緩釋的藥物組合物。此外，還涉及用于至少一種活性物質(zhì)例如肽類(lèi)或激素類(lèi)及其類(lèi)似物的控釋或緩釋的藥物組合物和這類(lèi)藥物組合物的制備方法

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種能快速催熟，安全無(wú)害的頭足類(lèi)的人工促熟方法。

本發(fā)明針對(duì)背景技術(shù)提到的問(wèn)題，采取的技術(shù)方案為：

一種頭足類(lèi)的人工促熟方法，具體步驟為：將頭足類(lèi)浸泡在含2.5~3.8%聚氨酯的海水中進(jìn)行麻醉，防止植入GnRH緩釋包埋塊時(shí)噴墨，浸泡時(shí)間為60~100s。在頭足類(lèi)眼窩竇處鉆孔，用鑷子將GnRH緩釋包埋塊推入，并使其自由浮動(dòng)在竇中。其中，GnRH緩釋包埋塊的制備步驟為：

1. PLGA粉末的制備：將LA和LG按摩爾比70 ：30 ~90 ：10加入反應(yīng)釜中，抽真空，70~80℃減壓蒸餾0.8~1.2h，除去原料中10~20%的水，加入催化劑氯化亞錫，對(duì)甲基苯磺酸和花生四烯酸，加入量各為原料質(zhì)量的0.2~0.5%，0.4~0.8%，0.001~0.003%，加熱，溫度控制在120~130℃，低真空下反應(yīng)1.8~2.2h，繼續(xù)升溫，溫度為165~175℃熔融縮聚，系統(tǒng)壓力小于50~100Pa，反應(yīng)6~8h后出料，研磨成粉。加入催化劑能加快縮聚速度，反應(yīng)時(shí)間大大縮短，還能減少副反應(yīng)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率提高；

2. 聚合物核心制備：將GnRH粉末和步驟1制備的10~30%PLGA粉末過(guò)篩，，以避免團(tuán)塊存在于混合物中，混合20~30min，加入原料質(zhì)量0.1~0.4%的碳酸二甲酯，加熱攪拌擠壓，溫度為135~140℃，攪拌速率為8~12rpm，降溫制成直徑為0.6~1.2mm的小丸。小丸中GnRH結(jié)構(gòu)沒(méi)有被破壞，活性高，并且小丸中其他成分對(duì)GnRH有保護(hù)作用，緩釋時(shí)與GnRH一起流出，有助于GnRH融入到血液；

3. 聚合物套制備：往步驟1中制備的剩余PLGA粉末中加入三乙醇胺和尼泊金乙酯，加入量各為原料的0.1~0.3%和0.2~0.5%，加熱攪拌擠壓，溫度為140~150℃，攪拌速率為2~6rpm，切割擠成空心開(kāi)口方形；上述成分結(jié)合可形成快速催熟的穩(wěn)定產(chǎn)物，具有緩釋時(shí)間長(zhǎng)、對(duì)生物刺激小的特點(diǎn)。

4. GnRH緩釋包埋塊制備：將步驟2制備的核心置于步驟3制備的空心開(kāi)口方形套中，在25kGy 以上進(jìn)行γ- 照射，得到GnRH緩釋包埋塊。上述制備的GnRH緩釋包埋塊的釋放時(shí)間長(zhǎng)，釋放速度均勻，能完全釋放。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：在眼睛下放的眼窩竇中植入GnRH緩釋包埋塊，達(dá)到頭足類(lèi)促熟和催產(chǎn)的目的，這種人工催熟的方法能將頭足類(lèi)快速催熟，安全無(wú)害；制備的GnRH緩釋包埋塊釋放時(shí)間長(zhǎng)，釋放速度均勻，可生物降解，能完全釋放，不會(huì)造成環(huán)境污染或能源浪費(fèi)；操作步驟簡(jiǎn)單，效果明顯，海洋頭足類(lèi)的人工繁育不必再依靠其自然繁殖和產(chǎn)卵。

具體實(shí)施案例

下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明內(nèi)容作進(jìn)一步說(shuō)明：

實(shí)施例1：

一種頭足類(lèi)的人工促熟方法，具體步驟為：將頭足類(lèi)浸泡在含2.5~3.8%聚氨酯的海水中進(jìn)行麻醉，防止植入GnRH緩釋包埋塊時(shí)噴墨，浸泡時(shí)間為60~100s。在頭足類(lèi)眼窩竇處鉆孔，用鑷子將GnRH緩釋包埋塊推入，并使其自由浮動(dòng)在竇中。其中，GnRH緩釋包埋塊的制備步驟為：

1. PLGA粉末的制備：將LA和LG按摩爾比70 ：30 ~90 ：10加入反應(yīng)釜中，抽真空，70~80℃減壓蒸餾0.8~1.2h，除去原料中10~20%的水，加入催化劑氯化亞錫，對(duì)甲基苯磺酸和花生四烯酸，加入量各為原料質(zhì)量的0.2~0.5%，0.4~0.8%，0.001~0.003%，加熱，溫度控制在120~130℃，低真空下反應(yīng)1.8~2.2h，繼續(xù)升溫，溫度為165~175℃熔融縮聚，系統(tǒng)壓力小于50~100Pa，反應(yīng)6~8h后出料，研磨成粉。加入催化劑能加快縮聚速度，反應(yīng)時(shí)間大大縮短，還能減少副反應(yīng)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率提高；

2. 聚合物核心制備：將GnRH粉末和步驟1制備的10~30%PLGA粉末過(guò)篩，，以避免團(tuán)塊存在于混合物中，混合20~30min，加入原料質(zhì)量0.1~0.4%的碳酸二甲酯，加熱攪拌擠壓，溫度為135~140℃，攪拌速率為8~12rpm，降溫制成直徑為0.6~1.2mm的小丸。小丸中GnRH結(jié)構(gòu)沒(méi)有被破壞，活性高，并且小丸中其他成分對(duì)GnRH有保護(hù)作用，緩釋時(shí)與GnRH一起流出，有助于GnRH融入到血液；

3. 聚合物套制備：往步驟1中制備的剩余PLGA粉末中加入三乙醇胺和尼泊金乙酯，加入量各為原料的0.1~0.3%和0.2~0.5%，加熱攪拌擠壓，溫度為140~150℃，攪拌速率為2~6rpm，切割擠成空心開(kāi)口方形；

4.GnRH緩釋包埋塊制備：將步驟2制備的核心置于步驟3制備的空心開(kāi)口方形套中，在25kGy 以上進(jìn)行γ- 照射，得到GnRH緩釋包埋塊。上述制備的GnRH緩釋包埋塊的釋放時(shí)間長(zhǎng)，釋放速度均勻，可生物降解，能完全釋放。

實(shí)施例2：

一種頭足類(lèi)的人工促熟方法，以海螵蛸為例進(jìn)行試驗(yàn)，將海螵蛸麻醉，在眼睛下方的眼窩竇中植入視腺或GnRH緩釋包埋塊，達(dá)到海螵蛸促熟和催產(chǎn)的目的。由于海螵蛸是石灰質(zhì)的內(nèi)骨骼，植入后應(yīng)該是無(wú)損傷的；同時(shí)由于其疏松多孔，也容易讓激素釋放到體內(nèi)發(fā)揮作用。

具體步驟為：將海螵蛸浸泡在含3%聚氨酯的海水中進(jìn)行麻醉，防止植入GnRH緩釋包埋塊時(shí)噴墨，浸泡時(shí)間為70s。在海螵蛸眼窩竇處鉆孔，用鑷子將GnRH緩釋包埋塊推入，并使其自由浮動(dòng)在竇中。其中，GnRH緩釋包埋塊的制備步驟為：

1. PLGA粉末的制備：將LA和LG按摩爾比7:1加入反應(yīng)釜中，抽真空，75℃減壓蒸餾1h，除去原料中18%的水，加入催化劑氯化亞錫，對(duì)甲基苯磺酸和花生四烯酸，加入量各為原料質(zhì)量的0.3%，0.6%，0.001%，加熱，溫度控制在125℃，低真空下反應(yīng)2h，繼續(xù)升溫，溫度為170℃熔融縮聚，系統(tǒng)壓力小于70Pa，反應(yīng)7h后出料，研磨成粉。加入催化劑能加快縮聚速度，反應(yīng)時(shí)間大大縮短，還能減少副反應(yīng)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率提高；

2. 聚合物核心制備：將GnRH粉末和步驟1制備的20%PLGA粉末過(guò)篩，，以避免團(tuán)塊存在于混合物中，混合20min，加入原料質(zhì)量0.2%的碳酸二甲酯，加熱攪拌擠壓，溫度為138℃，攪拌速率為10rpm，降溫制成直徑為0.8mm的小丸。小丸中GnRH結(jié)構(gòu)沒(méi)有被破壞，活性高，并且小丸中其他成分對(duì)GnRH有保護(hù)作用，緩釋時(shí)與GnRH一起流出，有助于GnRH融入到血液；

3. 聚合物套制備：往步驟1中制備的剩余PLGA粉末中加入三乙醇胺和尼泊金乙酯，加入量各為原料的0.2%和0.3%，加熱攪拌擠壓，溫度為145℃，攪拌速率為4rpm，切割擠成空心開(kāi)口方形；

4. GnRH緩釋包埋塊制備：將步驟2制備的核心置于步驟3制備的空心開(kāi)口方形套中，在30kGy進(jìn)行γ- 照射，得到GnRH緩釋包埋塊。上述制備的GnRH緩釋包埋塊的釋放時(shí)間長(zhǎng)，釋放速度均勻，可生物降解，能完全釋放。

以上所述的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補(bǔ)充或類(lèi)似方式替代等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。