本發(fā)明涉及一種青蒿種質(zhì)材料保存方法，更具體的說(shuō)涉及一種基于作物光周期特性的青蒿種質(zhì)材料保存方法。技術(shù)背景青蒿(artemisiaannuaL.)，又名青蒿，菊科艾屬植物，傳統(tǒng)中藥，藥用價(jià)值高，具有清熱解暑、除蒸、截瘧的作用。青蒿葉片及花蕾提取青蒿素，是青蒿素類藥物的唯一商用原料來(lái)源。青蒿素類藥物是國(guó)際公認(rèn)的最佳抗瘧特效藥。同時(shí)，還臨床治療流感、高熱病、結(jié)核病、中暑、皮膚瘙癢、蕁麻疹、脂溢性皮等，也具有治療血吸蟲、愛(ài)滋病等應(yīng)用前景。青蒿株高100-400厘米，莖直立，多分枝?；~平鋪地面，莖生葉互生，通常為一回羽狀全裂，裂葉短細(xì)，有極小粉末狀短柔毛；葉軸兩側(cè)具窄翅；莖上部的葉向上逐漸細(xì)小呈條形。中晚秋開小黃花，頭狀花序，細(xì)小，球形，有短梗，排列成復(fù)總狀或總狀，常有條形苞葉，總苞片2～3層，外圍為雌花，中央為兩性花，小花為筒狀，黃色；果瘦，橢圓形，長(zhǎng)不超過(guò)1mm。青蒿為一年生草本植物。一般8月下旬至9月上旬為花蕾期，10月上旬左右形成果實(shí)，10月下旬至11月種子成熟采收，每克種子超過(guò)3萬(wàn)粒，種子無(wú)休眠期。種子成熟時(shí)全株即枯死。種子成熟至次年5月中旬前都可播種正常發(fā)芽，但栽培時(shí)以2月中旬至3月中旬播種為佳，此期溫度18～25℃最適宜種子萌發(fā)，發(fā)芽率高，出苗整齊，幼苗生長(zhǎng)健壯，4月下旬至5月上旬前移栽。青蒿現(xiàn)蕾前，葉片青蒿素含量達(dá)到最高，因此花蕾前為商品葉采收時(shí)期，商品葉采收生育期200-240天。青蒿是世界性的廣布物種，但青蒿品質(zhì)(青蒿素含量)具有顯著的生態(tài)地域性，即不同地域、不同群體、不同單株之間青蒿素含量高低差異極大。世界絕大部分地區(qū)青蒿素含量低于0.1％，甚至微量，基本沒(méi)有利用價(jià)值，僅少數(shù)國(guó)家的部分地區(qū)青蒿素含量相對(duì)較高，能達(dá)到工業(yè)提取水平之上。我國(guó)青蒿種質(zhì)資源豐富，從海拔幾米的海南島到3000米的西藏都有分布，但各地品質(zhì)變化幅度巨大，僅重慶、湖南、廣西等地等少部分地區(qū)，青蒿素含量明顯高于其他地區(qū)，具有加工利用價(jià)值，尤其武陵山區(qū)，品質(zhì)高而獨(dú)特。為此，在這些地區(qū)，青蒿種植規(guī)模已超10萬(wàn)畝，為世界抗瘧做出了不可替代的貢獻(xiàn)，也為“中國(guó)中藥”樹立了良好形象。但如今，這些地區(qū)所擁有的稀缺而又珍貴的高品質(zhì)優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源因缺乏有效保護(hù)正面臨枯竭甚至徹底喪失的危險(xiǎn)。青蒿人工栽培仍習(xí)慣于種子繁殖，品種和育種材料的保存以貯藏種子為主。青蒿屬異花授粉植物，自交不結(jié)實(shí)，有性繁殖過(guò)程就是種質(zhì)雜化和品質(zhì)退化的過(guò)程，優(yōu)良品種、性狀因繁殖而極易迅速退化。大田每生產(chǎn)一年或每制種一次，青蒿素含量就會(huì)平均下降0.5％，意味著將使藥物提取加工環(huán)節(jié)增加成本1-2倍。因此，種子繁殖過(guò)程使本已稀缺而又珍貴的優(yōu)良種質(zhì)變得更加稀缺和珍貴，甚至徹底喪失。青蒿是嚴(yán)格的短日照植物。所謂短日照植物，是指給與比臨界暗期(criticaldarkperiod)長(zhǎng)的連續(xù)黑暗下的光周期時(shí)，花芽才能形成或促進(jìn)花芽形成的植物。在自然界中，只有在日照比較短的季節(jié)里，短日照植物的花芽才能分化，但即使日照較短，假如隨后的暗期短于臨界暗期，花芽仍不能形成，或即使給與足夠的暗期，但在中途適當(dāng)?shù)臅r(shí)間進(jìn)行短時(shí)間的光照(光中斷)時(shí)，花芽也不能分化。青蒿當(dāng)光周期小于約13.5h時(shí)，半月之內(nèi)就會(huì)開花。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：高品質(zhì)含量等優(yōu)良性狀的青蒿品種極難獲得，其自交不育的特性致使優(yōu)良性狀因雜交而極易退化，種質(zhì)、品種、性狀都不容易保存。青蒿為一年生草本，植株材料存活期短而保持困難。為了解決青蒿植株繁殖材料保持困難，本發(fā)明基于青蒿短日照作物的特性，提供了一種青蒿種質(zhì)材料保存方法，即在青蒿植株在第一次分枝前，全株置于光照強(qiáng)度500-5000Lx，每天光照時(shí)間14-24h的環(huán)境中，抑制花芽分化，使青蒿植株始保持于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)。將播種或扦插育苗得到的青蒿苗在第二次分枝前，移栽到持續(xù)光照的環(huán)境中種植，環(huán)境溫度為15℃-30℃，環(huán)境濕度60-90％。所述的持續(xù)光照強(qiáng)度為500-5000Lx，每天14-24h的光照時(shí)間，人工光源或白天自然光夜晚輔加人工光源。所述的基于作物光周期特性的青蒿種質(zhì)材料保存方法在青蒿植株無(wú)性繁殖中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：解決了青蒿植株在常規(guī)條件下會(huì)開花結(jié)籽從而使植株整體老化凋敗的問(wèn)題，使植株無(wú)性生長(zhǎng)的生理周期延長(zhǎng)，為青蒿種質(zhì)材料尤其無(wú)性繁殖的繁殖材料長(zhǎng)期保持提供了可能性。并且，在特定的光照強(qiáng)度和光照時(shí)長(zhǎng)條件下，青蒿植株的枝條作為無(wú)性繁殖材料，其生長(zhǎng)特性和遺傳特性并不會(huì)發(fā)生變化。具體實(shí)施方式實(shí)施例1光周期對(duì)青蒿青蒿生育進(jìn)程的影響1長(zhǎng)日照對(duì)青蒿花芽分化抑制作用青蒿試驗(yàn)材料：兩種青蒿種質(zhì)材料，晚熟的紫桿青蒿，早熟的綠桿青蒿。紫色莖桿種子采自重慶酉陽(yáng)大田群體；綠色莖桿初采自廣西陽(yáng)朔野生群體，經(jīng)2年大田栽培馴化。光周期處理：試驗(yàn)在西南大學(xué)試驗(yàn)網(wǎng)室進(jìn)行。用遮光材料在網(wǎng)室圍建A、B兩個(gè)分隔的光周期處理區(qū)，阻隔干擾光源。A區(qū)為對(duì)照，自然日照，每日光照時(shí)長(zhǎng)大致11～13h；B區(qū)除自然日照外，另加2000Lx人工光源，于每日15:00～24:00期間補(bǔ)照7h，使日照時(shí)長(zhǎng)超16h。取紫桿、綠桿種子，同時(shí)(1月20日)分別在A、B區(qū)播種育苗若干。青蒿幼苗在第一級(jí)分枝出現(xiàn)前(3月15日)，移植盆栽。每盆裝土10kg,拌土基施15-15-15復(fù)合肥15g和150有機(jī)質(zhì)，定植1株。A區(qū)、B區(qū)各分別培育紫桿、綠桿青蒿植株100盆待后續(xù)試驗(yàn)用。青蒿生長(zhǎng)期間溫度15℃～30℃，相對(duì)濕度60％～90％。觀察記錄生育進(jìn)程。在青蒿植株出現(xiàn)第一級(jí)分枝(3月25日)、第二級(jí)分枝(5月1日)、第三級(jí)分枝(6月5日)時(shí)期，分別將A(B)區(qū)植株各取5盆(株)轉(zhuǎn)移到B(A)區(qū)。觀察記錄轉(zhuǎn)移植株生育進(jìn)程。結(jié)果見(jiàn)表1、表2。表1光周期對(duì)青蒿生育進(jìn)程的影響在A區(qū)處于自然光照周期條件下的兩種質(zhì)青蒿雖花期相錯(cuò)，但都先后開花、結(jié)實(shí)、衰老枯死；而B區(qū)處于長(zhǎng)日照(16h)處理的兩種質(zhì)青蒿不僅當(dāng)年未開花，第二年相應(yīng)時(shí)期也未開花，始終保持營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)，歷經(jīng)600多天直到試驗(yàn)終結(jié)?？梢?jiàn)長(zhǎng)日照抑制花芽分化，青蒿在長(zhǎng)日照條件下能夠由一年生轉(zhuǎn)為多年生，為青蒿種質(zhì)、優(yōu)良性狀和品種的持久保存和多次利用提供了可能。由長(zhǎng)日照轉(zhuǎn)移到短日照(B轉(zhuǎn)移到A)，各分枝時(shí)期都一致，青蒿現(xiàn)蕾、開花、結(jié)實(shí)與自然日照處理狀態(tài)完全一致(見(jiàn)表2)。但由A轉(zhuǎn)移到B接受長(zhǎng)日照的植株中，則有不同情況，第一級(jí)分枝期轉(zhuǎn)移的青蒿不開花、不衰老枯死，第二級(jí)分枝期一部分枝條開花、枯死，另一部分未開花、不衰老；第三級(jí)分枝期，則長(zhǎng)日照已不再具作用效果。試驗(yàn)表明，長(zhǎng)日照須在第二級(jí)分枝時(shí)期以前開始并持續(xù)進(jìn)行，方能有效抑制花芽分化以。試驗(yàn)中還觀察到，15℃-30℃、濕度60-90％是青蒿適宜的生長(zhǎng)條件。在15℃-30℃溫度范圍內(nèi)，偏高的溫度利于青蒿生物量的累計(jì)，但偏低的溫度因青蒿緩慢生長(zhǎng)而有利于維持持久營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，即偏低溫度更利于種質(zhì)材料保存。表2青蒿光周期的效應(yīng)期2臨界光周期及光照強(qiáng)度的考察光照時(shí)長(zhǎng)、強(qiáng)度2因素試驗(yàn)方案，溫室中進(jìn)行。溫室基礎(chǔ)光照2000Lx12h，溫度20℃～27℃，相對(duì)濕度大致60％～90％。將溫室分隔3個(gè)獨(dú)立盆栽區(qū)，在2000Lx12h基礎(chǔ)上，分別采用人工點(diǎn)光源，增加時(shí)長(zhǎng)0h、1h、2h，即光周期分別為12h、13h、14h；調(diào)節(jié)植株位置與點(diǎn)光源距離設(shè)置光照強(qiáng)度：5000Lx、2000Lx、500Lx、250Lx。在自然光照下綠桿青蒿花期已過(guò)而紫色青蒿進(jìn)入始花期的時(shí)候，選取試驗(yàn)組1中B區(qū)的部分青蒿植株(未開花、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)良好)，各轉(zhuǎn)移至溫室3個(gè)分隔的盆栽區(qū)的相應(yīng)位置，接受相應(yīng)時(shí)長(zhǎng)和強(qiáng)度光照處理，觀察植物花蕾、開花等生育進(jìn)程。結(jié)果見(jiàn)表3。青蒿開花的臨界光周期大致13h。短于臨界光周期的短日照，能誘導(dǎo)青蒿花芽分化，12h日照處理的青蒿大致2周后出現(xiàn)花蕾，后全部開花；長(zhǎng)日照(≥14h)并適當(dāng)強(qiáng)度(500Lx～5000Lx)則抑制花芽分化保持青蒿繼續(xù)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。紫桿綠桿不同種質(zhì)對(duì)光周期和光強(qiáng)的敏感性存有差異；同時(shí)，較強(qiáng)的光照也會(huì)導(dǎo)致青蒿植株的老化和枯敗。表3臨界光周期與光照強(qiáng)度的效果3青蒿株體保存條件的優(yōu)化上述研究驗(yàn)證了青蒿是嚴(yán)格的短日照植物的特征，明確青蒿在照度高于500Lx，光照時(shí)間長(zhǎng)于14h，青蒿即不出現(xiàn)花芽分化現(xiàn)現(xiàn)象。在通過(guò)前期試驗(yàn)后，進(jìn)一步考察光照強(qiáng)度、光照時(shí)間、環(huán)境溫度和環(huán)境濕度等因素的組合影響，以優(yōu)化青蒿植株保存(不出現(xiàn)老化枯敗)的條件。正交方案見(jiàn)表4。表4正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平水平A光照強(qiáng)度(Lx)B光照時(shí)長(zhǎng)(h)C環(huán)境溫度(℃)D環(huán)境濕度(％)110001420602200016257033000183080以青蒿植株自移栽后至出現(xiàn)50％植株枯敗現(xiàn)象作為考察指標(biāo)，考察光照強(qiáng)度、光照時(shí)間、環(huán)境溫度和環(huán)境濕度對(duì)保存的影響，按上述試驗(yàn)方法青蒿植株保持結(jié)果如表5所示。表5正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析正交分析的結(jié)果表明，4個(gè)因素對(duì)青蒿種質(zhì)材料保持效果的影響主次順序?yàn)楣庹諘r(shí)長(zhǎng)>光照強(qiáng)度>環(huán)境濕度>環(huán)境溫度。最優(yōu)組合A3B2C1D3植株不開花保持時(shí)間長(zhǎng)達(dá)781天，即日照時(shí)間長(zhǎng)度為18h,光照強(qiáng)度2000Lx，環(huán)境溫度20℃，環(huán)濕度80％。但最優(yōu)單因素則為A2(日照時(shí)間長(zhǎng)度16h)B2(光照強(qiáng)度2000Lx)C1(環(huán)境溫度20℃)D3(環(huán)濕度80％)。針對(duì)最優(yōu)單因素組合條件進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)青蒿種質(zhì)材料在A2B2C1D3的保持條件下，植株不開花保持時(shí)間長(zhǎng)達(dá)804天。因此青蒿種質(zhì)材料的理性保持時(shí)間超700天。經(jīng)過(guò)綜合分析，在光照強(qiáng)度大于1000Lx后，光照時(shí)長(zhǎng)是影響青蒿種質(zhì)材料保存的一個(gè)主要因素，通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)考察，在光照時(shí)間在14-18h時(shí)，青蒿種質(zhì)材料的保存時(shí)間最長(zhǎng)，保存效果好。上述研究證明，在特殊的人工控制環(huán)境下，將在避免青蒿植株出現(xiàn)開花的情況下，可以較長(zhǎng)時(shí)間的保持青蒿植株不出現(xiàn)枯敗現(xiàn)象，這為優(yōu)良性狀、品種和種質(zhì)材料的保存與利用提供了思路。實(shí)施例2青蒿種質(zhì)材料保存方法對(duì)植株遺傳特性的影響采集采用實(shí)施例1中優(yōu)化的方法保存12個(gè)青蒿植株群體(每個(gè)組別35株青蒿植株)，分為四個(gè)組別，每個(gè)組別的光照強(qiáng)度分別為1000Lx、1500Lx、2000Lx和2500Lx，隨機(jī)制作插穗，每個(gè)組別分別在采用14h光照、16h光照、18h光照三個(gè)處理從對(duì)應(yīng)群落隨機(jī)制作插穗，每個(gè)處理制作200個(gè)插穗，控制環(huán)境溫度25±2℃(通過(guò)海拔高度進(jìn)行溫度條件控制)；扦插25天后，統(tǒng)計(jì)生根率、總根數(shù)；并移栽到大田內(nèi)，收獲后測(cè)定青蒿素含量。綜合評(píng)分評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：表6不同青蒿種質(zhì)材料再不同的保存條件對(duì)無(wú)性繁殖能力的影響從表6的數(shù)據(jù)可知，不同的保存條件對(duì)青蒿種質(zhì)材料的青蒿素含量沒(méi)有實(shí)質(zhì)的影響，但是對(duì)于進(jìn)行扦插繁殖的生根等生長(zhǎng)特性有一定的影響。綜合上述條件，發(fā)現(xiàn)光強(qiáng)度在1500Lx-2000Lx,光照時(shí)長(zhǎng)在14-16h時(shí)，保存材料無(wú)性繁殖時(shí)的生理特性最優(yōu)。在這樣的條件下，保存材料與在常規(guī)種植條件下制作的插穗相比，生長(zhǎng)特性和青蒿素含量都沒(méi)有實(shí)質(zhì)差異。但是當(dāng)光照時(shí)長(zhǎng)超過(guò)18h，光照強(qiáng)度超過(guò)2500Lx時(shí)，青蒿植株纖維化程度過(guò)高，其扦插存活率和生根的特性可能受到一定負(fù)面的影響，同時(shí)光照強(qiáng)度低于1500Lx后，也造成了青蒿植株生長(zhǎng)不足，保存材料的插穗生長(zhǎng)特性稍差些。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3