本發(fā)明涉及用于控制害鼠布氏田鼠的環(huán)保型植物源抗生育滅鼠劑，具體的說是涉及一種以薄荷油為主要成分的雌性不育劑用于控制害鼠布氏田鼠繁殖，主要涉及薄荷油通過影響布氏田鼠胚胎著床，降低布氏田鼠胚胎著床的數(shù)目以此來控制其繁殖的新方法。

背景技術(shù)：

草地既是我國重要的農(nóng)牧業(yè)自然資源，又是我國重要的生態(tài)屏障。草地鼠害是草地開發(fā)利用過程中出現(xiàn)的嚴重生態(tài)學(xué)問題。近30年來，我國草地鼠害發(fā)生面積呈現(xiàn)出逐年擴增的趨勢，據(jù)統(tǒng)計1987-2012年之間，每年農(nóng)田害鼠發(fā)生面積在0.2~ 0.4億hm2，鼠害造成的牧草損失超過60億元。草原鼠害的大規(guī)模發(fā)生，導(dǎo)致草場土壤肥力下降，水份大量流失，草地的生產(chǎn)力降低，造成雜草滋生及草地沙漠化，嚴重影響著草原畜牧業(yè)發(fā)展，也對農(nóng)牧民的生存和發(fā)展構(gòu)成威脅。

目前，草原鼠害防治方法主要分為化學(xué)滅鼠、物理滅鼠、生物滅鼠等，而草原滅鼠仍主要使用化學(xué)滅鼠劑來防治害鼠?；瘜W(xué)滅鼠劑具有造成二次中毒，產(chǎn)生抗藥、耐藥以及環(huán)境污染等一系列嚴重問題，已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)發(fā)展的要求。隨著科學(xué)技術(shù)突飛猛進及環(huán)保意識普遍加強，尋找一種綠色環(huán)保的控制鼠類數(shù)量的方法迫在眉睫，而生物源性抗生育劑因為其具備特異性高、資源豐富、無環(huán)境污染，對生態(tài)環(huán)境影響小且能有效控制害鼠等優(yōu)點在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)的害鼠生物防治上展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景，也受到了國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。

薄荷油為唇形科植物薄荷（Mentha haplocalyx Briq.）的新鮮莖和葉經(jīng)水蒸氣蒸餾、冷凍、部分脫腦加工提取的揮發(fā)油。主要活性成分為左旋薄荷醇(menthol)，含量達62%～87% ，廣泛分布于北半球的溫帶地區(qū)，在我國廣布于南北各省。藥理實驗表明薄荷油具有祛痰、利膽、解痙、抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌抗病毒、促滲透和抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多方面的藥理作用，且國內(nèi)外有文獻報道薄荷油對小鼠和家兔均有抗早孕、抗著床和抑制子宮收縮等作用，也有研究者通過灌胃處理發(fā)現(xiàn)薄荷油可明顯降低老鼠的受孕率。作為一種潛在的新型植物源抗生育劑，薄荷油具有產(chǎn)量高、來源廣、價格低廉、毒副作用小等優(yōu)點，在農(nóng)業(yè)、林業(yè)及畜牧業(yè)的鼠害防治方面，展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。

布氏田鼠（Brandt's Vole）分布于中國內(nèi)蒙古中東部地區(qū)，黑龍江，吉林，遼寧，河北等地，以及蒙古國中部與東部和與其接壤的俄羅斯外貝加爾南部邊界一帶，主要棲息于植被退化的草場上，是內(nèi)蒙古草原主要鼠害之一。目前，對于薄荷油對布氏田鼠的抗生育效果研究還尚未見到相關(guān)報道，本研究采用不同濃度薄荷油對布氏田鼠進行抗生育作用實驗進行探究，并對抗生育作用機理進行分析，期望篩選出安全環(huán)保、無污染、可對害鼠種群數(shù)量實現(xiàn)可持續(xù)控制作用的新型植物源性抗生育劑。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)現(xiàn)主要是發(fā)現(xiàn)了一種植物源型新藥材對布氏田鼠具有顯著的抗生育效果，旨在對草原害鼠布氏田鼠的繁殖率、數(shù)量進行控制，為其防治提供一種環(huán)保型新方法。

本發(fā)現(xiàn)通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)。

本發(fā)現(xiàn)是用從唇形科植物薄荷中提取得到的揮發(fā)油薄荷油對懷孕布氏田鼠進行口服/灌胃處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)薄荷油能夠明顯降低布氏田鼠的胚胎著床數(shù)目，從而降低害鼠布氏田鼠的繁殖率，控制其繁殖數(shù)量。然后用組織病理學(xué)的研究方法對薄荷油對布氏田鼠的抗生育效果進行進一步探討。薄荷油是一種環(huán)保型、對環(huán)境不會造成破壞，為鼠害的防控提供了一種新思路。

1藥物材料及實驗動物

專利所用實驗材料為薄荷油, 實驗用布氏田鼠捕捉自內(nèi)蒙古自治區(qū), 皆為幼鼠，在實驗室內(nèi)以鼠籠盒子雌雄分開喂養(yǎng)至性成熟，自然光照，室溫，通風(fēng)良好，供以充足的鼠糧及水，選擇健康，達到性成熟的雄鼠及無懷孕跡象的雌鼠備用，正式實驗前預(yù)飼養(yǎng)一周，觀察實驗布氏田鼠采食和飲水有無異樣。

2 急性毒性實驗方法

依據(jù)預(yù)實驗所得到的實驗數(shù)據(jù)，將備用布氏田鼠分為分為6組，每組6只，雌雄各半，分別為1個空白對照組和5個染毒劑量組，將實驗用薄荷油用0.5%羧甲基纖維素鈉配置成不同濃度薄荷油濃度，分別為0mg/kg、4000mg/kg、6000mg/kg、8000mg/kg、12000mg/kg、16000mg/kg，空白對照組以同體積的0.5%羧甲基纖維素鈉代替，將各組老鼠于實驗室內(nèi)自然光照，室溫，通風(fēng)良好，供以充足的鼠糧及水的條件下喂養(yǎng)一周，觀察各組實驗用布氏田鼠有無異常，如無異常，于一周后的第一天早上9點對各組布氏田鼠按照預(yù)先設(shè)定的薄荷油濃度進行灌胃，自灌胃時刻起的7天內(nèi)，觀察實驗用布氏田鼠的死亡情況，統(tǒng)計數(shù)據(jù)，分析結(jié)果。根據(jù)得到實驗數(shù)據(jù)，利用改良寇氏法公式，薄荷油對布氏田鼠的急性毒性劑量LD50為 5314mg/kg。

3 抗生育效果研究

依據(jù)薄荷油對布氏田鼠的急性毒性實驗所得到的數(shù)據(jù)，按照等比數(shù)列的方法設(shè)置各個薄荷油給藥濃度，將實驗備用的布氏田鼠雌雄分開進行一周喂養(yǎng)，觀察布氏田鼠采食和飲水有無異常，然后按照雌雄2:1的比例進行合籠，次日早上進行妊娠檢查（陰栓檢查法）根據(jù)檢查結(jié)果確認已受孕為妊娠第一天（D1），將受孕田鼠分為5組，每組12只，分別為三個薄荷油藥物處理組（用0.5%羧甲基纖維素鈉將薄荷油配置成預(yù)先設(shè)計的三個濃度劑量）、一個陽性對照組（用0.5%羧甲基纖維素鈉將炔雌醚配置成預(yù)先設(shè)計濃度劑量）、一個空白對照組（以同樣的方法給予相同體積的0.5%羧甲基纖維素鈉），灌胃劑量為0.2ml/10g，自D1起分別對各劑量組于每天早上9:00進行經(jīng)口灌胃給藥，連續(xù)給藥7天（D7），第10天（D10）解剖檢驗，統(tǒng)計各組胚胎數(shù)量、稱量子宮及各臟器的重量，計算出各組胚胎平均數(shù)量并用spss軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，統(tǒng)計實驗組與各對照組的胚胎著床是否有統(tǒng)計學(xué)差異，以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。抗生育結(jié)果表明：與空白對照組相比，經(jīng)薄荷油灌胃處理的布氏田鼠子宮胚胎數(shù)目隨著薄荷油濃度的增大而顯著降低，且差異顯著，薄荷油濃度的高低對布氏田鼠子宮胚胎著床數(shù)目的影響呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

4 組織保存

將實驗解剖所得到的布氏田鼠子宮組織部分保存于動物組織RNA保護液，部分保存于組織固定液（4%多聚甲醛）中帶回實驗室，再將其轉(zhuǎn)移到冰箱中保存?zhèn)溆?，進行下一步實驗探究。

5 HE染色研究

用HE染色實驗對布氏田鼠的子宮組織進行病理組織學(xué)組織形態(tài)觀察。實驗結(jié)果表明：空白對照組的布氏田鼠子宮內(nèi)膜、肌層及外膜結(jié)構(gòu)均清晰可見，子宮組織無病理學(xué)增生，而經(jīng)過薄荷油藥物處理的布氏田鼠的子宮結(jié)構(gòu)圖中，子宮內(nèi)膜腔上皮的厚度明顯增加，腺體增多，間質(zhì)細胞明顯減少，子宮腔上皮有損傷，明顯的組織病理學(xué)增生。

6 掃描電子顯微鏡檢視（SEM）

用SEM掃描電鏡技術(shù)對布氏田鼠子宮組織子宮內(nèi)膜表面進行觀察，主要是對子宮內(nèi)膜表面微絨毛及胞飲突進行觀察分析。相比較于空白對照組，經(jīng)藥物處理過的布氏田鼠的子宮內(nèi)膜表面胞飲突大量減少、子宮內(nèi)膜表面已部分遭到破壞，子宮內(nèi)膜容受性是指內(nèi)膜對胚胎的接受能力，內(nèi)膜遭到損害，子宮內(nèi)膜容受性也必然相應(yīng)的受到了影響。

7免疫組織化學(xué)實驗分析

用免疫組織化學(xué)染色實驗技術(shù)對布氏田鼠子宮中相關(guān)蛋白的表達進行分析，結(jié)果表明：子宮內(nèi)的ERα主要在腔上皮、腺體細胞和基質(zhì)細胞中廣泛表達，相較于空白對照組，經(jīng)薄荷油處理過的布氏田鼠子宮內(nèi)ERα的表達水平顯著降低；子宮內(nèi)的PR也廣泛分布在腔上皮細胞、腺體細胞和間質(zhì)細胞中，在腺體細胞中的表達相對較少，在子宮腔上皮細胞中的表達相較于間質(zhì)細胞和腺體細胞更有優(yōu)勢，與空白對照組的布氏田鼠相比，薄荷油處理組的布氏田鼠子宮內(nèi)的表達水平也呈現(xiàn)顯著下降的趨勢；從圖中可以看到，MMP2在子宮內(nèi)的腔上皮、腺體細胞和間質(zhì)細胞中都廣泛表達，相較于空白對照組，MMP2在經(jīng)薄荷油處理過的布氏田鼠子宮內(nèi)的表達水平明顯下調(diào)；從圖上可以看出，E-cadherin同一時期在子宮內(nèi)的表達相對較弱，且主要分布在腔上皮和腺體細胞中，間質(zhì)細胞中基本不表達，相較于空白對照組，薄荷油藥物處理組的子宮內(nèi)的MMP2表達水平明顯上調(diào)。

本發(fā)現(xiàn)與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點。

1 薄荷油屬于植物源性中藥材，其健康、生態(tài)、來源廣泛、且能有效降低布氏田鼠的胚胎著床數(shù)目，薄荷油的使用不會對環(huán)境造成污染、二次中毒等相關(guān)問題。

2 我國草地鼠害發(fā)生面積呈現(xiàn)出逐年擴增的趨勢，給草原生態(tài)、畜牧業(yè)發(fā)展及人類的生活等帶來了各種各樣的嚴重問題，布氏田鼠是內(nèi)蒙古草原主要鼠害之一，而薄荷油能夠通過影響布氏田鼠的胚胎著床過程從而影響其生育過程，這是一個可觀的發(fā)現(xiàn)，也為草原鼠害的防治提供了一種新方法。

附圖說明

圖1圖2 薄荷油對懷孕布氏田鼠胚胎著床數(shù)目的影響

A:空白對照組布氏田鼠胚胎著床情況；B：經(jīng)過薄荷油藥物處理的布氏田鼠胚胎著床數(shù)目減半；C：經(jīng)過薄荷油藥物處理的布氏田鼠胚胎著床數(shù)目大量減少；D：經(jīng)過薄荷油藥物處理的布氏田鼠無胚胎著床; E:不同濃度薄荷油藥物處理對布氏田鼠胚胎著床平均數(shù)目的影響.

圖3 薄荷油對布氏田鼠子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的影響

A:空白對照組布氏田鼠子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)HE染色圖; B:薄荷油處理組布氏田鼠子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)HE染色圖，Ge:腺體細胞; Le:腔上皮細胞；S：間質(zhì)細胞，比例尺為10μm.

圖4 薄荷油對布氏田鼠子宮內(nèi)膜表面的影響（2000×）

C：空白對照組布氏田鼠子宮內(nèi)膜表面電鏡圖；D：薄荷油藥物處理組布氏田鼠子宮內(nèi)膜表面電鏡圖。

圖5圖6 薄荷油對布氏田鼠子宮內(nèi)相關(guān)蛋白表達水平的影響。

具體實施方式

下文將通過實施實例對本發(fā)明做進一步說明，但實施實例不以任何方式限制本發(fā)明。

實例1：

選用薄荷油為不育劑，以合籠交配成功的雌性布氏田鼠小鼠為研究對象，以750mg/kg/day的劑量連續(xù)灌胃給藥7天，發(fā)現(xiàn)胚胎著床平均數(shù)量與對照組相比明顯減少,胚胎著床數(shù)目減少了50%。

實例2：

選用薄荷油為不育劑藥物，以合籠交配成功的雌性布氏田鼠為研究對象，以1000mg/kg/day的劑量連續(xù)灌胃給藥7天，發(fā)現(xiàn)胚胎著床平均數(shù)量與對照組相比明顯減少, 胚胎著床數(shù)目減少了57%。

實例3：

選用薄荷油為不育劑藥物，以合籠交配成功的雌性布氏田鼠為研究對象，以1500mg/kg/day的劑量連續(xù)灌胃給藥7天，發(fā)現(xiàn)胚胎著床平均數(shù)量與對照組相比顯著減少胚胎著床數(shù)目減少了63%，且具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。