本發(fā)明屬于魚類育種技術領域，具體涉及一種鞍帶石斑魚精子冷凍庫建立方法及利用冷凍精子輔助石斑魚遠緣雜交育種方法。

背景技術：

石斑魚是我國重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類和優(yōu)良種質資源，在我國有36種石斑魚，主要分布在東海和南海。2014年石斑魚捕撈量達113096噸、養(yǎng)殖量達88130噸，對于藍色農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要的作用。近年來隨著海水養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，這一名貴魚類品種在我國南北方開始大量養(yǎng)殖，苗種需求量上億尾；同時養(yǎng)殖企業(yè)對于優(yōu)良品種的需求進一步提高。目前國內外石斑魚養(yǎng)殖品種達10多個種，主要有青石斑魚(Epinephelus awoara)、云紋石斑魚(E.moara)、七帶石斑魚(E.septemfasciatus)、赤點石斑魚(E.akaara)、棕點石斑魚(E.fuscoguttatus)、褐石斑魚(E.bruneus)、鞍帶石斑魚(E.lanceolatus)等。但是石斑魚養(yǎng)殖苗種培育相當困難，而且純種養(yǎng)殖的生長速度也比較慢、產(chǎn)量低。一方面，由于石斑魚是一類雌雄同體、雌性先熟的魚類，只有當群體中某一雌性生長到最大個體時才有機會轉化為雄性，在同一生態(tài)群體中雄性數(shù)量相當少，在石斑魚的人工繁殖中很難獲得雄魚的精子，因此建立石斑魚精子冷凍庫尤其重要。另一方面，經(jīng)過多年的養(yǎng)殖及近親繁殖，石斑魚苗種成活率相當?shù)?，一般成活率只?0％左右，而且苗種畸形率高(可達70％以上)、病害多發(fā)，養(yǎng)殖種質退化現(xiàn)象嚴重，給產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展帶來諸多限制。因此培育生長快、畸形率低和成活率高的養(yǎng)殖新品種是產(chǎn)業(yè)發(fā)展急需解決的問題。

近年來國內外學者及養(yǎng)殖企業(yè)利用不同品種石斑魚之間雜交，試圖找到一個較好的雜交組合，培育出優(yōu)良的養(yǎng)殖苗種。例如地中海石斑魚(E.costae)(♀)×東大西洋石斑魚(E.marginatus)(♂)(Laboratory for Ecology and Aquaculture,Institute of Oceanography and Fisheries,Glamuzina B.etal,Aquaculture,2001)、棕點石斑魚(♀)×鞍帶石斑魚(♂)(廣東省大亞灣水產(chǎn)試驗中心，2010)、斜帶石斑魚(♀)×鞍帶石斑魚(♂)(中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，吳水清等，中國水產(chǎn)科學，2014)、云紋石斑魚(♀)×七帶石斑魚(♂)(中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，李炎璐等，漁業(yè)科學進展，2015)等石斑魚品種之間的雜交實驗，大多雜交組合由于畸形率高、成活率低，只能獲得少量的魚苗，無法培育大量苗種，只有棕點石斑魚(♀)×鞍帶石斑魚(♂)雜交能夠培育出大量的魚苗，也是目前石斑魚養(yǎng)殖的主要雜交品種“珍珠龍膽”，但是仍然存在苗種培育成活率低、有時畸形率可達90％以上的缺陷。主要原因是不同石斑魚種群之間存在著地理分布、生態(tài)條件、繁殖時間、遺傳差異等多方面的生殖隔離，利用現(xiàn)有技術條件難于篩選到有效的雜交組合。

鞍帶石斑魚，俗名龍膽，主要分布在東南亞、澳洲海域和我國的南海、臺灣附近海域。為暖水性、中下層珊瑚礁魚類，生長速度快，1齡魚可生長到1.5-3.0kg，2齡生長到5-6kg(楊洪志，現(xiàn)代漁業(yè)信息，2002)，最大可以成長至約2.7m，440kg，是石斑魚類中體型最大者，故稱為“斑王”。在中國產(chǎn)于南海(南沙群島)海域，但數(shù)量稀少(張海發(fā)等，廣東海洋大學學報，2008)，自然性成熟溫度26-30℃，人工繁殖技術還未完全突破，目前市場上還沒有大量養(yǎng)殖的苗種。云紋石斑魚，俗稱油斑，主要分布于日本、韓國和中國沿岸，屬于冷溫性魚類，繁殖溫度22-24℃，但具有適溫范圍廣(8-35℃)、適鹽范圍廣(10-40‰)、耐低氧、生長快、肉質鮮美等特點，是石斑魚養(yǎng)殖中較早開發(fā)的品種，于1981年日本栽培漁業(yè)協(xié)會開始了苗種培育研究(殷蕊等，河北漁業(yè)，2013)，但是苗種培育成活率低，畸形率高，畸形率可達70％以上，養(yǎng)殖商品魚的品質受到嚴重影響。

由于鞍帶石斑魚和云紋石斑魚在地理分布、適溫范圍、繁殖時間等方面具有較大的差異，在天然環(huán)境中無法實現(xiàn)種群間的雜交。即使在養(yǎng)殖環(huán)境中，由于鞍帶石斑魚性成熟晚，5－6齡、在體重達到20-30kg以上才能達到性成熟，雄性魚類極少，親魚難于培育，獲得足夠的親魚精液也比較困難。另外主要原因是鞍帶石斑魚與云紋石斑魚的繁殖時間和溫度不同，在無精子冷凍庫的條件下極大的限制了兩種魚類雜交育種和大量培育苗種的可能性。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一種鞍帶石斑魚精子冷凍庫建立方法和冷凍精子輔助石斑魚遠緣雜交育種方法，解決了石斑魚人工繁殖育苗中雄魚數(shù)量少、成熟不同步和精液量不足的問題，克服了因地理分布、繁殖時間、繁殖溫度等因素造成的石斑魚品種之間的生殖隔離，從而實現(xiàn)了石斑魚不同品種之間的遠緣雜交育種，培育出具有優(yōu)良生長性狀的石斑魚新品種。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術方案予以實現(xiàn)。

一種鞍帶石斑魚精子冷凍庫建立方法，其特征在于，步驟為：

(1)配制精子稀釋液：包括葡萄糖49.97g/L、NaCl 6.5g/L、NaHCO₃0.199g/L、KCl 0.14g/L、CaCl₂·2H₂O 0.12g/L、NaH₂PO₄0.0098g/L，溶解在蒸餾水中；

(2)配制精子冷凍保存液：在上述精子稀釋液中加入15％二甲基亞砜和10％小牛血清，均為體積百分數(shù)；

(3)精子冷凍保存：將鞍帶石斑魚精液與精子冷凍保存液以1:1的體積比混合，分裝后在液氮罐蒸氣中平衡，然后直接投入液氮中冷凍保存；

(4)精子冷凍庫建立：收集不同養(yǎng)殖群體和野生群體的鞍帶石斑魚精液，在液氮中冷凍保存，建立鞍帶石斑魚精子冷凍庫。

為了提高冷凍保存后精子的成活率，所述平衡溫度為-140℃，平衡時間為10min；所述冷凍保存溫度為-196℃。

本發(fā)明提供的一種石斑魚遠緣雜交育種方法，步驟為：

(1)以權利要求1或2所述方法建立鞍帶石斑魚精子冷凍庫；

(2)構建云紋石斑魚育種群體：收集野生或養(yǎng)殖云紋石斑魚，養(yǎng)殖群體中以5％的選擇強度篩選，對親魚生長性狀進行測量，并注射電子標記，采集DNA樣本，建立育種群體檔案，構建云紋石斑魚育種群體；

(3)培育云紋石斑魚親魚和生殖調控：親魚在工廠化流水培育池中培育，定時、定量投喂野雜魚；進入繁殖季節(jié)后，重新調整培育池的水溫及光照時間，在投喂飼料中添加維生素，培育2個月左右達到性成熟；

(4)對云紋石斑魚雌性親魚進行人工催產(chǎn)繁殖：選擇腹部膨大、發(fā)育良好的云紋石斑魚雌性親魚，注射催產(chǎn)激素，之后人工擠壓腹部采卵；

(5)冷凍精子受精和孵化：從鞍帶石斑魚精子冷凍庫中選取精子，在37℃水浴中解凍，將解凍精子與云紋石斑魚卵進行干法受精，分離上浮受精卵，放入網(wǎng)箱孵化；孵化到尾芽期后，收集上浮卵放入苗種池孵化和培育；

(6)苗種培育：利用微流水進行苗種培育，培育到40天左右魚苗完成變態(tài)發(fā)育，進入幼魚期。

為了建立了健康、無畸形的育種群體，所述步驟(2)中云紋石斑魚要求體形正常無畸形、體表無傷痕、體色為褐色或棕色，體側有六條暗棕色橫紋，體上具有云狀白色塊紋，體重在3.5kg以上，體長40cm以上的正常發(fā)育個體。

進一步的，所述步驟(3)中親魚培育時控制冬季水溫15-16℃，夏季水溫25-26℃，鹽度28-31‰，溶解氧≥10mg/L，光照度≤5000Lx，光照節(jié)律與自然光相同，晝夜水循環(huán)10-15次。

為了滿足云紋石斑魚親魚的最適產(chǎn)卵環(huán)境，所述步驟(3)中進入繁殖季節(jié)后，將培育池水溫逐漸提高到24℃，光照時間調整為14h，在投喂飼料中添加維生素C 5‰、維生素E3‰。

為了促進云紋石斑魚親魚的成熟，提高產(chǎn)卵量，所述步驟(4)中催產(chǎn)激素為絨毛膜促性腺激素HCG 200-300IU/kg和促排卵激素類似物LHRH-A3 5μg/kg的混合物，進行肌肉注射催產(chǎn)，催產(chǎn)后24h人工擠壓腹部采卵。

為了提高受精率，所述步驟(5)中干法受精過程是將解凍精子與云紋石斑魚卵以1:200的體積比混合，再加入2倍體積的海水后靜置4-6min；利用鹽度為35‰的海水漂洗，分離上浮受精卵，放入網(wǎng)箱孵化，海水溫度保持在24℃、鹽度30‰、溶解氧6-10mg/L，水流保持0.2m³/h。

進一步的，所述步驟(6)中苗種培育時水溫26-27℃，鹽度30‰，溶解氧(DO)≥10mg/L，pH 7.8-8.2；初期水流量0.3m³/h，20天后水流增大到2m³/h，30天后水流增大到3-5m³/h。

為了促進魚苗的快速生長，所述步驟(6)中苗種培育時，在水體中加入小球藻，密度為(5-10)×10⁵cells/mL；孵化后3-4天投喂輪蟲，投喂密度為8-15ind/mL，日投喂2次；10日齡后增加投喂鹵蟲無節(jié)幼體，投喂密度1-2ind/mL，日投喂2次，25日齡開始投喂配合飼料。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是：本發(fā)明中鞍帶石斑魚精子冷凍庫建立方法解決了石斑魚雜交育種和苗種培育中雄魚難于培育、數(shù)量少、成熟不同步和精液不足的問題，突破了不同品種石斑魚之間在地理分布、繁殖時間和溫度等方面的生殖隔離，使分布于不同環(huán)境、不同繁殖溫度和不同繁殖時間的石斑魚之間的遠緣雜交成為可能，拓展了石斑魚遠緣雜交育種的范圍，提高了雜交育種成功的概率。本發(fā)明中冷凍精子輔助石斑魚遠緣雜交育種方法，培育出了生長快、畸形率低的優(yōu)良雜交新品種，而且利用精子冷凍庫能夠大量培育優(yōu)良苗種，解決了目前石斑魚養(yǎng)殖中優(yōu)良苗種缺乏，以及目前石斑魚養(yǎng)殖苗種中生長慢、畸形率高的問題。

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發(fā)明的技術方案作進一步詳細說明。

本實施例提出了一種鞍帶石斑魚精子冷凍庫建立技術，首先收集和冷凍保存了大量的不同生態(tài)環(huán)境和養(yǎng)殖環(huán)境下的鞍帶石斑魚精子，建立了鞍帶石斑魚精子冷凍庫，保存了大量鞍帶石斑魚優(yōu)良種質，為石斑魚遠緣雜交育種創(chuàng)造了有利條件，可以在任何時間、任何地點進行多種石斑魚之間的雜交育種實驗，克服了不同石斑魚種群之間在地理、繁殖時間等方面的生殖隔離。

本實施例提供的鞍帶石斑魚精子冷凍庫建立方法，包括如下步驟：

(1)精子稀釋液(ELRS3)的配制：利用葡萄糖49.97g/L、NaCl 6.5g/L、NaHCO₃0.199g/L、KCl 0.14g/L、CaCl₂·2H₂O 0.12g/L、NaH₂PO₄0.0098g/L在蒸餾水中配制精子稀釋液ELRS3，所述精子稀釋液的滲透壓為400mOsm/L，pH值為7.03。

(2)精子冷凍保存液配制：在精子稀釋液ELRS3中加入15％二甲基亞砜(DMSO)和10％小牛血清(FBS)配制成精子冷凍保存液，均為體積百分數(shù)；

(3)精子冷凍保存：將鞍帶石斑魚精液與精子冷凍保存液以1:1的比例混合，分裝在2mL的塑料冷凍管中，在液氮罐蒸氣(-140℃)中平衡10min，然后直接投入液氮中(-196℃)冷凍保存；

(4)精子冷凍庫建立：收集不同時間、不同養(yǎng)殖群體和野生群體鞍帶石斑魚精液分別冷凍保存在60L生物液氮罐(-196℃)中，建立了多年代的鞍帶石斑魚精子冷凍庫，冷凍精子保存最長時間達到了6年。

本實施例首先研制了提高精子活力的精子稀釋液配方ELRS3，相比現(xiàn)有的精子稀釋液，本實施例可以提高冷凍保存精子的活力，精子活力達到76.69±2.36％以上，可以達到大量的收集和保存不同生態(tài)環(huán)境和繁殖時間的鞍帶石斑魚的精子目的。

在基于本實施例的精子稀釋液能夠提高冷凍精子活力，進而延長冷凍保存時間的基礎上，本實施例建立了鞍帶石斑魚精子冷凍庫，大量冷凍保存了不同年代(2011-2015年)、不同生態(tài)環(huán)境下的鞍帶石斑魚精子，為石斑魚苗種培育貯備了大量的精子資源，提高了精子受精率和利用率，同時為石斑魚不同品種之間的遠緣雜交創(chuàng)建了一個技術平臺，可以在雌性魚類成熟的任何季節(jié)，利用貯備的冷凍精子進行雜交育種，突破了不同品種石斑魚之間在地理分布、繁殖時間等方面的生殖隔離，使分布于不同環(huán)境、不同繁殖時間的石斑魚之間的遠緣雜交成為可能，拓展了石斑魚遠緣雜交育種的范圍，提高了雜交育種成功的概率。

在云紋石斑魚成熟季節(jié)利用本實施例建立的鞍帶石斑魚精子冷凍庫中的精子，進行雜交育種和大量苗種培育，克服了兩種石斑魚生殖隔離和精子資源不足的問題，同時克服了精子成活率低、受精率低、無法大量培育雜交苗種的問題；實現(xiàn)了鞍帶石斑魚和云紋石斑魚之間的遠緣雜交育種，大量培育出生長快、畸形率低的優(yōu)良雜交新品種，使鞍帶石斑魚精子冷凍庫得到了產(chǎn)業(yè)化應用，培育的雜交新品種在生產(chǎn)中獲得了大量推廣養(yǎng)殖。

本實施例利用上述鞍帶石斑魚精子冷凍庫，提出了一種石斑魚遠緣雜交育種方法，對鞍帶石斑魚冷凍精子和云紋石斑魚進行雜交實驗，利用鞍帶石斑魚具有生長快的優(yōu)良性狀，利用云紋石斑魚適溫、適鹽和耐低氧的抗逆性狀，以及云紋石斑魚人工繁殖和苗種培育技術較成熟的特點，篩選了一種優(yōu)良的石斑魚雜交組合：云紋石斑魚(♀)×鞍帶石斑魚(♂)，其雜交后代命名為“云龍斑”，具有生長快、畸形率低的優(yōu)良特性。

本實施例的冷凍精子輔助石斑魚遠緣雜交育種方法，包括如下步驟：

(1)以上述方法建立鞍帶石斑魚精子冷凍庫。

(2)構建云紋石斑魚育種群體：

收集野生或養(yǎng)殖云紋石斑魚，養(yǎng)殖群體中以5％的選擇強度篩選，均要求體形正常無畸形、體表無傷痕、體色為褐色或棕色，體側有六條暗棕色橫紋，體上具云狀白色塊紋，體重在3.5kg以上，體長40cm以上正常發(fā)育個體；對親魚生長性狀進行測量，并注射電子標記，采集DNA樣本，建立育種群體檔案，構建云紋石斑魚育種群體。

(3)云紋石斑魚親魚培育和生殖調控：

親魚在工廠化流水培育池中培育，冬季水溫15-16℃，夏季水溫25-26℃，鹽度28-31‰，溶解氧(DO)≥10mg/L，光照度≤5000Lx，光照節(jié)律與自然光相同，晝夜水循環(huán)10-15次。定時、定量投喂野雜魚，投喂量為魚體重的1-3％。所述野雜魚可以是鮐魚(Pneumatophorus japonicus)、太平洋柔魚(Todarodes pacificus)或玉筋魚(Ammodytes personatus)。

進入繁殖季節(jié)后，將培育池水溫逐漸提高到24℃，光照時間調整為14h，滿足云紋石斑魚的產(chǎn)卵要求，在投喂飼料中添加維生素C 5‰、維生素E3‰，增加營養(yǎng)，提高產(chǎn)卵質量，所述比例是占飼料質量的百分比，培育2個月左右達到性成熟。

(4)人工催產(chǎn)繁殖

選擇腹部膨大、發(fā)育良好的云紋石斑魚雌性親魚，利用催產(chǎn)激素進行肌肉注射催產(chǎn)，催產(chǎn)后24h人工擠壓腹部采卵。所述催產(chǎn)激素采用絨毛膜促性腺激素(HCG)200-300IU/kg和促排卵激素類似物(LHRH-A3)5μg/kg，能更加有效促進親魚的成熟，提高產(chǎn)卵量。

(5)冷凍精子受精和孵化

利用37℃水浴解凍鞍帶石斑魚精子，將解凍精子與云紋石斑魚卵以1:200的體積比進行干法受精，加入2倍體積的海水后靜置4-6min；利用鹽度為35‰的海水漂洗分離上浮受精卵，放入網(wǎng)箱孵化，海水溫度保持在24℃、鹽度30‰、溶解氧6-10mg/L，水流保持0.2m³/h。孵化到尾芽期后，收集上浮卵放入苗種池孵化和培育。

(6)苗種培育

利用微流水進行苗種培育，水溫26-27℃，鹽度30‰，溶解氧(DO)≥10mg/L，pH 7.8-8.2；初期水流量0.3m³/h，20天后水流增大到2m³/h，30天后增大到3-5m³/h；在水體中加入小球藻，密度保持在(5-10)×10⁵cells/mL，小球藻的作用一方面是用于改善水質，一方面是為輪蟲提供餌料；孵化后3-4天投喂輪蟲，投喂密度為8-15ind/mL，日投喂2次；10日齡后增加投喂鹵蟲無節(jié)幼體，投喂密度1-2ind/mL，日投喂2次，25日齡開始投喂配合飼料；培育到40天左右魚苗完成變態(tài)發(fā)育，進入幼魚期。

采用本實施例的冷凍精子輔助遠緣雜交育種方法，首先克服了鞍帶石斑魚和云紋石斑魚之間因地理分布、繁殖時間、繁殖溫度等因素造成的生殖隔離，實現(xiàn)了生態(tài)習性、繁殖習性差異較大的兩種石斑魚之間的遠緣雜交。其此冷凍精子庫克服了石斑魚群體中雄性數(shù)量少、成熟晚的缺點，為大量繁殖培育石斑魚雜交苗種提供了豐富的精子資源。另外精子冷凍庫的建立和應用為石斑魚人工繁殖提供了極其便利的條件，極大的降低的操作人員的工作強度，提高了勞動效率，降低了生產(chǎn)成本。另一方面，通過對云紋石斑魚的高強度篩選，建立了健康、無畸形的育種群體的；從而實現(xiàn)了利用鞍帶石斑魚冷凍精子與云紋石斑魚卵雜交大量培育出優(yōu)良雜交魚苗的目的，結合優(yōu)化的雜交育種方法，培育出的魚苗具有生長快、畸形率低、成活率高、體型修長、花色一致的特點，雜交魚苗兼具鞍帶石斑魚生長快、云紋石斑魚抗逆性強的優(yōu)良性狀；魚苗當年可生長到700g，最大可生長到1250g，相比國內目前養(yǎng)殖的雜交品種珍珠龍膽苗種(當年可生長到550g，最大生長到850g)具有更快的生長速度。

實施例1

1、鞍帶石斑魚精子冷凍庫建立

(1)精子稀釋液(ELRS3)的配制：利用葡萄糖49.97g/L、NaCl 6.5g/L、NaHCO₃0.199g/L、KCl 0.14g/L、CaCl₂·2H₂O 0.12g/L、NaH₂PO₄0.0098g/L，在蒸餾水中配制精子稀釋液ELRS3，其滲透壓為400mOsm/L，pH值為7.03。

(2)精子冷凍保存液配制：在精子稀釋液ELRS3中加入15％二甲基亞砜(DMSO)和10％小牛血清(FBS)配制成精子冷凍保存液，事先放置在4℃冰箱中備用，均為體積份數(shù)。

(3)精子冷凍保存：在鞍帶石斑魚性成熟季節(jié)(每年4-7月份)，在海南三亞陵水石斑魚養(yǎng)殖場和山東省萊州明波水產(chǎn)有限公司進行鞍帶石斑魚的精子冷凍保存，將達到性成熟的鞍帶石斑魚利用50ppm丁香酚麻醉，采用人工擠壓腹部法采集精子，將精子采集在100mL干燥的玻璃瓶中，放入事先準備好的冰盒中帶回實驗室，保證冰盒內的溫度為4-5℃。將鞍帶石斑魚精液與精子冷凍保存液以1:1的體積比混合，分裝在2mL的塑料冷凍管中，將裝入精液的冷凍管每10個分裝在紗布袋中，吊入液氮罐蒸氣(-140℃)中平衡10min，然后投入直接投入液氮中(-196℃)冷凍保存。

(4)精子冷凍庫建立：利用以上方法將不同養(yǎng)殖公司、不同時期的鞍帶石斑魚精液，建立不同養(yǎng)殖群體的鞍帶石斑魚精子冷凍庫，保存精子達到1380多份，精子活力達到76.69±2.36％。

表1鞍帶石斑魚冷凍精子庫信息

2、云紋石斑魚育種群體構建

2013-2016年相繼從福建東山島海域和養(yǎng)殖場收集野生云紋石斑魚900尾，體形正常無畸形、體表無傷痕、體色為褐色或棕色，體側有六條暗棕色橫紋，體上具云狀白色塊紋，運輸?shù)饺R州明波水產(chǎn)有限公司培育。2014年從萊州明波水產(chǎn)有限公司養(yǎng)殖云紋石斑魚商品魚群體中，以5％的選擇強度篩選無畸形、無疾病的云紋石斑魚個體900尾，集中在工廠化流水池中培育。2015年春季對收集和篩選的云紋石斑魚親魚生長性狀進行測量(表2)，親魚體重6.25±4.30kg，全長50.00±10.47cm。并逐個注射電子標記，標記號從5755至6934，同時采集DNA樣本保存在-80℃冰箱中，建立育種群體檔案，從而構建了云紋石斑魚育種群體。

表2云紋石斑魚生物學特征

3、云紋石斑魚親魚培育和生殖調控

將逐年收集和篩選的云紋石斑魚親魚1800尾左右，養(yǎng)殖在萊州明波水產(chǎn)有限公司，分別放在40m³的工廠化流水池中培育，每池放養(yǎng)量100尾，冬季水溫不低于15-16℃，夏季最高水溫在25-26℃，鹽度28-31‰，溶解氧(DO)≥10mg/L，pH 7.8-8.2，NH ₄⁺-N≤0.5mg/L，NO₂^－-N≤0.02mg/L，光照度≤5000Lx，平時的光照節(jié)律與自然光周期相同，晝夜水循環(huán)10-15次。每天定時、定量投喂野雜魚，主要為鮐魚、太平洋柔魚和玉筋魚，質量比為5:3:1，每次投喂量為魚體重的2％左右，每天投喂1次。

2016年2月初開始對云紋石斑魚進行生殖調控，將培育池水溫逐漸提高到24℃，光照時間逐漸調整延長到14h，水流保持在15-20m³/h，適當增加飼料投喂量到成魚體重的3％左右，在投喂飼料中添加維生素C 5‰、維生素E3‰。3月下旬到5月初部分親魚達到性成熟，雌魚腹部膨脹，個別親魚擠壓腹部有成熟卵流出，此時可以進行人工催產(chǎn)和繁殖。

4、人工催產(chǎn)繁殖

2016年3月29日開始對云紋石斑魚進行人工催產(chǎn)，從親魚池中挑選達到性成熟、腹部彭大、發(fā)育良好的雌性親魚，事先利用生理鹽水分別配制絨毛膜促性腺激素(HCG)和促排卵激素類似物(LHRH-A3)，按照絨毛膜促性腺激素(HCG)200-300IU/kg、促排卵激素類似物(LHRH-A3)5μg/kg的注射量，從胸鰭基部對親魚進行肌肉注射，注射后親魚利用網(wǎng)箱隔離培養(yǎng)，催產(chǎn)后24h人工擠壓腹部采卵，將成熟的卵子接入干燥的塑料盆中，等待利用冷凍保存的鞍帶石斑魚精子進行人工授精。

2016年3月29日－6月7日，共計人工催產(chǎn)9批次，催產(chǎn)親魚340尾，產(chǎn)卵75.363kg，親魚平均產(chǎn)卵量為204.25±98.33g。

表3 2016年云龍斑魚人工催產(chǎn)、受精和出苗情況統(tǒng)計

5、冷凍精子受精和孵化

將冷凍保存的鞍帶石斑魚精子從液氮罐中取出，在37℃水浴中邊搖動邊解凍，到精液開始流動為止；接著利用解凍的鞍帶石斑魚精液以精卵比1：200mL的比例干法受精，充分將精液與卵混合，加入2倍體積的24℃海水，靜置5min。之后受精卵利用鹽度為35‰的海水漂洗，利用絲網(wǎng)過濾分離上浮的受精卵，棄去下沉的死卵；將受精卵放入500L網(wǎng)箱中，海水溫度保持在24℃、鹽度30‰、溶解氧6-10mg/L，水流保持0.2m³/h進行孵化。在受精后6-7h，當胚胎發(fā)育到囊胚時統(tǒng)計受精率。在受精后28h，當胚胎發(fā)育到尾芽期，晶體形成后，收集上浮卵放入魚苗培育池中孵化和培育，同時采樣統(tǒng)計孵化率。

2016年利用冷凍保存的鞍帶石斑魚精液209份，共380mL，解凍后人工授精云紋石斑魚卵75363mL，平均受精率達到83.17±2.94％，孵化率達到27.69±8.28％，培育云龍斑雜交魚苗69.4萬尾。

6、苗種培育

將孵化到尾芽期、晶體形成的卵收集、稱量后，放入50m³的培育池中孵化，并進行苗種培育，每池布卵200-300mL，利用微流水進行苗種培育，初期水流量保持在0.3m³/h，孵化后20天增大水流到2m³/h，30天后增大到3-5m³/h。在放入受精卵前，事先將水溫調整至26-27℃，鹽度30‰，溶解氧(DO)≥10mg/L，pH 7.8-8.2。在培育池水體中加入小球藻，密度保持在(5-10)×10⁵cells/mL。孵化后3-4天投喂S型輪蟲，投喂密度為5-10ind/mL，7日齡開始投喂L型褶皺臂尾輪蟲，日投喂2次，投喂密度為8-15ind/mL。10日齡開始，增加投喂鹵蟲無節(jié)幼體，投喂密度1-2ind/mL，日投喂2次，25日齡開始進行投喂配合飼料。培育到40天左右魚苗完成變態(tài)發(fā)育，進入幼魚養(yǎng)殖期。

在云龍斑魚苗生長過程中對其生長性狀進行測量，并與目前國內養(yǎng)殖場廣泛養(yǎng)殖珍珠龍膽進行比較，云龍斑生長到127天時全長達16.19±0.78cm，體重達到76.73±9.15g；珍珠龍膽的全長和體重分別為12.21±0.57cm和33.29±4.15。生長到592天時云龍斑全長達到34.89±4.29cm，體重達702.94±247.39g；珍珠龍膽的全長和體重分別達到31.81±3.39cm和556.76±224.89g，云龍斑的生長速度明顯較珍珠龍膽快(表4)。

表4云龍斑生長性狀及與珍珠龍膽生長比較

云紋石斑魚苗種的畸形率相當高，可達70-90％以上，是多年來云紋石斑魚養(yǎng)殖中存在的主要問題，一直以來是限制云紋石斑魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要因素，嚴重的影響商品魚的品質。目前在國內大量養(yǎng)殖的珍珠龍膽是利用棕點石斑魚(♀)×鞍帶石斑魚(♂)雜交培育的雜交苗種，2016年春季在萊州明波水產(chǎn)有限公司培育的一批珍珠龍膽魚苗中畸形率達到80％以上，大部分表現(xiàn)為尾部短小、鰭條缺失現(xiàn)象，其它石斑魚的養(yǎng)殖中也存在著苗種畸形率高、病害多的現(xiàn)象，給石斑魚類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提出了嚴峻的課題，也是多年石斑魚養(yǎng)殖業(yè)中急需解決的主要問題。本實施例解決了上述問題，利用云紋石斑魚(♀)×鞍帶石斑魚(♂)雜交，并經(jīng)過優(yōu)化培育方法，得到的云龍斑魚苗中未發(fā)現(xiàn)有畸形魚苗，解決了石斑魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中魚苗畸形率高的問題。

以上實施例僅是本發(fā)明若干種優(yōu)選實施方式中的幾種，應當指出，本發(fā)明不限于上述實施例；對于本領域的普通技術人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發(fā)明所要求保護的技術方案的精神和范圍。