本發(fā)明涉及一種螞蟥室內(nèi)人工冬眠方法，屬于藥用動物養(yǎng)殖領(lǐng)域。
二、
背景技術(shù)：
螞蟥Whitmania pigra Whitman，又名寬體金線蛭，在動物分類學(xué)上隸屬于環(huán)節(jié)動物門黃蛭科，其干燥全體為中藥材水蛭，是2015版《中國藥典》藥材水蛭的主要基原動物，具有破血通經(jīng)，逐瘀消癥的作用，是通心絡(luò)膠囊、腦血康等眾多治療心腦血管疾病中成藥的主要原料。近年來隨著對螞蟥研究的不斷深入，其室外人工養(yǎng)殖方法已取得初步成功，供需矛盾有所緩解。
螞蟥是變溫動物，具有“冬眠”的習(xí)性，隨著外界溫度的降低，螞蟥會通過減少或停止自身活動及進食而逐漸進入冬眠狀態(tài)，以盡可能地降低自身新陳代謝和能量消耗，以利度過寒冷和冬季。但室外越冬時存在諸如水溫、光照、雷電、降雨等不可控因素，造成螞蟥種質(zhì)成活率降低，降低產(chǎn)量和經(jīng)濟效益。室內(nèi)越冬能有效控制螞蟥冬眠環(huán)境，提高種蛭成活率，提高養(yǎng)殖經(jīng)濟效益。
三、
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的在于提供一種操作簡便、螞蟥能量消耗低并且成活率高的室內(nèi)人工冬眠方法。
本發(fā)明選取健康螞蟥在清水中暫養(yǎng)兩天，不投食物，然后換曝氣24h的自來水，同時使其所處黑暗環(huán)境的溫度以1℃/12h或1℃/24h的速率降溫，到4℃時可看到螞蟥頭部和尾部彎曲，呈現(xiàn)“彎月”狀，說明螞蟥已進入冬眠狀態(tài)，維持環(huán)境溫度處于4℃狀態(tài)，期間及時換水保持養(yǎng)殖水質(zhì)干凈無渾濁。通過實驗統(tǒng)計和比較發(fā)現(xiàn)，在60d的冬眠過程中，螞蟥的體質(zhì)量與初始值無明顯差異，存活率可達100％，極顯著高于室外自然越冬存活率(約60％)。本發(fā)明操作簡便，在整個冬眠過程中螞蟥能量消耗低，體重減少極低率高且存活率高。采用本發(fā)明一方面能夠提高螞蟥自然越冬的死亡率，減少自然越冬期間的體重下降；另一方面在非越冬期間可以隨時讓螞蟥進入冬眠狀態(tài)，以供科研之用，也可以讓螞蟥避免極度高溫傷害；同時采用本發(fā)明可以有利于螞蟥的長途運輸。通過本發(fā)明可提高螞蟥種蛭越冬存活率，直接增加了螞蟥養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益。具不完全統(tǒng)計，與現(xiàn)有室外自然越冬相比，采用本發(fā)明，可提高種蛭畝產(chǎn)約274.5kg，水蛭藥材干品近40kg，按目前市場價1000元/kg計，每畝增加經(jīng)濟效益約4萬元。
四、具體實施方式
1.材料
1.1實驗材料及儀器：
螞蟥由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材研究所提供，經(jīng)郭巧生教授鑒定為螞蟥W.pigra。
MR200溶氧測量儀(南京特安科貿(mào)有限公司)、FYL-YS-108L低溫保存箱(北京福意電器有限公司)，呼吸儀(自制)，XHF-D內(nèi)切式勻漿機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，5810R離心機(Eppendorf公司)，Alpha-1506型紫外-可見分光光度計(上海譜元儀器有限公司)，F(xiàn)A 1104分析天平(上海精科天平)，ZD-2型自動電位滴定儀(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)。
2方法
2.1冬眠臨界溫度的確定
2.1.1耗氧量、耗氧率的測定
螞蟥于試驗前停食2d，每組隨機選取3條10g左右體格健壯的螞蟥(重復(fù)10次)，置于480mL注水2/3體積的廣口玻璃瓶中。試驗初始溫度為25℃，以1℃·d-1的速率降溫，分別于25，20，15，10，8，6，4，2℃穩(wěn)定1d后觀察記錄螞蟥在各溫度下的活動狀態(tài)，采用靜水法進行耗氧量、耗氧率，測定總時間為4h。在水流入呼吸室的過程中，使用溶氧儀在進水口處測定水中的溶氧量標記為DOt1(mg·L-1)；當水充滿后密閉呼吸室，準確計時4h后，測定出水中溶氧量標記為DOt2(mg·L-1)。
QC＝[(DOt1-DOt2)×V]·t-1·n-1，QR＝[(DOt1-DOt2)×V]·t-1W-1，QC為耗氧量(mg·h-1)，QR為耗氧率(mg·h-1·g-1)，/(L)為呼吸室中水的體積，W(g)為螞蟥質(zhì)量，n為螞蟥條數(shù)，t(h)為密封時間。
2.1.2消化酶的測定
與2.1的實驗設(shè)計相同，取各溫度狀態(tài)下螞蟥消化道，采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定淀粉酶活力，規(guī)定在37℃條件下，單位體積的酶量1min水解淀粉生成1mg還原糖的產(chǎn)量為1個淀粉酶活力單位；采用對-棕櫚酸硝基苯酯(ρ-NPP)比色法測定脂肪酶活力，規(guī)定在37℃條件下，1min催化釋放1μmol對硝基酚的酶量定義為1個酶活力單位；采用福林-酚法測定蛋白酶活力，規(guī)定每分鐘水解干酪素產(chǎn)生1μg酪氨酸定義為1個蛋白酶活力單位。組織勻漿液蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250比色法測定。
2.2冬眠生長性能的測定
確定螞蟥冬眠溫度后，分別稱量冬眠初始及冬眠60d體重，同時統(tǒng)計螞蟥存活率。計算特定生長率(SGR)和增重率(WGR)。SGR＝100×(lnWt-lnW0)/t；WGR(％)＝100×(Wt-W0)/W0，式中W0為實驗開始時螞蟥的平均質(zhì)量(g)，Wt為結(jié)束時螞蟥的平均質(zhì)量(g)，t為實驗天數(shù)(d)。
2.3統(tǒng)計方法
試驗所得數(shù)據(jù)先用Microsoft Excel作初步處理，然后采用SPSS 20.0軟件包(One-Way ANOVE，LSD)進行分析，P＜0.05為差異顯著。數(shù)據(jù)以表示。
3結(jié)果與分析
3.1不同溫度下螞蟥的活動狀態(tài)
25℃時，螞蟥活動極為活躍，尾部吸盤吸附于容器壁或者全體在水中“波浪式”游動；與25℃相比，20，15℃時螞蟥活躍程度都有所下降，15℃時可見部分螞蟥尾部吸盤吸附于容器壁呈“懸掛”靜止狀態(tài)，游動較少；10℃時，螞蟥身體收縮逐漸靜止于容器底部，無游動現(xiàn)象；4℃后，螞蟥頭部和尾部彎曲，呈現(xiàn)“彎月”狀，不食不動伏于瓶底。整個實驗過程無螞蟥死亡。
3.2不同溫度對螞蟥耗氧量、耗氧率的影響
不同溫度對螞蟥耗氧量、耗氧率的影響結(jié)果見表1。隨著溫度的降低，螞蟥的耗氧量、耗氧率逐漸下降。降溫至4℃前，除6℃與8℃組無顯著差異外，各溫度組之間均有顯著性差異(P＜0.05)，其中10℃前耗氧量、耗氧率降低趨勢最明顯，10℃后降低趨勢逐漸減緩，4℃和2℃已無變化。
表1不同溫度對螞蟥耗氧量、耗氧率的影響
注：同一列中不同字母表示組間存在顯著性差異(P＜0.05)，表2同。
3.3不同溫度對螞蟥消化道淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性的影響
不同溫度對螞蟥消化道淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性的影響結(jié)果見表2。隨著溫度的逐漸降低，螞蟥消化道酶活性均呈不同程度降低趨勢，與25℃相比各溫度組消化酶活性均顯著降低(P＜0.05)；10℃后，各酶活性降低趨勢漸緩，4℃時各消化酶活性最低，與10℃和8℃相比，均呈顯著性差異(P＜0.05)；4℃后各消化酶活性不再下降，基本保持穩(wěn)定。
表2不同溫度對螞蟥消化道淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性的影響
3.4冬眠對螞蟥生長性能的影響
冬眠對螞蟥生長性能的影響結(jié)果見表3。以4℃為冬眠溫度，60d的冬眠期間，螞蟥體重僅降低了8.54％，整個試驗期間無螞蟥個體死亡，即其存活率可高達100％。
表3冬眠對螞蟥生長性能的影響
3.5綜合評判
本實驗結(jié)果顯示，當溫度降低至4℃時，螞蟥不食不動，其耗氧指標與消化酶指標由降低趨勢逐漸穩(wěn)定不變，說明4℃為螞蟥冬眠的臨界溫度。此外，以4℃為冬眠溫度處理60天的螞蟥，體質(zhì)量與冬眠初始值無顯著差異，存活率高達100％(現(xiàn)有室外自然越冬種蛭存活率約為60％，體重減少約為30％)。與室外自然越冬相比，本發(fā)明方法可提高種蛭畝產(chǎn)約274.5kg，水蛭藥材干品39.2kg(折干率7∶1)，按目前市場價1000元/kg計，每畝增加經(jīng)濟效益約3.92萬元。
具體實施例1：
本發(fā)明選取10g左右健康螞蟥(Whitmania pigra Whitman)，按每平方米750尾密度將10公斤螞蟥放置在一個塑料容器里，于清水中暫養(yǎng)48h以排出糞便，換水后往容器注水約8cm深曝氣24h的自來水，在黑暗狀態(tài)下，用溫控裝置將水溫以1℃/12h或1℃/24h的速率降溫至4℃，使螞蟥進入冬眠狀態(tài)，冬眠過程中，根據(jù)所處水質(zhì)清濁狀態(tài)換水，保持水質(zhì)潔凈，每次換水100％，不投喂餌料，除控溫換水以外盡量減少和避免外界其他干擾刺激，以免打破其冬眠狀態(tài)，造成機體能量大量消耗及死亡風(fēng)險增加。
本發(fā)明闡述的實施例及權(quán)利要求并不是對本發(fā)明的限定，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)手段可以預(yù)見或者微調(diào)的變化均落入本發(fā)明保護范圍內(nèi)。