本發(fā)明涉及煙草種植技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種降低二氯喹啉酸致畸影響的煙草安全種植方法。

背景技術(shù)：

化學(xué)農(nóng)藥在農(nóng)作物病蟲(chóng)害防治，保障農(nóng)業(yè)豐收發(fā)揮了巨大作用，在農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化進(jìn)程中仍將繼續(xù)發(fā)揮重要作用。但是，在我們使用農(nóng)藥的過(guò)程中，如不能科學(xué)合理的使用，如超量施用、不對(duì)癥施用、亂混亂用，不僅達(dá)不到防治病蟲(chóng)草害的目的，反而對(duì)保護(hù)對(duì)象造成傷害，如出現(xiàn)藥害，農(nóng)作物不能正常生長(zhǎng)發(fā)育，嚴(yán)重的枯萎死亡。

廣東曾有煙葉產(chǎn)區(qū)因水稻田施用二氯喹啉酸防治雜草后，第二年種植煙草則出現(xiàn)生長(zhǎng)畸形，煙葉質(zhì)量明顯下降，造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響煙農(nóng)種煙的積極性，阻礙了煙區(qū)的穩(wěn)定和發(fā)展。針對(duì)該問(wèn)題，廣東省煙草公司聯(lián)合相關(guān)科研院所開(kāi)展了研究攻關(guān)，查明致畸原因是因土壤殘留二氯喹啉酸等除草劑致煙草畸形生長(zhǎng)。據(jù)初步估算，施用農(nóng)藥的利用率一般為10％，約90％殘留在環(huán)境中，殘留環(huán)境中的農(nóng)藥經(jīng)不同循環(huán)途徑，最終大多數(shù)殘留歸于土壤中。這些殘留土壤的農(nóng)藥經(jīng)生物的、物理的和化學(xué)的因素得于降解。其中以微生物的降解作用最為重要，其降解速度還與農(nóng)藥的種類、土壤水分含量和pH值有密切的關(guān)系。二氯喹啉酸殘留對(duì)后茬作物的藥害程度，同樣與其在土壤中的降解速率有關(guān)。

在煙草種植過(guò)程中，通常需要噴施殺菌劑防治白粉病、赤星病等病害，但目前并無(wú)煙田殺菌處理與二氯喹啉酸的降解速度之間影響關(guān)系的相關(guān)研究。因此進(jìn)一步提供一種適應(yīng)地域全面的降低二氯喹啉酸致畸影響的煙草安全種植方法對(duì)我國(guó)煙草種植具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)不同土壤條件下降低二氯喹啉酸致畸影響種植技術(shù)不足，提供一種降低二氯喹啉酸致畸影響的煙草安全種植方法。

本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

提供一種降低二氯喹啉酸致畸影響的煙草安全種植方法，是將施用過(guò)二氯喹啉酸的土壤不采用殺菌處理種植煙苗，或施用二氯喹啉酸48.6～66.7天后再對(duì)種植煙苗的土壤進(jìn)行殺菌處理。

優(yōu)選地，所述施用二氯喹啉酸48.6～66.7天后，經(jīng)檢測(cè)每千克土壤中的二氯喹啉酸殘留濃度不大于0.02mg/kg時(shí)再進(jìn)行煙苗種植。

優(yōu)選地，所述煙苗安全種植的間隔天數(shù)為246.00天以上。

優(yōu)選地，所述煙苗安全種植的間隔期范圍為246.00～385.28天。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明綜合研究了殺菌處理和二氯喹啉酸的施用之間的平衡關(guān)系，總結(jié)得到不同土壤處理?xiàng)l件下的二氯喹啉酸殘留降解規(guī)律，并總結(jié)出可安全種植煙苗的土壤條件、適合于安全種植煙苗的每千克土壤中的二氯喹啉酸最大殘留濃度以及安全種植煙苗的間隔時(shí)間，從而為合理使用二氯喹啉酸，避免對(duì)后茬敏感作物造成殘留藥害和確定種植時(shí)間提供科學(xué)依據(jù)。

附圖說(shuō)明

圖1二氯喹啉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

圖2二氯喹啉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(5μg/ml)色譜圖。

圖3二氯喹啉酸在南雄土壤中的消解曲線圖。

圖4二氯喹啉酸在鐵盧湖土壤中的消解曲線圖。

圖5二氯喹啉酸在遼寧阜新土壤中的消解曲線圖。

圖6二氯喹啉酸在云南楚雄土壤中的消解曲線圖。

圖7二氯喹啉酸在云南玉溪土壤中的消解曲線圖。

圖8二氯喹啉酸在云南紅河土壤中的消解曲線圖。

圖9二氯喹啉酸在財(cái)塘段土壤中的消解曲線圖。

圖10二氯喹啉酸在云南易門土壤中的消解曲線圖。

圖11二氯喹啉酸在梅州夫子段土壤中的消解曲線圖。

圖12二氯喹啉酸在梅州夫子段云南大理土壤中的消解曲線圖。

圖13二氯喹啉酸在湖北恩施土壤中的消解曲線圖。

圖14二氯喹啉酸在河南平頂山土壤中的消解曲線圖。

圖15二氯喹啉酸在貴州黔西南州中的消解曲線圖。

圖16二氯喹啉酸在財(cái)塘段水樣中的消解曲線圖。

圖17二氯喹啉酸在鐵盧湖水樣中的消解曲線圖。

圖18二氯喹啉酸在南雄水樣中的消解曲線圖。

圖19二氯喹啉酸在夫子段水樣中的消解曲線圖。

圖20二氯喹啉酸在遼寧阜新滅菌土壤中的消解曲線圖。

圖21二氯喹啉酸在云南玉溪滅菌土壤中的消解曲線圖。

圖22二氯喹啉酸在云南易門滅菌土壤中的消解曲線圖。

圖23遼寧土樣中微生物PLFAs分布圖。

圖24易門土樣中微生物PLFAs分布圖。

圖25玉溪土樣中微生物PLFAs分布圖。

圖26 3種土壤中細(xì)菌、真菌、放線菌特征性磷脂脂肪酸含量比較圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。下述實(shí)施例僅用于示例性說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。除非特別說(shuō)明，下述實(shí)施例中使用的試劑為常規(guī)市購(gòu)或商業(yè)途徑獲得的試劑，除非特別說(shuō)明，下述實(shí)施例中使用的方法和設(shè)備為本領(lǐng)域常規(guī)使用的方法和設(shè)備。

實(shí)施例1 為驗(yàn)證本發(fā)明技術(shù)方案的準(zhǔn)確性，本實(shí)施例以以下試驗(yàn)進(jìn)行說(shuō)明：

一、供試藥劑及儀器

1.主要儀器

1100HPLC(美國(guó)Agilent公司)；DHZ-D恒溫振蕩培養(yǎng)箱(國(guó)產(chǎn)，廣州深華生物技術(shù)有限公司)；DL-4000B冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；德國(guó)Sartorious電子天平BS 210S；PHS-3C精密pH計(jì)(上海雷磁儀器廠制造)；501數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇宏華儀器廠)；RE 52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；氣質(zhì)聯(lián)用儀(石英毛細(xì)管柱，氫火焰離子檢測(cè)器)；滅菌鍋；超凈工作臺(tái)；

LRH-300-Gb光照培養(yǎng)箱(廣東鑫騰科普儀器有限公司)；

2.主要試劑

99.5％二氯喹啉酸標(biāo)準(zhǔn)樣品(國(guó)家農(nóng)藥質(zhì)檢中心生產(chǎn)，廣東省農(nóng)科院農(nóng)化研究中心提供)。甲醇(一級(jí)色譜純)；乙酸(分析純)；四硼酸鈉(分析純)；正己烷(色譜純)；甲基丁基醚(色譜純)。

二、二氯喹啉酸在不同土樣及水樣中的殘留降解動(dòng)態(tài)分析

1.二氯喹啉酸添加處理

將99.5％二氯喹啉酸標(biāo)準(zhǔn)品按照推薦田間施用量0.65mg/kg均勻噴施于直徑為17cm、高13cm大小一致的花盆中的土壤，并充分?jǐn)嚢杈鶆?，放入溫室?nèi)并保持土壤濕潤(rùn)。設(shè)三個(gè)重復(fù)。分別于施藥前、施藥后1、2、6h及1、2、4、8、16、40、80、120、160d采集土樣，每盆取土樣50g，混勻后取其中50g土樣進(jìn)行殘留檢測(cè)前處理。水樣制備：將二氯喹啉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液按照0.65mg/L加入50mL水樣中，每個(gè)處理設(shè)三個(gè)重復(fù)。

2.土壤樣品前處理

0.05mol/L硼砂緩沖液50mL浸泡振蕩1h、高速離心20min(6000r/min)，取上清液過(guò)0.45μm濾膜，HPLC測(cè)定。

3.色譜分析條件

色譜柱：HP ODS Hypersil 5μm，4.0×250mm；流動(dòng)相：甲醇：1％乙酸水溶液(體積比為60/40)；流速：1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為：240nm；進(jìn)樣量：10μl。4.方法質(zhì)控措施

分析測(cè)定質(zhì)量控制與保證措施：①空白樣：每批分析樣需帶1個(gè)空白樣，以確認(rèn)試劑及容器的清潔程度；②平行樣：每批分析樣需帶2～3個(gè)平行樣(20％)，以確認(rèn)測(cè)試結(jié)果的再現(xiàn)性。

三、土壤中微生物對(duì)二氯喹啉酸殘留降解的影響

1.二氯喹啉酸在滅菌土壤中的降解動(dòng)態(tài)

土壤滅菌處理：向滅菌處理組土壤樣品中加入10mL 0.2％的氯化汞溶液進(jìn)行化學(xué)滅菌。

2.土壤磷脂脂肪酸(PLFAs)生物標(biāo)記分析法

取未滅菌土樣15g置于50mL離心管中，加入15mL0.2mol/L的KOH甲醇溶液，振蕩5min，并于37℃水浴溫浴1h，每10min振蕩1次，加入3mL1.0mol/L醋酸溶液中和pH值，充分搖勻。加入10mL正己烷，充分搖勻，800r/min下離心15min，取上層正己烷于玻璃試管中，吹氮?dú)馐谷軇]發(fā)。在玻璃試管中加入1mL體積比為1：1的正己烷：甲基丁基醚溶液，充分溶解3～5min，轉(zhuǎn)入GC小瓶，待測(cè)。

3.氣質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)條件

二階程序升高柱溫：170℃起始，5℃/min升至260℃，而后40℃/min升溫至310℃，維持90s；汽化室溫度250℃，檢測(cè)器溫度300℃，載氣為H₂(2mL/min)，尾吹氣為N₂(30mL/min)；柱前壓為68～95KPa，進(jìn)樣量1μl，進(jìn)樣分流比為100：1。

4.數(shù)據(jù)分析

以i15:0、a15:0、15:0、16:0、i16:0、16:1ω9、16:1ω7t、i17:0、a17:0、17:0、18:1ω7和cy19:0作為細(xì)菌的特征脂肪酸(齊鴻雁，2003)，18:1ω9c可作為真菌的特征脂肪酸。特征峰名為10Me 17:0的是放線菌PLFAs主要的生物標(biāo)記之一(Pankhurst,et al,2001)。PLFA1中的參考文獻(xiàn)革蘭氏陽(yáng)性菌與革蘭氏陰性菌之比(G+/G-)則通過(guò)i15:0、a15:0、i16:0及i17:0脂肪酸物質(zhì)的量之和與cy17:0、16:1ω9及cy19:0脂肪酸物質(zhì)的量之和的比值來(lái)估。

5.三種土壤中微生物數(shù)量分析

土壤細(xì)菌采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，土壤真菌采用孟加拉紅馬丁氏培養(yǎng)基，土壤放線菌采用高氏一號(hào)改良培養(yǎng)基。采用平板涂布法，每皿接種100μl，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)菌于37℃培養(yǎng)，真菌、放線菌于28℃培養(yǎng)。5天后觀察并計(jì)數(shù)。選出細(xì)菌和放線菌菌落數(shù)在20～400之間和真菌菌落數(shù)在10～100的培養(yǎng)皿計(jì)數(shù)。每克干樣品含菌數(shù)(cfu)＝菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)/樣品克數(shù)

五、不同土壤樣品煙草種植安全期的確定

將二氯喹啉酸藥液分別噴施于待處理的土壤中，使處理土壤中二氯喹啉酸的含量為5個(gè)濃度梯度：0.65mg/kg，0.33mg/kg，0.17mg/kg，0.085mg/kg，0.0425mg/kg，0.02mg/kg移栽入生長(zhǎng)狀況相似的健康煙苗，每天定期觀察煙苗的生長(zhǎng)情況，并記錄。

根據(jù)不同土壤樣品的二氯喹啉酸殘留消解公式，計(jì)算得到在二氯喹啉酸添加量為0.65mg/kg時(shí)，不同土壤樣品中的二氯喹啉酸消解到安全種植濃度的時(shí)間，即安全種植煙草的間隔期。

六、結(jié)果與分析

(一)標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、精密度和回收率

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品二氯喹啉酸，用甲醇配制一定濃度的二氯喹啉酸母液。再 用甲醇稀釋配制成質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1.0、5.0、25.0μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)液，在上述色譜操作條件下分別進(jìn)樣1μL，以濃度為x軸、峰面積為y軸繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。二氯喹啉酸在0.1～25μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為Y＝75.907x-5.0077，相關(guān)系數(shù)為0.9999。最小檢出量為1.0×10^-9g，在土壤中的最低檢出質(zhì)量濃度均為0.01mg/kg，樣品不同濃度加標(biāo)回收率在90.81％～93.27％之間(表1所示)，變異系數(shù)在2.8％～5.0％之間。表明本實(shí)施例采用的樣品提取。凈化方法的平均回收率和變異系數(shù)滿足殘留實(shí)驗(yàn)要求。

表1 二氯喹啉酸在土壤中的回收率和精密度

注：-代表樣品空白為未檢出；最低檢出質(zhì)量濃度為0.01mg/kg。

(二)氯喹啉酸在不同生態(tài)條件下的殘留降解動(dòng)態(tài)

二氯喹啉酸多種來(lái)源不同的供試土壤及水樣中的降解趨勢(shì)見(jiàn)圖3～19，二氯喹啉酸在供試土壤及水樣中的降解動(dòng)態(tài)基本上遵循一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，即：Ct＝C₀e^－kt，t_1/2＝ln2/k。表2中列出了隨機(jī)抽取的土壤樣品中二氯喹啉酸殘留消解方程的參數(shù)，在樣品中二氯喹啉酸的殘留量Ct與降解時(shí)間t之間的相關(guān)系數(shù)r均在0.87以上。樣品中二氯喹啉酸的半衰期范圍為48.6d～66.7d。

表2 二氯喹啉酸在土壤樣品中的殘留降解結(jié)果

(三)土壤微生物對(duì)二氯喹啉酸殘留降解的影響

1.二氯喹啉酸在滅菌土壤和未滅菌中的降解動(dòng)態(tài)

實(shí)驗(yàn)總結(jié)發(fā)現(xiàn)，沒(méi)有經(jīng)過(guò)殺菌處理的土壤樣品中二氯喹啉酸的降解速率高于滅菌處理的土壤樣品。二氯喹啉酸在滅菌和未滅菌處理土壤中的半衰期可見(jiàn)表3所示，二氯喹啉酸在滅菌土壤中的消解方程見(jiàn)圖20、圖21、圖22所示。

以遼寧阜新、云南易門、云南玉溪三種土壤為例說(shuō)明如下：二氯喹啉酸在滅菌與未滅菌兩種處理的土壤樣品中降解速率為：遼寧阜新(未滅菌，t1/2＝48.6d)>遼寧阜新(滅菌，t1/2＝610.27d)；云南易門(未滅菌，t1/2＝55.7d)> 云南易門(滅菌，t1/2＝616.76d)；云南玉溪(未滅菌，t1/2＝66.7d)>云南玉溪(滅菌，t1/2＝751.71d)?？梢?jiàn)，經(jīng)過(guò)滅菌處理的土壤樣品中二氯喹啉酸的降解速率高于未滅菌處理的土壤樣品。

表3 二氯喹啉酸在滅菌與未滅菌處理土壤中的半衰期及消解方程相關(guān)系數(shù)

2.三種土壤中微生物多樣性的磷脂脂肪酸(PLFAs)個(gè)數(shù)和相對(duì)含量

對(duì)3種土樣遼寧、易門、玉溪中的土壤微生物進(jìn)行磷脂脂肪酸生物標(biāo)記法分析，結(jié)果表明，3種土樣遼寧、易門、玉溪中土壤微生物PLFAs個(gè)數(shù):玉溪(12)＜遼寧(15)＝易門(15)。3種土樣中的土壤微生物PLFAs的相對(duì)含量：玉溪(73.33％)>遼寧(70.53％)>易門(70.18％)。

表4 三種土壤樣品中微生物PLFAs種類和相對(duì)含量

注：i、a、cy和Me分別表示異、反異、環(huán)丙基和甲基分枝脂肪酸；w、c和t分別表示脂肪酸端、順式空間構(gòu)造和反式空間構(gòu)造。

根據(jù)3種土壤樣品中微生物PLFAs種類和相對(duì)含量的結(jié)果，比較得出：細(xì)菌含量：遼寧阜新﹥?cè)颇弦组T﹥?cè)颇嫌裣?；真菌含量：云南玉溪﹥遼寧阜新﹥?cè)颇弦组T；放線菌含量：云南易門﹥遼寧阜新＝云南玉溪，其中遼寧阜新與云南玉溪放線菌含量為0。

3.三種土壤中可培養(yǎng)微生物數(shù)量分析

用平板稀釋法設(shè)定10^-3、10^-4、10^-5三個(gè)稀釋濃度梯度，測(cè)定遼寧阜新、云南玉溪、云南易門三種土壤樣品中的可培養(yǎng)微生物數(shù)量(即每克土壤樣品含菌量)，真菌含菌量：云南玉溪＞遼寧阜新＞云南易門；細(xì)菌含菌量：遼寧阜新＞易門＞云南玉溪；放線菌含菌量：云南易門＞遼寧阜新＞云南玉溪，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 三種土壤樣品的每克含菌數(shù)

4.土壤樣品煙草種植安全期的確定

多次試驗(yàn)總結(jié)發(fā)現(xiàn)，在煙苗移栽后第十天，觀察到0.65mg/kg、0.33mg/kg、0.17mg/kg、0.085mg/kg、0.0425mg/kg濃度處理的煙苗均出現(xiàn)不同程度的生長(zhǎng)畸形狀況，而0.02mg/kg濃度處理的煙苗并未出現(xiàn)生長(zhǎng)畸形現(xiàn)象，所以安全種植煙草的二氯喹啉酸殘留濃度為0.02mg/kg。

根據(jù)不同土壤樣品及4種水樣的二氯喹啉酸殘留消解公式計(jì)算分析大量試 驗(yàn)總結(jié)，二氯喹啉酸添加量為0.65mg/kg時(shí)，土壤土壤樣品及4種水樣施用二氯喹啉酸(0.65mg/kg)安全種植煙草的間隔期范圍為246.00～385.28d。

表6 不同來(lái)源土壤及灌溉水二氯喹啉酸殘留安全種植煙草的間隔期

綜合上述實(shí)驗(yàn)總結(jié)發(fā)現(xiàn)，沒(méi)有經(jīng)過(guò)滅菌處理的土壤樣品中二氯喹啉酸的降解速率高于滅菌處理的土壤樣品，土壤微生物對(duì)二氯喹啉酸的降解有明顯的影響。根據(jù)不同土壤樣品的二氯喹啉酸的半衰期，對(duì)其進(jìn)行土壤微生物分析，并隨機(jī)選取遼寧阜新、云南易門、云南玉溪3種土壤樣品作為代表說(shuō)明。二氯喹啉酸在3種土壤樣品中的降解速率：遼寧阜新﹥?cè)颇弦组T﹥?cè)颇嫌裣?；?種土樣中土壤微生物PLFAs個(gè)數(shù):玉溪(12)＜遼寧(14)＜易門(15)；土壤微生物PLFAs的相對(duì)含量:玉溪(73.33％)>遼寧(67.53％)>易門(65.11％)。未發(fā)現(xiàn)土壤微生物的種類與相對(duì)含量對(duì)二氯喹啉酸的降解有明顯的影響。

實(shí)施例2 殘留二氯喹啉酸的植煙土壤安全種植方法。

在煙苗移栽前采用色譜法或生物測(cè)定等方法，對(duì)植煙土壤中殘留的二氯喹 啉酸濃度進(jìn)行檢測(cè)，若檢測(cè)濃度不大于0.02mg/kg，則進(jìn)行煙苗移栽種植。在移栽后的第20天持續(xù)觀察煙株生長(zhǎng)情況，有必要的情況下，可對(duì)種植煙苗的土壤進(jìn)行常規(guī)的殺菌處理，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)煙葉畸形情況的發(fā)生。

若檢測(cè)濃度大于0.02mg/kg，則每隔48.6～66.7天再檢測(cè)一次二氯喹啉酸濃度，直至檢測(cè)到濃度不大于0.02mg/kg時(shí)再進(jìn)行煙苗移栽種植，期間不進(jìn)行殺菌處理。在移栽后的第20天持續(xù)觀察煙株生長(zhǎng)情況，有必要的情況下，可對(duì)種植煙苗的土壤進(jìn)行常規(guī)的殺菌處理，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)煙葉畸形情況的發(fā)生。

若檢測(cè)濃度大于0.02mg/kg而小于0.65mg/kg，則每隔48.6～66.7天再檢測(cè)一次二氯喹啉酸濃度，期間不進(jìn)行殺菌處理，在246天內(nèi)檢測(cè)到濃度不大于0.02mg/kg時(shí)再進(jìn)行煙苗移栽種植。在移栽后的第20天持續(xù)觀察煙株生長(zhǎng)情況，有必要的情況下，可對(duì)種植煙苗的土壤進(jìn)行常規(guī)的殺菌處理，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)煙葉畸形情況的發(fā)生。