本發(fā)明涉及植物多倍體培育技術領域，具體地，涉及一種四倍體石斛的培育方法。
背景技術：
石斛是一種草本蘭科植物，為傳統(tǒng)名貴中藥材，具有滋陰養(yǎng)胃，清熱生精、增強免疫力、抑制癌癥之功效。近年，隨著社會的發(fā)展，人們生活水平逐步提高，人們?nèi)找嬷匾暽钯|(zhì)量。然而，由于環(huán)境惡化，人們過度采挖，現(xiàn)有的二倍體石斛生長緩慢、成活率低，品質(zhì)難以保證，而人工種植投入高，農(nóng)戶種植積極性不高，使得石斛資源已瀕臨枯竭，國內(nèi)市場供需矛盾嚴重。
多倍體育種是植物新品種培育的重要手段，多倍體育種起源于20 世紀初，現(xiàn)已廣泛應用于植物培育。多倍體由于基因組倍性的增加，往往表現(xiàn)出形態(tài)上的巨大性和抗性增強等特點。植物多倍化后，其根、莖、葉等營養(yǎng)器官的變大，次生代謝物含量的提高，通過多倍體育種技術可大大提升鐵皮石斛的種植積極性，促進我國石斛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。 因此，培育四倍體鐵皮石斛，可以較大幅度地提高鐵皮石斛藥材產(chǎn)量。
專利200710061225.8報道了鐵皮石斛四倍體的培育方法，此法誘變率較高但存在一定的缺陷：育種周期長，從育種到產(chǎn)業(yè)化應用需五年以上；四倍體植株中嵌合四倍體的頻率較高，種質(zhì)難以保證；獲得植株少，限制產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
專利201210244240.7報道了一種大量繁育同源純合四倍體鐵皮石斛方法，此法雖產(chǎn)量高但存在一定的缺陷：原球莖需要多次續(xù)代培養(yǎng)，選出四倍體植株后仍需要續(xù)代3次，進行誘導分化再生四倍體植株，操作繁瑣；誘導時間長達72小時等問題。
技術實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種四倍體石斛簡單易行的培育方法。
本發(fā)明通過如下技術方案實現(xiàn)：提供一種四倍體石斛的培育方法，包括如下步驟：
（1）優(yōu)選出抗逆性好、生長快、莖稈粗、莖高長、分蘗多、纖維含量低、藥效成分含量高的不同產(chǎn)地的霍山石斛品種作為多倍體培育原植株親本；
（2）對不同品種原植株種子在固體培養(yǎng)基中進行無菌播種，獲得二倍體原球莖；
（3）將獲得的二倍體原球莖轉(zhuǎn)入含有150-200mg/L秋水仙堿的1/2MS液體培養(yǎng)基中于30℃下進行誘變處理12小時；
（4）將誘導完畢的外植體用無菌水沖洗干凈后，轉(zhuǎn)移到MS固體培養(yǎng)基上在光照下繼續(xù)培養(yǎng)直至成苗分化；
（5）四倍體的鑒定：移栽時，按株編號，取新生長的根尖，采用常規(guī)染色鏡檢辦法檢測染色體倍數(shù)，選取染色體數(shù)目2n=4x=76的幼苗，是加倍成功的四倍體；其他染色體數(shù)目的幼苗，為非整倍體，加倍不成功，不能使用；
（6）待植株長至3～5cm移栽進行正常管理栽培。
優(yōu)選地，步驟（2）所述培養(yǎng)為在固體培養(yǎng)基靜止培養(yǎng)，適合蘭科植物的不同培養(yǎng)基均可，首選MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為20-26℃，光照時間10-12小時，光照強度1500-3000lux，色溫在4000-5000K。
優(yōu)選地，步驟（3）所述1/2MS培養(yǎng)基中含有150-200mg/L秋水仙堿、0.5-1mg/L NAA（萘乙酸）、1-2mg/L 6-BA（6-芐基氨基嘌呤），且調(diào)節(jié)pH值為5.6±0.2。
優(yōu)選地，步驟（4）所述光照強度為1500-3000lux，色溫為4000-5000K，在光周期為16小時/天，培養(yǎng)溫度為20-26℃。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：
1、本發(fā)明采用石斛原球莖為材料進行四倍體誘變，不受季節(jié)氣候的影響，一次性可獲得上萬株四倍體石斛。
2、本發(fā)明簡單有效易行，縮短了傳統(tǒng)四倍體育種時間，四倍體鐵皮石斛的根、莖、葉、株高等都明顯大或高于原二倍體鐵皮石斛，大幅度地提高了鐵皮石斛的藥材產(chǎn)量，提高了鐵皮石斛的品質(zhì)和產(chǎn)量，另一方面為多倍體選種之用，使多倍體育種成為石斛遺傳改良、新品種培育的重要方法。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
品種A表示高緯度、高海拔地區(qū)的染色體核型指數(shù)為2n=38的霍山石斛品種，該品種具有抗逆性強、莖稈粗、藥效成分含量高的特點；品種B表示低緯度、低海拔地區(qū)的染色體核型指數(shù)為2n=38的霍山石斛品種，該品種具有生長速度快、莖高長、分蘗多、纖維含量低的特點。
實施例1
（1）將品種A和品種B的植株按常規(guī)方法種植栽培；
（2）對不同品種原植株種子在固體培養(yǎng)基中進行無菌播種，獲得品種A和品種B植株的二倍體原球莖，所述培養(yǎng)為在MS固體培養(yǎng)基上靜止培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為22℃，光照時間10小時，光照強度1500lux，色溫在4000K；
（3）將獲得的二倍體原球莖轉(zhuǎn)入含有200mg/L秋水仙堿、0.5mg/L NAA（萘乙酸）、1mg/L 6-BA（6-芐基氨基嘌呤），pH值為5.6±0.2的1/2MS液體培養(yǎng)基中于30℃下進行誘變處理12小時；
（4）將上述處理完畢的外植體用無菌水沖洗干凈后，轉(zhuǎn)移到MS固體培養(yǎng)基上在光照強度為1500lux，色溫為4000K，在光周期為16小時/天，培養(yǎng)溫度為22℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)直至成苗分化；
（5）四倍體的鑒定：移栽時，按株編號，取新生長的根尖，采用常規(guī)染色鏡檢辦法檢測染色體倍數(shù)，選取染色體數(shù)目2n=4x=76的幼苗，是加倍成功的四倍體；其他染色體數(shù)目的幼苗，為非整倍體，加倍不成功，不能使用；
（6）待植株長至3～5cm移栽進行正常管理栽培。
本實施例中四倍體成株后，四倍體植株根系更為發(fā)達、其平均莖粗是二倍體石斛的1.3倍，平均株高是二倍體石斛株高的1.5倍，其中總多糖含量較二倍體石斛高出3.1 %。
實施例2
（1）將品種A和品種B的植株按常規(guī)方法種植栽培；
（2）對不同品種原植株種子在固體培養(yǎng)基中進行無菌播種，獲得品種A和品種B植株的二倍體原球莖，所述培養(yǎng)為在MS固體培養(yǎng)基上靜止培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，光照時間12小時，光照強度3000lux，色溫在5000K；
（3）將獲得的二倍體原球莖轉(zhuǎn)入含有150mg/L秋水仙堿、、1mg/L NAA（萘乙酸）、2mg/L 6-BA（6-芐基氨基嘌呤），pH值為5.6±0.2的1/2MS液體培養(yǎng)基中于30℃下進行誘變處理12小時；
（4）將上述處理完畢的外植體用無菌水沖洗干凈后，轉(zhuǎn)移到MS固體培養(yǎng)基上在光照強度為3000lux，色溫為5000K，在光周期為16小時/天，培養(yǎng)溫度為25℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)直至成苗分化；
（5）四倍體的鑒定：移栽時，按株編號，取新生長的根尖，采用常規(guī)染色鏡檢辦法檢測染色體倍數(shù)，選取染色體數(shù)目2n=4x=76的幼苗，是加倍成功的四倍體；其他染色體數(shù)目的幼苗，為非整倍體，加倍不成功，不能使用；
（6）待植株長至3～5cm移栽進行正常管理栽培。
本實施例中四倍體成株后，四倍體植株根系更為發(fā)達、其平均莖粗是二倍體石斛的1.2倍，平均株高是二倍體石斛株高的1.4倍，其中總多糖含量較二倍體石斛高出2.9 %。
以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領域技術人員可以在權利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。